酯类抑制剂的制作方法

专利名称：酯类抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于某些敏感和不敏感的2-杂芳族链烷酸酯类氧化剂，它们可用作人白细胞弹性硬蛋白酶(HLE)或同意义的人中性细胞弹性硬蛋白酶(HNE)的抑制剂。
由于HLE或HNE似乎与多种人的疾病有关，因此近年来对于HLE或HNE抑制剂的研究尽了相当大的努力。试验表明，在HLE与肺气肿之间有明显的联系。例如见Sandberg等，The New England Journal of Medicine，304∶566(1981)。其他疾病和医学问题，如关节炎和有关的炎症、皮炎和局部缺血/再灌注损伤也与HLE有关。见Dinerman等，JACC，Vol.15，No.7，1559～63，1990年6月。因此，需要能有效抑制HLE或HNE的化合物。
涉及弹性硬蛋白酶抑制作用的具有代表性的先前工作已在专利文献，例如美国专利4，683，241和4，801，610中公开。
本发明的主要目的是提供某些用作为弹性硬蛋白酶抑制剂的新化合物。这些化合物的特征在于，它们具有较低的分子量并对HLE具有较高的选择性。因此，它们可用来预防、缓和或治疗由于HLE对结缔组织的降解作用所引起的哺乳动物(包括人)的疾病。
本发明化合物的结构可以用下述的式(Ⅰ)表示，
其中R1和R2可以相同或不同，它们可以选自以下一组基团氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、或者R1和R2一起代表亚甲基
，这里n为整数1-6，条件是R1和R2不都为氢;
Ar为任意取代的苯基;
Het为环中含有1个或多个N、S或O原子的杂环，在Ar(苯基)上任意的取代作用可以包括选自以下的1～5个取代基氢、卤素、硝基、-C(O)CH3、S(O)pR9，这里p为零、1或2，R9为羟基、-ONa或任意取代的C1-12烷基或任意取代的环烷基，包括例如用卤素取代的低级烷基(如三氟甲基)或带有羧基的低级烷基(特别是-CH2C(CH3)COOH)，但是，Ar(苯基)由-SCH3、-S(O)CH3或-S(O)2CH3取代较好。
Het最好是选自以下的一组基团呋喃基
苯并呋喃基
噻吩基
吡咯基
或苯并吡咯基
这里R3为氢或低级烷基。其它的杂环基包括例如苯并噻吩基、咪唑基、吡唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基等。
上述杂环本身可以例如被氢、卤素、C1-12的卤代烷基(如三氟甲基)、C1-12烷基、C3-7环烷基、C1-12烷氧基、C2-12链烯基、苯基、萘基或苄基取代。
应该认识到，当R1和R2不同时，上述取代基所连接的碳原子(即“α碳”)为手性中心，因此产生的化合物可以对映体纯的形式，或作为对应体的外消旋混合物形式存在。本发明包括该对应体混合物(+/-)及其各个对映体(+/-)。
本发明还包括所示化合物药学上可接受的无毒盐。
本发明特别好的化合物是下述式(Ⅰ)化合物，其中R1和R2中之一为氢，另一个为烷基，尤其是乙基;Ar为在-O-键的邻或对位被SCH3、S(O)CH3、S(O)2CH3或NO2取代的苯基，并且Het为呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基或吡咯基，它们通过杂环中O、S或N的邻或间位的环碳连接到式(Ⅰ)分子的其它部分。
本发明的另一特征是，现已发现修饰化合物以便消除α-碳位的手性中心，也就是使R1和R2为相同的，例如使R1和R2为甲基或乙基，或者使R1和R2组合为环烷基环(如环丙基、环丁基、环戊基或环己基)，那么该化合物用作人的中性细胞弹性硬蛋白酶抑制剂是特别好的。
