取代的黄嘌呤衍生物的制作方法

专利名称：取代的黄嘌呤衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一些具有药理学活性的新型化合物及其这样的化合物的制备方法，还涉及了含这些化合物的药物组合物以及这些化合物或组合物在医学中的应用。
分子药理学(Molecular pharmacology)，6卷，No.6，1970，P597～603)披露了1，3-二甲基-8-硝基-黄嘌呤。这种化合物具有脂解活性。Ann Chim，47，362-365(1957)披露了1，3-二甲基-8-氨基-黄嘌呤及其制备方法，这种化合物无药理学效用。Drug Res、27(1)Nr.19，1977，4-14页，Van K.H.Klingler披露了一些1，3-二甲基-8-取代的黄嘌呤，它们在苯乙基氨烷基黄嘌呤的合成中作为独立的中间体。Drug Res，31(11)，Nr.12，1981，R.G.Werner等人，2044-2048页披露了一些1，3-二甲基-8-取代的黄嘌呤，这些化合物无药理学活性。
欧洲专利申请(公开号0369744)也披露了一些1，3-或1，3，7-8-H环烷基亚烷基黄嘌呤，此外还涉及它们作为支气管扩张药在治疗哮喘中的应用。
人们已经发现一些新的8-取代黄嘌呤具有作为磷酸二酯酶抑制剂的活性。
这些化合物表明是诱导血液嗜曙红细胞数量增多的优良的抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗和/或预防由嗜曙红细胞数量增多而引起的病症如哮喘，以及由特异反应引起的变应性病症如荨麻疹，湿疹和鼻炎。
这些化合物还表明具有支气管扩张药的活性，因此可用于治疗呼吸器官系统的病症如可逆气道梗阻和哮喘。
这些化合物还具有阻止大脑新陈代谢抑制作用影响的保护效应。所述化合物改进了数据获得或瞬时前脑局部缺血后的恢复，因而它们可用来治疗大脑脉管的和神经元的变性病症，上述病症和学习、记忆和包括大脑衰老、受梗塞区痴呆，Alzheimer型老年性痴呆，与记忆损伤伴随的老化有关。而且它们也可用来治疗由帕金森(Parkinson′s)疾病引起的一些病症。
这些化合物还表明具有神经保护剂的活性，因而它们在预防包括由于心脏病患者位错的阻止，中风而引起的大脑局部缺血的缺血病例造成神经元的变性而产生的病症中和在如由外科和/或在婴儿出生期间造成的这些大脑缺血病例之后所造成的神经元的变性而产生的病症中是有用的。另外，用该化合物治疗表明，对于治疗由局部缺血之后大脑功能失调所造成的功能性病症是有益的。
这些化合物对局部缺血骨骼肌内提高氧张力也是有效的。这种性能使营养血液流通过局部缺血骨髓肌增加，因此也表明本发明化合物可用作治疗末梢血管病如间歇性跛行的药剂。
本发明的化合物也可作为在活的有机体内产生肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)的抑制剂，从而它们可用来治疗伴随过度或无规律TNF产生的疾病，包括类风湿关节炎、类风湿脊椎炎、骨关节炎、痛风关节炎和其它关节炎疾病;脓毒病、脓毒性休克、内毒休克、革兰氏阴性脓毒病、中毒休克综合症、成年人呼吸窘迫综合症、脑型疟疾、慢性肺炎、矽肺、肺部肉样瘤病、骨吸收病、再熔合损伤(reperfusien injury)移植物对宿主的反应、同种异体移植排斥、由于感染引发的发烧和肌痛如流感、继发感染的或恶性生长的恶质病、恶质病，继发得到免疫性亏损综合症(AIDS)、AIDS、ARC(AIDS的相关复症)、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、克罗恩氏(crohn′s)病、溃疡性结肠炎或pyresis。本发明的化合物也用于治疗由于感染产生TNF的病毒性感染，或通过本发明化合物治疗对抑制物敏感的疾病，例如通过由一些本发现化合物直接或间接地减少复制来实现。这样的病毒包括如HIV-1、HIV-2、HIV-3、细胞巨化病毒(CMV)、流感病毒、腺病毒和疱疹病毒群，例如带状疱疹病毒和单纯性疱疹病毒，且不限于这些病毒。