再一方面，现已发现其中在Ar(苯基)的邻或对位有-SCH3取代基，或者在Ar(苯基)的对位有-S-CH2C(CH3)2COOH取代基，那么本发明的化合物是特别有效的。上述化合物在体内是经氧化能被活化的抑制剂，即-S-(硫醚)基在原位置上被氧化成亚砜-S-(O)-或砜-S(O)2-。关于这一点，现已发现其中Ar为由-S-(硫醚)、-S(O)-(亚砜)或-S(O)2-(砜)取代的化合物其效果按下述顺序增高-S-＜-S(O)-＜-S(O)2-因此很显然，-S-类化合物的效果可因存在于引起损伤的媒介HLE中的氧化剂而增加，形成相应的亚砜或砜。
以下述结构式作为举例说明，本发明具有代表性的化合物列于表Ⅰ。

本发明的产物可以由本技术领域的专业人员合适的和已知的方法进行制备。具有代表性的合成方法列于附

图1、2、3和4，它们分别包括反应方案A、反应方案A(续)、反应方案A(续)和反应方案B。
可以用三个一般的方法制备各种取代的酯。第一个方法是应用二烷基碳二亚胺，如二环己基碳二亚胺(DCC)，结果从羧酸起始原料得到初生的对称的酸酐。如在合成化合物(19)中所示，可以在加入酚类化合物之前使对称的酸酐生成;或者可以在原处在酚类化合物存在下使对称的酸酐生成，于是直接生成酯，如化合物(1)、(15)、(18)和(21)。另一酯化反应的方法是应用羧酸与草酰氯反应得到的酰氯。接着在碱(如三乙胺)存在下，使中间体酰氯与合适的酚反应，以高产率得到所需的酯。该方法可应用于合成噻吩类似物(7)、(10)、(11)和(14)及苯并呋喃衍生物(4)。最后，第三个方法是在二异丙基乙基胺(DIPEA)存在下使起始物羧酸与新戊酰氯反应，得到不对称的酸酐(例如(25)、(27)、(29)和(31))，接着加入4-甲磺酰基酚进行酰化，得到酯(3)、(6)、(17)和(23)。在合成化学的文献中还有另外的合成上述类型酯的方法。熟悉本技术领域的实际工作者对这些另外的方法是熟知的。
含有硫醚基的酯，如(1)、(4)、(7)、(11)、(15)、(19)和(21)可以在乙酸中用1.5相当量的过氧化氢进行氧化，生成相应的亚砜衍生物(2)、(5)、(8)、(12)、(16)、(20)和(22)。另外，在乙酸中用过量的过氧化氢处理24～48小时，可以将噻吩硫醚类化合物(7)和(11)转变为砜类化合物(9)和(13)。
按反应方案B所示，将相应取代的乙酸酯类化合物(36)和(39)进行烷基化，然后用碱进行水解，可以容易地得到2-取代的丁酸类化合物(24)、(26)、(28)、(30)、(32)和(34)。使酚与4-氯-3-氧丁酸乙基酯进行缩合，得到化合物(42)，将(42)用三乙胺进行环合并用对甲苯磺酸进行脱水，以高产率得到3-苯并呋喃乙酸酯(43)。合成上述前体另外的方法对熟悉本技术领域的专业人员是已知的。
给出以下实例，以便详细叙述本发明具体化合物的制备方法。
实例12-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲硫基苯基酯(15)的合成(A)2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸甲基酯在氮气流下配制二异丙基氨基锂(253mmol)在600ml无水THF中的溶液，并将该溶液冷却至-78℃。在搅拌下向其中滴加2-(1-甲基-2-吡咯)乙酸甲基酯(36.85g，241mmol)，然后加入32mlHMPA。将反应混合物搅拌30分钟，并于15分钟内滴入碘乙烷(19.2nl，241mmol)。移去冷却浴，将反应混合物温热至室温。2小时后向反应混合物中加入水以中止反应，并用乙醚萃取。合并的有机层用水洗涤，经无水MgSO4干燥并浓缩。将残余物真空蒸馏(0.14mm，80℃)，得到产物，为淡黄色油状物(37.0g，85%)。
1H NMR(CDCl3)δ0.961(t，3H，J＝7.4Hz)，1.80-1.95(m，1H)，2.05-2.20(m，1H)，3.53(t，1H，J＝7.65Hz)，3.59(s，3H)，3.67(s，3H)，6.05-6.10(m，2H)，6.55-6.56(m，1H);13C NMR(CDCl3)δ11.94，25.01，33.60，44.78，51.75，106.6，107.0，122.3，130.1，173.8.