上述的疗程包括兽医治疗，特别包括治疗由病毒感染引起的TNF，例如包括猫科免疫缺损病毒(FIV)或其它逆病毒感染如马科传染性贫血病毒、羊关节炎病毒、绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒、羊慢性肺炎(maedi)病毒和其它的慢性病毒(lentiviruses)。
这些化合物也可以用于治疗人类或其他哺乳动物的皮肤增生病。
因此，本发明提供一种如式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物接受的盐，式(Ⅰ)为
其中R1和R2分别表示式(a)部分-(CH2)m-A (a)其中m表示0或整数1，2，3，A表示一个取代或不取代的环状烃基;
R3表示氢、取代或不取代的烷基或在芳基部分被取代或不取代的一个芳烷基;
R4表示氢，烷基或烷基羰基。
合适的A是不取代的，良好地，A表示取代或不取代的C3-8环烷基，尤其是C3-6环烷基。
特别地，A表示一个取代的或优选不取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
良好地，A表示环丙基或环丁基。
优选地，A表示环丙基。
当其中的R3表示不取代的烷基时，合适的例子包括甲基。
当其中的R3表示取代的烷基时，合适的例子包括烷氧甲基如甲氧甲基。
合适地，R3表示芳烷基，例如在芳基部分取代或不取代的苄基。
当R3是苄基时，例子包括不取代的苄基或在苯基中被甲氧基取代的苄基，特别的例子包括4-甲氧基苄基。
合适的R4表示氢。
合适的R4表示烷基羰基。
合适的烷基羰基是C1-4烷基羰基如乙酰基。
合适的药物可接受盐是药物可接受的碱性盐和药物可接受的酸加成盐。式(Ⅰ)化合物的合适的药物可接受碱性盐包括金属盐的7-N碱式盐，包括碱金属盐如钠盐或有机胺盐如1，2-乙二胺的盐。
式(Ⅰ)化合物合适的酸加成盐包括药物可接受的无机盐如硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、氢氧化物、氢溴化物以及药物可接受的有机酸加成盐如乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗环血酸、甲基磺酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐和葡萄糖-1-磷酸盐。优选的酸加成盐是氢氯化物盐。
利用常规方法制备式(Ⅰ)化合物药物接受的盐。
这里所用的术语“环状烃基”包括单环和稠环，脂环的每个环中含有碳原子数不多于8，合适的是不多于6个碳原子，例如3，4，5或6个碳原子。
对于任何环状烃基，合适的选择性取代基包括一个C1-6烷基或一个卤原子。
所用的术语“芳基”无论是单独使用还是作为另外基团的部分(如在芳烷基中)，都包括选择不多于5个取代的苯基和萘基，优选不超过3个，取代选自卤素、烷基、苯基、烷氧基、卤代烷基、羟基、氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、烷氧基羰基氧或烷基羰基。对于任何亚苯基，选择的取代基包括不多于3个的与所述芳基有关的取代基。
对于任何芳烷基的芳基部分，合适的选择性取代基包括上述有关“芳基”的取代基，特别包括烷氧基如甲氧基。
这里所用的术语“烷基”无论是单独使用还是作为其它基团的部分(如在烷基羰基中)，都包括含有1～12个碳原子的直链和支链烷基，优选含1～6个碳原子，例如甲基、乙基、丙基或丁基。对于任何烷基，合适的选择性取代基包括不超过5个的与上述芳基有关的取代基，优选不多于3个取代基。
这里所用的名词“皮肤增生病”是指良性和恶性的皮肤增生病，其特征在于伴随不完全组织分化，在表皮、真皮或向该处附属物中加速的细胞分裂。这些疾病包括牛皮癣、异应性皮炎、非特异性皮炎、初期刺激接触性皮炎、变应性接触皮炎、皮肤基底和鳞状细胞癌、层鳞癣、表皮角化过度症、恶化前日晒引起的角化病。非恶性角化病、痤疮、人类皮脂溢性皮炎以及家畜的特应性皮炎和兽疥癣。
式(Ⅰ)的化合物优选以药物可接受的形式。此外，药物可接受的形式是指药物可接受的纯量，其不包括常规的药物添加剂如稀释剂和载体，也不含有任何通常剂量的毒性物质。排除常规的药物添加剂，此药物可接受的纯量一般至少为50%，优选75%，较优选为90%，更优选为95%。
本发明进一步提出了一种制备式(Ⅰ)化合物的方法，此方法包括式(Ⅱ)的化合物与式(Ⅲ)的化合物反应，式(Ⅱ)为
其中R1a表示如式(Ⅰ)定义的R1或一个可转变为R1的基团，R2a表示如式(Ⅰ)定义的R2或一个可转变为R2的基团，R3a表示如式(Ⅰ)定义的R3或一个可转变为R3的基团;式(Ⅲ)为
其中R5表示羟保护基，L1表示一个离去基团;如果需要，可进行一个或几个下面的选择性步骤(ⅰ)除去任一的保护基团;
(ⅱ)任一的R1a转化为R1和/或任一的R2a转化为R2和/或任一的R3a转化为R3;
(ⅲ)把式(Ⅰ)的化合物转变为另一个式(Ⅰ)的化合物;
(ⅳ)把式(Ⅰ)的化合物转化为其药物可接受的盐。
合适的离去基团L1是一个卤原子，尤其是一个碘原子。
式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物的反应可以在常规的烷基化条件下完成，例如在质子惰性溶剂中如二甲氧基乙烷、二甲基甲酰胺或四氢呋喃，能提供合适的终产品形成率的任一温度，例如0℃～100℃，通常为40℃～80℃，如60℃;并且优选在惰性气体如氮气中。
化合物(Ⅱ)合适的8-氨基基团是活性的形式，良好地是以离子的形式如盐的形式，例如由式(Ⅱ)化合物与碱金属基如叔-丁氧钾反应提供的碱金属碱的形式。
式(Ⅱ)的化合物可以利用记载在欧洲专利申请(公开号0389282)中的方法制备。
式(Ⅲ)的化合物是已知化合物，或者它们可以按制备已知化合物的方法制备，例如在Tetrahedron(1990)，46，6903中讨论的那些方法。
式(Ⅰ)的一个化合物转变为式(Ⅰ)另一个化合物的形式包括把一个R4基转变为另一个R4基，例如把R4是一个烷基羰基的水解化合物转变成为R4是一个氢原子的式(Ⅰ)化合物。
在所述的转化过程中，适当地利用合适的常规方法，而且，在上述水解过程中，也使用的是通常的水解条件，例如在乙醇溶液如甲醇中，利用弱碱作用完成烷基羰基的水解，优选用碳酸钾，这通常是在环境温度中。
对于R1a和R2a，合适的形式分别包括R1和R2或是氮保护基团如苄基、硝基苄基或三甲氧基苄基。对于R3a，合适的形式包括R3。
R是取代或不取代的芳烷基时，合适的R1a和R2a表示在不影响R3的情况下可插入并除去的氮保护基，例如三甲基甲硅烷基。
R3是取代或不取代的芳烷基时，优选R1a是R1，R2a是R2。
当R1a、R2a或R3a分别表示不同于R1、R2或R3时，上述的R1a转化为R1、R2a转化为R2、R3a转化为R3，这些转化过程可以用适当的常规方法进行。例如R1a(或R2a)表示为一个氮保护基时如苄基，用合适的常规方法就可以除去这个保护基，合适的方法例如催化氢化，然后与式(Ⅳ)的一个化合物反应得到产物，式(Ⅳ)为
其中A和m的定义如式(ⅠA)中相应的定义，X表示一个离去基团，例如卤化物如溴化物或碘化物。
任何反应基团或原子如黄嘌呤氮原子的保护可以在上述方法中适当地步骤进行。合适的保护基包括现有技术中那些常用的保护特定基或原子的基团，例如对于黄嘌呤氮原子，其合适的保护基是烷基甲硅烷基，特别是三甲基甲硅烷基或叔-丁基二甲基甲硅烷基。
利用合适的常规方法可以制备和除去保护基例如制备烷基甲硅烷基保护基团的方法可以用适当的烷基甲硅烷基卤化物处理式(Ⅱ)的化合物，例如对于三甲基甲硅烷基用三甲基硅基卤化物，对于叔-丁基二甲基甲硅烷基，用叔-丁基二甲基甲硅烷基卤化物，简便地通过在合适的溶剂中，例如四氢呋喃在环境温度下用叔-丁基氟化铵处理可以除去甲硅烷基保护基团。
本发明上面提到的具有治疗特性的化合物是由本发明提供的用作活性治疗物质的式(Ⅰ)化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物。
因此，本发明提供了式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物，它们用来治疗和/或预防伴随嗜曙红细胞数增多而产生的病症如哮喘以及由特异反应造成的变应性病症如荨麻疹，湿疹和鼻炎。
另一方面，本发明还提供了用作一种磷酸二酯酶抑制剂的式(Ⅰ)的一种化合物或其一种合适的药物可接受的盐和/或其一种药物可接受的溶合物。