(B)2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸将2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸甲基酯(37.0g，204mmol)和250ml2.5M NaOH水溶液的混合物加热回流3小时。反应混合物冷却至室温，酸化至PH＝1.0并用乙醚萃取。乙醚层经无水MgSO4干燥并浓缩，得到28.9g(87%)所需产物。
1H NMR(CDCl3)δ0.992(t，3H，J＝7.35Hz)，1.80-1.95(m，1H)，2.04-2.20(m，1H)，3.52(t，1H，J＝7.65Hz)，3.60(s，3H)，6.09-6.11(m，2H)，6.56-6.58(m，1H)，12.24(br s，1H，-OH);13C NMR(CDCL3)δ11.94，24.68，33.63，44.65，106.9，107.2，122.6，129.3，180.2。
(C)2-(甲基-2-吡咯)丁酸4-甲硫基苯基酯(15)在搅拌下向2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸(28.5g，176mmol)和4-甲硫基酚(23.7g，165mmol)的500ml无水二氯甲烷溶液中加入二环己基碳二亚胺(44.0g，216mmol)。16小时后加入乙酸(120ml)，溶液经过滤，滤液在真空下浓缩。将残余物溶于乙醚中，并用无水碳酸钾处理直到中性为止。过滤混合物，滤液用5%NaOH洗涤，经无水MgSO4干燥，并在真空下浓缩。将残余物真空蒸馏(0.7mm，185℃)，得到24.6g(49%)产物(15)。
1H NMR(CDCl3)δ1.06(t，3H，J＝7.5Hz)，1.88-2.03(m，1H)，2.15-2.30(m，1H)，2.45(s，3H)，3.66(s，3H)，3.74(t，1H，J＝7.65Hz)，6.10-6.18(m，2H)，6.59-6.62(m，1H)，6.95(d，2H，J＝8.40Hz)，7.24(d，2H，J＝8.40Hz);13C NMR(CDCl3)δ11.97，16.18，25.21，33.76，44.94，107.0，122.0，122.6，128.1，129.5，135.8，148.7，171.8.
实例22-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲亚磺酰基苯基酯(16)的合成在搅拌下向2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲硫基苯基酯(24.6g，86.5mmol)和120ml冰乙酸的混合物中加入过氧化氢(30%的溶液16.2ml)。1小时后加入120ml水，该混合物用乙醚萃取。有机层用水洗涤，经无水碳酸钾干燥过夜。溶液经过滤并浓缩，得到产物亚砜(16)，为白色固体。固体粗产物与乙醚一起研磨得到21.0g(81%)纯产物，为白色结晶。
1H NMR(CDCl3)δ1.07(t，3H，J＝7.5Hz)，2.90-2.05(m，1H)，2.16-2.31(m，1H)，2.16-2.31(m，1H)，2.70(s，3H)，3.67(s，3H)，3.78(t，1H，J＝7.50Hz)，6.11-6.18(m，2H)，6.59-6.61(m，1H)，7.20(d，2H，J＝8.70Hz)，7.63(d，2H，J＝8.70Hz);13C NMR(CDCl3)δ11.89，25.16，33.70，43.86，44.84，107.0，107.3，122.7(2X)，124.9，129.0，143.0，153.0，171.3.
实例32-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲磺酰基苯基酯(17)的合成向2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸(1.58g，9.5mmol)、二异丙基乙胺(1.23g，9.5mmol)和20ml二氯甲烷的溶液中加入三甲基乙酰氯(1.14g，9.5mmol)。搅拌1小时后，加入4-甲磺酰基酚(1.63g，9.5mmol)和二异丙基乙基胺(1.23g，9.5mmol)在15ml二氯甲烷中的溶液，反应混合物在室温下搅拌过夜。该反应混合物用水(4×20ml)洗涤，经无水MgSO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶快速层析(乙酸乙酯/己烷，1∶4)，得到1.30g(43%)产物(17)。
1H NMR(CDCL3)δ1.07(t，3H，J＝7.35Hz)，1.92-2.07(m，1H)，2.17-2.32(m，1H)，3.04(s，3H)，3.69(s，3H)，3.79(t，1H，J＝7.65Hz)，6.11-6.19(m，2H)，6.60-6.65(m，1H)，7.24(d，2H，J＝8.70Hz)，7.95(d，2H，J＝8.70Hz);13C NMR(CDCl3)δ11.90，25.21，33.75，44.42，44.89，107.2，107.4，122.6，122.8，128.8，129.3，138.0，155.1，172.0.
实例44-(2′-羧基-2′-甲基丙硫基)苯基2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸酯(19)的合成向2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸(1.74g，10.4mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶和20ml无水THF的溶液中加入二环己基碳二亚胺(1.05g，5.1mmol)。搅拌1小时后，加入2，2-二甲基-3-(4′-羟基苯硫基)丙酸(1.5g，5.1mmol)在无水THF中的溶液，将混合物搅拌过夜。浓缩该反应混合物，残余物溶于乙醚中并加入乙酸(2ml)。滤除副产物二环己脲，滤液用稀NaHCO3(3×20ml)洗涤。有机层经无水MgSO4干燥并浓缩。加入环己烷以除去残余的乙酸，蒸馏共沸混合物，得到0.64g(33%)酯(19)。
1H NMR(CDCl3)δ1.08(t，3H，J＝7.20Hz)，1.30(s，6H)，1.90-2.05(m，1H)，2.15-2.30(m，1H)，3.16(br s，2H)，3.67(s，3H)，3.75(t，1H，J＝7.50Hz)，6.10-6.17(m，2H)，6.60-6.65(m，1H)，6.95(d，2H，J＝8.40Hz)，7.39(d，2H，J＝8.40Hz)，10.6(br s，1H，-OH);13C NMR(CDCL3)δ12.01，24.35，25.23，33.80，43.76，45.02，52.78，107.0，107.3，122.1，122.7，129.4，131.7，134.4，149.7，171.7，182.9.
实例54-(2′羧基-2′-甲基丙亚磺酰基)苯基2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸酯(20)的合成在搅拌下向4-(2′-羧基-2′-甲基丙硫基)苯基2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸酯(0.51g，1.36mmol)和5ml冰乙酸的溶液中加入0.23ml30%过氧化氢。将反应混合物反应35分钟，并加入15ml水中止反应。所得溶液用乙醚萃取，分出有机层并经无水MgSO4干燥。蒸除溶剂得到0.44g(82%)产物。
1H NMR(CDCL3)δ1.07(t，3H，J＝7.35Hz)，1.43(s，3H)，1.53(s，3H)，1.90-2.05(m，1H)，2.15-2.30(m，1H)，3.0-3.15(m，2H)，3.67(s，3H)，3.77(t，1H，J＝7.65Hz)，6.10-6.20(m，2H)，6.60-6.62(m，1H)，7.20(d，2H，J＝8.40Hz)，7.71(d，2H，J＝8.70Hz)，10.6(br s，1H，-OH);13C NMR(CDCl3)δ11.99，24.68，25.24，25.64，33.81，41.73，44.90，68.81，107.1，107.3，122.8(2X)，125.6，129.1，144.4，153.1，171.4，180.2.
实例62-(3-噻吩)丁酸4-甲硫基苯基酯(11)的合成向2-(3-噻吩)丁酸(3.90g，22.9mmol)和25ml无水二氯甲烷的溶液中加入草酰氯(2.0M溶液13.7ml，27.4mmol)，将所得的反应混合物搅拌3小时。在真空下蒸除挥发性物质，残余物溶于足够量的二氯甲烷中，得到0.33M酰氯溶液。将该酰氯溶液(45.5ml，15mmol)加到4-甲硫基酚(1.80g，15mmol)、三乙胺(1.52g，15mmol)和15ml无水二氯甲烷的混合物中。搅拌过夜后滤除析出的固体，滤液用1M Na2CO3洗涤。浓缩有机层，残余物经硅胶层析分离，得到产物2.55g(72%)。
1H NMR(CDCL3)δ1.05(t，3H，J＝7.23Hz)，1.89-2.04(m，1H，2.15-2.30(m，1H)，2.48(s，3H)，3.87(t，1H，J＝7.70Hz)，6.99(d，2H，J＝8.49Hz)，7.18(d，1H，J＝4.98Hz)，7.27(d，1H，J＝2.58Hz)，7.38(d，2H，J＝2.58Hz)，7.38(d，2H，J＝8.67Hz)，7.35(dd，1H，J＝2.58Hz，J＝4.95Hz);13C NMR(CDCL3)δ11.78，16.19，26.47，48.64，122.0，122.2，126.0，127.2，128.1，135.8，138.8，148.7，172.4.