正如上面所述，本发明特别的一面是提供一种用于治疗呼吸器官系统病症如可逆的气道梗阻和哮喘的式(Ⅰ)的化合物或其一种合适的药物可接受的盐和/或一种药物可接受的溶合物。
在另一个特别的方面，本发明提供的一种式(Ⅰ)化合物或其一种合适的药物可接受的盐或其一种药物可接受的溶合物，它们用于上面提到的治疗中，例如伴随学习、记忆和识别机能障碍产生的大脑血管和神经元变性病症、末梢血管病或皮肤增生病，或用于预防由局部缺血引起伴随神经元变性产生的病症。
另一方面，本发明还提供了用作在活的有机体内产生肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂的式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物。
特别是本发明的式(Ⅰ)化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物用于治疗和/或预防由于过度或无规律TNF产生而引起的疾病。
用于过度或无规律TNF产生而引起的疾病包括类风湿关节炎、类风湿脊椎炎、骨关节炎、痛风关节炎和别的关节炎病;脓毒病、脓毒性休克、内毒休克、革兰氏阴性脓毒病、中毒休克综合症、成年人呼吸窘迫综合症、脑型疟、慢性肺炎、矽肺、肺肉样瘤病、骨吸收病、重熔合损伤(reperfusion injury)、移植物对宿主的反应、同种异体移植物的排斥、由于感染引发的发烧和肌痛如流感、继发感染或恶性生长恶病质、恶病质，继发获得性免疫缺损综合症(AIDS)，AIDS、ARC(AIDS相关的复症)、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、克罗恩氏(crohn′s)病、溃疡结肠炎或pyresis。
另一方面，本发明提供的式(Ⅰ)化合物或其合适的药物可接受的盐或其药物可接受的溶合物用于治疗和/或预防由于感染引起产生TNF的病毒性感染，或对抑制物敏感的那些疾病，如通过本发明的化合物直接或间接地减少复制。这些病毒包括如HIV-1、HIV-2和HIV-3，细胞巨化病毒(CMV)、流感病毒、腺病毒和疱疹组病毒，例如带状疱疹病毒和单纯性疱疹病毒、且不限于这些病毒。
式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物可以直接投药，或优选作为一种药物可接受载体的药物组合物。
因此，本发明提供的药物组合物含有式(Ⅰ)化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物和一种药物可接受的载体。
用来引入机体的活性化合物可以通过任何适当的途径配制，优选的途径取决于所要治疗的疾病，并且优选以单位剂量的形式或以病人能给自己施单独剂量药的形式。有益的是，本发明的组合物适合于口、直肠、局部、注射的、静脉内或肌肉给药或通过呼吸道给药。设计的制剂可以使活性组分慢慢地释放。
本发明组合物的形式可以是片剂、胶囊、香囊、小瓶装、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、可再组成的粉末、或液体制剂如口服液或无菌的注射溶液或悬浮液。局部给药的配方也可以作用于合适的部位。为了满足定量的服药，本发明组合物优选以单位剂量的形式。
作为口服药，单位剂量的外观形式可以是片剂和胶囊，并且可含有常规的赋形剂，例如粘合剂如糖浆、阿拉伯胶、明胶、;山梨醇、黄蓍胶、或聚乙烯吡咯烷酮;填充剂如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸，片润滑剂如硬脂酸镁;分解剂如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素;或药物可接受的湿润剂如十二烷基硫酸钠。
制备固体口服药组合物的常规方法是混合、填充、制片等。重复混合操作可以使活性药剂分散到整个的含大量填充剂的组合物中。
上述的操作当然通常为现有技术，在一般的药物实践中，片剂药可以按已知方法包衣，特别是包上肠溶衣。