实例72-(3-噻吩)丁酸4-甲亚磺酰基苯基酯(12)的合成在搅拌下向2-(3-噻吩)丁酸4-甲硫基苯基酯(0.80g，2.7mmol)和8ml冰乙酸的溶液中加入过氧化氢(30%的溶液9.048ml，4.1mmol)。1小时后加入乙醚，所得溶液依次用水(3×15ml)和饱和NaHCO3(3×15ml)洗涤。有机层经无水K2CO3干燥并蒸发，得到0.69g(83%)所需产物亚砜(12)。
1H NMR(CDCl3)δ1.02(t，3H，J＝7.38Hz)，1.90-2.05(m，1H)，2.14-2.29(m，1H)，2.71(s，3H)，3.88(t，1H，J＝7.62Hz)，7.15(d，1H，J＝4.92Hz)，7.21(d，2H，J＝8.61Hz)，7.25(d，1H，J＝3.06Hz)，7.35(dd，1H，J＝4.95Hz)，7.65(d，2H，J＝8.64Hz;13C NMR(CDCL3)δ11.77，26.38，43.93，48.93，48.63，122.7，125.0，126.2，127.1，138.4，143.1，153.0，172.1.
实例81-(3-噻吩)丁酸4-甲磺酰基苯基酯(13)的合成将2-(3-噻吩)丁酸4-甲硫基苯基酯(0.90g，3.0mmol)、冰乙酸(3ml)和30%过氧化氢(3ml)的混合物放在一起搅拌3天。将反应混合物倒入碎冰中并用乙醚萃取。有机层用水洗涤，经无水K2CO3干燥并浓缩，得到0.21g(21%)磺酰基衍生物(13)。
1H NMR(CDCl3)δ1.02(t，3H，J＝7.35Hz)，1.88-2.03(m，1H)，2.16-2.31(m，1H)，3.04(s，3H)，3.90(t，1H，J＝7.68Hz)，7.15(d，1H，J＝5.01Hz)，7.22-7.27(m，1H)，7.25(d，2H，J＝8.55Hz)，7.96(d，2H，J＝8.67Hz);13C NMR(CDCL3)δ11.68，26.25，44.33，48.51，122.4，122.6，126.3，127.0，129.2，138.0，154.9，171.7.
如以上所述，本发明化合物具有抑制HLE的作用，这表明本发明化合物可用于治疗受试者下述疾病，例如肺气肿、关节炎、动脉硬化等。“受试者”是指包括人在内的哺乳动物。为了上述用途，可以将本发明化合物通过常用的途径，例如口服、静脉注射、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射的方式给药。对于肺气肿，通常以口服或直肠给药的方式，或以支气管吸入的喷雾剂方式给予治疗上有效剂量的本发明化合物。
由于所治疗的疾病性质和严重程度不同，用于抑制HLE的本发明化合物的剂量可以改变。例如治疗肺气肿，可以给予含有0.05～20%有效化合物的喷雾剂，每剂量单位为2～100mg;一天给予数次，这样就提供了治疗上有效的剂量。改变和调整给药的剂量和次数，以便得到所需要的HLE抑制作用。
含有本发明活性化合物的药用组合物包括与常用的无毒的药用载体一起配制的片剂、胶囊剂、溶液剂或悬浮液剂。上述组合物可以含有常用类型的添加剂，例如崩解剂或悬浮剂等。选作为静脉注射用的化合物应该在水溶液中是可溶解的，而用于口服剂型的化合物无需是水可溶解的。局部用药制剂还用于治疗例如皮炎和痤疮。
本发明化合物是非常有效和具有良好选择性的中性细胞弹性硬蛋白酶的抑制剂。本发明化合物似乎还具有合适的血清稳定性。本发明化合物的水溶解度是可以改变的，很显然，各个化合物服用的基本方式将根据(至少在一定程度上)化合物的溶解度而定。
如果不限于运行或机能的理论，那么看来好象本发明化合物与中性细胞弹性硬蛋白酶的作用部位结合。更具体地说，似乎是酰基与底物(S)位置结合，即缬氨酸或脯氨酸-缬氨酸结合区域与酚基延伸到S’位置。
用以下试验测定本发明化合物的活性效果(测定I50)试剂A)0.075M磷酸钠，20%二甲亚砜(DMSO)，PH7.7＝底物和抑制剂的缓冲液。
B)0.075M磷酸钠，无DMSO，PH7.7＝抑制剂缓冲液。
C)10mM人体中性细胞弹性硬蛋白酶(HNE)底物＝N-甲氧基琥珀酰-ala-ala-pro-val-pNA的DMSO溶液。
D)0.1M乙酸钠，20%DMSO，PH5.5＝酶缓冲液(稀释)。
E)0.01M乙酸钠，PH 5.5＝酶缓冲液(储备)。
F)HNE(1mg)溶于1ml试剂E中，并于-20℃储存。
配制10mM抑制剂的DMSO储备液。将等分试样(10μL)置于试剂A中并稀释至1.0ml(100μM)。再用试剂A将100μL 100μM储备液连续稀释至10.1、1.0、0.1、0.01μM。用100μL稀释液滴入96孔板的孔内。将试剂F的等分试样用试剂D按1∶150进行稀释，用50μL等分试剂加到所示的孔内并于室温保温7分钟。
将100μL试剂C加到500μL试剂A和400μL试剂B中，制得HNE底物溶液。保温7分钟后将底物溶液(50μL)加入各个孔内。然后用分光光度法于405nm处用ELISA印版指示器(UVMAX，Molecular Devices)(该指示器用单板动力学程序处理原始数据)监测HNE催化反应。以酶活性对不同的抑制剂浓度制图，用曲线拟合法软件程序测定I50值。经“筛选”得到近似的I50后，通过检验在该值附近的抑制剂浓度可以得到精确的I50值。
特性测定试剂1)1mg/ml猪胰弹性硬蛋白酶(PPE)的0.01M乙酸钠溶液，PH5.5。将该储备液的等分试样用0.01M乙酸钠、20%DMSO、10mM CaCl2(PH5.5)按1∶20进行稀释。
2)1mg/mlα-胰凝乳蛋白酶(α-CH)的0.01M乙酸钠溶液，PH5.5。将该储备液的等分试样用0.01M乙酸钠、20%DMSO、10mMCaCl2(PH5.5)、0.05%tritonX-100(聚乙二醇辛基苯甲醚)表面活性剂按1∶85进行稀释。
3)PPE底物20mM N-琥珀酰-ala-ala-ala-PNA的DMSO储备液。
4)α-CH底物20mM N-琥珀酰-ala-ala-pro-leu-PNA的DMSO储备液。
5)抑制剂、底物缓冲液0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.01M CaCl2，0.005% triton X-100(聚乙二醇辛基苯甲醚)，20% DMSO的溶液，PH7.7。
K以看出，在各比较实例中其中R4为-SCH3的本发明化合物明显地具有较高的I50值。
用狗进行试验，以研究本发明化合物在治疗局部缺血再灌注损伤中的作用。这些试验表明，用本发明所述的化合物16治疗动物的梗塞时，梗塞范围与对照组相比明显地减小。
参考先前的内容，用于本实验中的试验方案包括以下内容给雄性杂种狗(13～17kg)按30mg/kg静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉，插管，并通过Harvard呼吸器与气室换气。整个试验过程连续地用Ⅱ导程心电图和血流动力学进行监测。将导管插入左侧颈动脉并推进到左心室，以连续记录左心室的压力。将另一条导管插入右股动脉以测量动脉血压。在第五肋间进行左胸廊切开，将心脏悬挂在心包托架上，分离左侧卷曲的冠状动脉(LCX)，远侧至其前房支管，近侧至任何较大的心室支管。将电磁流量探针置于动脉上以测定基部LCX血流量。最初，结扎到不使静止流改变的程度，从而使LCX部分收缩，但峰流增加(反应性充血反应)，在10秒钟后完全闭塞至少降低70%(临界狭窄)。部分收缩15分钟后，第二次结扎使LCX完全闭塞。保持完全闭塞90分钟，随后以临界狭窄进行24小时再灌注代替最初30分钟再灌注。临界狭窄限制了再灌注心律不齐的严重性、出血性心肌梗塞的程度和心室纤维性颤动的可能性。对于局部灌注的恢复，移去动脉、静脉和前房的插管，胸廊切开的切口用膜盖住，包扎伤口，使动物恢复到手术后恢复条件。再灌注24小时后，再次将动物麻醉，打开胸廊切开的切口，用电使心脏原纤维化，并迅速取出以检查定量梗塞的范围。