口服液体制剂的形式可以是例如乳状液、糖浆或酏剂，或可以作为干制剂在使用前与水或其它合适的载体进行再组合。这些液体制剂可含有通用的添加剂，例如悬浮剂如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化食用脂;乳化剂如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯、或阿拉伯胶;不含水的载体(可包括食用油)如杏仁油、分馏椰子油，油状酯如甘油酯、丙二醇或乙醇;防腐剂如甲基或丙基对-羟基苯甲酸盐或山梨醇;按需要加入常规香精或色素。
为使药给到呼吸道，合适的组合物形式也可以是以喷雾器作用的嗅剂或烟雾剂或溶液，或吹进的细微粉末，可单独使用或与惰性载体如乳糖混合。在这种情况下，活性化合物颗粒合适的直径小于50微米，例如0.1～50微米，优选小于10微米，如1-10微米、1～5微米或2-5微米。在适当的情况下，可以包括少量的抗哮喘药和支气管扩张经，例如拟交感神经胺和异戊间二烯肾上腺素、乙基异丙肾上腺素、嗽必妥、苯肾上腺素和麻黄碱;皮质类甾醇，如泼尼松龙和肾上腺兴奋药如ACTH。
作为肠胃外给药，利用该化合物和一种无菌载体制备液体单位剂型，并且决定于所用的浓度，化合物可以悬浮或溶解在载体中。在制备溶液中，该化合物可溶于作为注射用的水中，并在装入适合的药瓶或安瓿前灭菌过滤，然后密封。
有利的是，溶解在载体中的组分有辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂。为了增强稳定性，组合物可以在装入药瓶前进行冷冻并在真空下去除水。肠胃外给药的悬浮液的制备基本上按上述相似的方法，除了化合物是悬浮在载体中以代替溶解在其中，以及用过滤方法不能完成杀菌的目的。化合物可以在悬浮于无菌载体前通过暴露在环氧乙烷之中的方法来进行杀菌。有益的是，在该组合物中还包括一种表面活性剂或湿润剂，为的是促使化合物均匀地分布。
该组合物中活性物质的含量为0.1%～99%wt，优选为10～60%wt，这取决于给药的方法。
式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物也可作为与普通局部的赋形剂混合的局部配方被引入机体内。
可被提供的局部的配方如软膏，乳膏或洗剂，浸渗过的敷料、凝胶、凝胶贴(gel sticks)、喷雾药和烟雾剂，并且可以在软膏和乳膏中含有适当的常用添加剂如防腐剂、溶剂、为的是使药渗透和润滑药。该配方也可含有可配伍的常用的形体，例如乳膏或软膏基料和作为洗剂的乙醇或油醇。
对于式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐，可使用的合适的乳膏，洗剂，凝胶、凝胶贴、软膏、喷雾药或烟雾剂配方是现有技术中常用的配方，例如它们记载在药物和化妆品的普通教科书中，如Harry′s Cosmeticology(由Leonard Hill Books出版)，Remington′s pharmaceutical Sciences和the British和US Pharmacopoeias。
相适应的式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐含配方重量的约0.5～20%，优选约1～10%，例如2～5%。
本发明用于治疗的化合物剂量可随通常的情况变化，即随病症的严重性、患者的体重以及化合物相应的有效量而变化。但作为普通的指南，适当的单位剂量可以为0.1～100mg，例如0.5～200mg，0.5～100mg或0.5～10mg，如0.5、1、2、3、4或5mg;这种单位剂量可一天服用一次以上，例如每天2、3、4、5或6次，但优选每天服用1或2次，为的是使70Kg体重的成年人每天总的给药量在约0.1～1000mg的范围内，即约0.001～20mg/Kg/天，例如0.007～3，0.007～1.4，0.007～0.14或0.01～0.5mg/Kg/天，如0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1或0.2mg/Kg/天;这样的疗法可以持续数星期或几个月。
这里所用的术语“药物可接受的”包括适于供人类和兽医作用的物质。在上述剂量范围内没有发现式(Ⅰ)化合物有任何毒性。