动物经插入左侧卷曲的冠状动脉导管进行冠内输注给药，随机给予试验化合物或空白对照剂(稀释液)，所述冠状动脉远离脉管的闭塞点。根据已知的药代动力学资料决定剂量，在90分钟局部缺血期间和24小时再灌注期间保持输注。在左侧卷曲的冠状动脉闭塞之前开始的60分钟输入试验化合物或空白对照剂。
按标准的抽取方法，用示踪剂标记的微小球体(直径15μm)测定局部心肌血流。在每次实验中，二次注入用随机数量级同位素标记的微小球体。同时在微小球体注入左心房之前立即开始用Harvard抽取泵以恒定速度从股动脉和颈动脉抽取参照动脉血样，并且在2分钟之后结束。将参照血样量平均，以便计算心肌血流。如果参照血样量变化大于15%，那么将该数据废弃。在注入之前将各瓶微小球体置于超声浴中并不断用旋涡搅动，以保证在注入微小球体悬浮液之前使其适当分散。
在左侧卷曲的冠状动脉再灌注之前10分钟测定局部心肌血流。在结束该研究之前10分钟(再灌注之后5小时50分钟)第二次测定局部心肌血流。从心脏的心窝下、心肌中段和心内膜下区域切下重0.5～1.0g的组织标本，上述区域是通过左侧卷曲的冠状动脉和左侧前下行的冠状动脉(它们分别代表危险的心肌区域和不涉及心肌的区域)进行灌注的。每个心脏至少用三个截面，以便每次试验使每个区域的血流代表3～4个样本的平均数。
用体内的二重灌注染色技术测定心肌梗塞的范围。将插管插入冠状口上部的主动脉内和插入在上述闭塞位置的LCX内。用1.5%三苯基四唑化氯(TTC)的20mM磷酸钾脉冲液(pH7、4，38℃)注入LCX床。以逆行的方式将0.25%依文蓝染料注入主动脉。以100mmHg恒定的压力用染色液分别注入LCX区域和心脏的其他区域10分钟。将心脏切成6个相同的与顶点基础中轴相垂直的厚约1.0Cm的截面。染色技术清楚地表明了左心室形成梗塞危险的面积和该危险面积内梗塞的心肌，这不是LCX血流的结果，这是用依文蓝染料色的结果。由于通过组织脱氢酶的作用使无色的TTC转变为红色的甲沉淀物，因此危险区域内有活力的心肌被染成红色。由于不可逆的受损伤的组织丧失了脱氢酶，因此在危险区域内梗塞的心肌仍然未被染色。横的心室切面被右心室肌和瓣与脂肪组织修整，然后在平整的具有弹性的高嵌物上测量梗塞范围。梗塞的范围以危险面积的百分比表示，并可以总的左侧心室的百分比表示。
所有得到的数据以平均数±SEM表示。如果需要，应用配对或组群试验分析法。P≤0.05，认为差别是明显的。如果在多于二个平均数之间进行比较(梗塞/危险面积，梗塞/左心室，危险面积/左心室)，那么可通过方差分析和Scheffe多重比较置信区间将数据进行比较。
危险的心肌面积和侧面血流对局部缺血性心肌坏死的程度具有重要的决定性因素。梗塞范围与在局部缺血中心区域的内部三分之二处测得的侧面血流有关。进行协方差分析，其目的是如果侧面血流的影响被控制(其中侧面血流为自变量)，确定两组之间计算的梗塞范围在统计学上是否有显著的差异。
每个类别用10只狗进行试验，用数字表示梗塞范围，得到的平均结果如下。
空白对照剂化合物号1652.79+SEM4.9 40.59+SEM4.2如以上所述，上述结果表明，通过应用本发明的化合物可使梗塞范围明显地减小。
在不离开下述权利要求所确定的实质内容和范围下，本发明可以进行各种变化。
权利要求
1.抑制不需要的弹性硬蛋白酶活性的药用组合物，该组合物包括有效量的式
(其中R1和R2可以相同或不同，它们可以选自以下一组基团氢、C1-4烷基、C3-6环烷基，或者R1和R2一起代表亚甲基-(-CH-)n-，这里n为整数1-6，条件是R1和R2不都为氢；Ar为任意取代的苯基；Het为环中含有1个或多个N、S或O原子的杂环)的活性化合物和药物上常用的无毒载体。
2.权利要求1的药用组合物，其中所说的活性化合物的Het基是式
的五元杂环(式中X为N、O或S)或者相应的苯并杂环。
3.权利要求2的药用组合物，其中活性化合物的环为吡咯基或苯并吡咯基环。
4.权利要求1的药用组合物，其中的活性化合物是2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲硫基苯基酯，2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲亚磺酰基苯基酯或2-(1-甲基-2-吡咯)丁酸4-甲磺酸基苯基酯。
5.按照权利要求1所述的化合物，其中R1为氢，R2为乙基，Ar为带有SCH3、S(O)CH3、S(O)2CH3或NO2取代基的苯基，Het为呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吡咯基、苯并吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、吡啶基或嘧啶基。
6.一种制备药用组合物的方法，该方法包括将有效量的式
活性化合物(式中R1和R2可以相同或不相同，为选自包括氢、1-4碳原子的烷基、3-6碳原子的环烷基，或R1和R2共同代表
的亚甲基，其中n为1-6的整数，条件是R1和R2不都为氢;Ar为任意取代的苯基;Het为环中含有一个或多个N、S或O原子的杂环)和药物上可接受的无毒载体相混合。
7.权利要求5所述的方法，其中式
(式中R1和R2可以相同或不同，它们可以选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基，或者R1和R2一起代表亚甲基
，这里n为整数1-6，条件是R1和R2不都为氢;Ar为任意取代的苯基;Het为环中含有1个或多个N、S或O原子的杂环)的活性化合物的制备是使下式的羧酸与DCC反应，
得到对称的酸酐，再将该对称的酸酐与带有1-5个选自以下的取代基任意取代的酚反应，得到酯，酚的取代基系选自氢、卤素、硝基、-C(O)CH3、S(O)PR9。这里p为零、1或2，R9为羟基、-ONa或任意取代的C1-12烷基或任意取代的环烷基或带有羧基的低级烷基，
并且当Ar被硫醚基取代时，如果需要，可以在乙酸中用过氧化氢使硫醚进行氧化，得到亚砜衍生物。
8.权利要求6所述的方法，其中所用的羧酸中的Het为吡咯基或苯并吡咯基环。
9.权利要求6所述的方法，其中所用的原料是R1为氢、R1为乙基、Het为1-甲基-2-吡咯基的羧酸和甲硫基苯酚，或者为R1为氢、R2为乙基、Het为1-甲基-2-吡咯基的羧酸和甲基亚磺酰基苯酚。
10.权利要求5所述的方法，其中式
(其中R1和R2可以相同或不同它们可以选自以下一组基团氢、C1-4烷基、C3-6环烷基，或者R1和R2一起代表亚甲基
，这里n为整数1-6，条件是R1和R2不都为氢;Ar′为至少有1个S(O)PR9任意取代的苯基，这里p为2，R9为羟基、-ONa或任意取代的C1-12烷基或任意取代的环烷基或带有羧基的低级烷基;Het为环中含有1个或多个N、S或O原子的杂环)的制备包括在DIPA存在下使下式的羧酸与新戊酰氯反应，
接着加入带有1-5个选自以下的取代基任意取代的酚，酚的取代基系选自氢、卤素、硝基、-C(O)CH3、S(O)PR9，这里p为零、1或2，R为羟基、-ONa或任意取代的C1-12烷基或任意取代的环烷基或带有羧基的低级烷基，条件是该酚至少有1个S(O)PR9取代基，这里p为2。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的羧酸是Het为吡咯基或苯并吡咯基环的羧酸。
12.权利要求10所述的方法，其中的原料是R为氢、R为乙基、Het为1-甲基-2-吡咯基的羧酸;A′为甲基磺酰基苯基。
13.抑制不需要的弹性硬蛋白酶活性的方法，该方法包括给需要的受式者服用权利要求1所述的组合物。
14.应用权利要求1所述的组合物抑制人白细胞弹性硬蛋白酶或人中性细胞弹性硬蛋白酶。
15.应用权利要求1所述的组合物治疗肺气肿、炎症、皮炎或局部缺血/再灌注损伤。
全文摘要
2-杂芳族链烷酸酯类，该类化合物可用作为人白细胞或中性细胞弹性硬蛋白酶的抑制剂。
文档编号A61K31/405GK1061152SQ9111050
公开日1992年5月20日 申请日期1991年11月6日 优先权日1990年11月7日
发明者K·G·保尔, C·J·查理斯, C·R·托马斯 申请人:科尔特奇公司