本发明由下面的药理学数据和实施例进行阐述，以下的制备方法说明了由中间体制备新型化合物式(Ⅰ)。
实施例18-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨]-1，3-二(环丙基甲基)-7-(4-甲氧基苄基)黄嘌呤
在60℃、氮气条件下，把叔-丁氧钾(0.35g，3.13mmol)加入到二甲氧基乙烷(DME 10ml)中的8-氨基-1，3-二(环丙基甲基)-7-(4-甲氧基苄基)黄嘌呤(0.99g，2.5mmol)的溶液中。3小时后，在5分钟之内慢慢地加入DME(3ml)中的4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基碘化物(1.69g，5.4mmol)的溶液。搅拌18小时后，冷却此混合物，倒入乙酸乙酯，水洗有机溶液，干燥、蒸发。在硅石上用色谱法(丙酮/己烷1∶7)得到8-[4-乙酸基-(3-乙酸基甲基)丁基-氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-(4-甲氧基苄基)-黄嘌呤(0.63g，43%)，mp129～129.5℃。
δ(CDCl3)0.43-0.50(8H，m)，1.26-1.38(2H，m)，1.58(2H，m)，1.91(1H，m)，2.05(6H，s)，3.47(2H，m)，3.79(3H，s)，3.90(2H，d，J＝3.9Hz)，3.93(2H，d，J＝3.9Hz)，4.03(4H，m)，4.30(1H，t，J＝6.0Hz)，5.29(2H，s)，6.88(2H，d，J＝8.5Hz)和7.22(2H，d，J＝8.5Hz);
Vmax(KBr)3272(m)，1742(s)，1693(s)，1651(s)，1617(s)，1566(s)，1250(s)，1240(s)，1221(s)和1040(s)cm-1;
m/e(FAB)121(100%)，145(34)，105(27)，582(MH+，25)和604(MNa+，15);
发现C，61.78;H，6.89;N，11.82;C30H39N5O7满足C，61.94;H，6.76;N，12.04%有与实际样品相同的起始物质(0.41g，42%)。
实施例21，3-二(环丙基甲基)-8-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基氨基]-7-(4-甲氧基苄基)黄嘌呤
在室温下，于甲醇(8ml)中搅拌5小时8-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-(4-甲氧基苄基)黄嘌呤(0.22g，0.37mmol)和碳酸钾(0.005g，0.037mmol)。此混合物用cHCl中和，并在减压下除去该溶剂。在硅面上(己烷/丙酮梯度)用残余物(250ml)色谱法得到1，3-二(环丙基甲基)-8-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基氨基]-7-(4-甲氧基苄基)黄嘌呤(0.11g，59%)，mp.141-2℃。
δ(CDCl3)0.39-0.49(8H，m)，1.28-1.38(2H，m)，1.61-1.65(3H，m)，2.29(2H，t，J＝4.5Hz)，3.46(2H，m)，3.68(4H，br s)，3.80(3H，s)，3.92(4H，t(重叠 d)，J＝6.5Hz)，4.56(1H，t，J＝5.3Hz);5.28(2H，s)，6.88(2H，d，J＝8.5Hz)和7.23(2H，d，J＝8.5Hz);
Vmax(KBr)3314(m)，3250(s)，1695(s)，1685(s)，1634(s)，1611(s)，1607(s)，1578(m)，1030(m)and 756(m)cm-1;
m/e(CI)498(MH+，100%)，35(40)，448(12)，396(10)和121(7);
发现C，62.92;H，7.10;N，14.22;C26H35N5O5满足C，62.76;H，7.09;N，14.08%.
实施例38-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-甲基黄嘌呤
用与实施例1相同的方法从8-氨基-1，3-二(环丙基甲基)-7-甲基黄嘌呤制备产量为32%的8-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-甲基黄嘌呤，mp163～4℃。
δ(CDCl3)0.41-0.49(8H，m)，1.24-1.37(2H，m)，1.72(2H，q，J＝6.9Hz)，2.08(6H，s)，2.13(1H，t，J＝6.3Hz)，3.59(2H，dt，J＝6.9，6.0Hz)，3.68(3H，s)，3.90(4H，t(重叠 d)，J＝7.0Hz)，4.06-4.20(4H，m)，4.50(1H，t，J＝6.0Hz);
发现C，58.05;H，6.97;N，14.53;C23H33N5O6满足C，58.09;H，6.99;N，14.73%.
实施例41，3-二(环丙基甲基)-8-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基氨基)]-7-甲基黄嘌呤
用与实施例2相同的方法从8-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-甲基黄嘌呤制备产量为59%的1，3-二(环丙基甲基)-8-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基氨基]-7-甲基黄嘌呤，mp173℃;
δ(CDCl3)0.39-0.48(8H，m)，1.25-1.39(2H，m)，1.69(2H，q，J＝6.6Hz)，1.83(1H，m)，3.49(2H，m)，3.64(3H，s)，3.67(4H，t，J＝5.5Hz)，3.87(2H，d，J＝7.2Hz)，3.91(2H，d，J＝7.2Hz)，4.04(2H，t，J＝5.5Hz)，6.17(1H，t，J＝5.5Hz).
发现C，58.11;H，7.56;N，17.98;C19H29N5O4满足C，58.29;H，7.47;N，17.89%.
实施例58-[4-乙酸基-3-(乙酸基甲基)丁基氨基]-1，3-二(环丙基甲基)-7-(甲氧基甲基)黄嘌呤
用与实施例1例描述相同的方法制备标题化合物(mp 98～99℃)。
药理学数据磷酸二酯酶的抑制磷酸二酯酶的分离从中心室制备Ca2+/钙调节蛋白受激的PDE(PDE Ⅰ参见表1和Beavo与Reifsynder(1990)命名法)，接着，在Mono Q柱上色层谱，由Ca2+表示PDE活性刺激作用的馏分和钙调节蛋白被汇集起来，进一步在钙调节蛋白亲合柱上纯化。cGMP-受激的PDE(PDE Ⅱ)、cGMP-抑制的PDE(PDE Ⅲ)和cAMP-特异的PDE(PDE Ⅳ)都从豚鼠心室分离。开始在20ml Mono Q柱上，用色谱法从含PDE Ⅱ和PDE Ⅳ的峰分离出PDE Ⅲ，后者在1ml Mono Q柱上单独的再次色谱分析。在DEAE-纤维素和Mono Q柱上用色谱法从猪肺得到cGMP-选择性PDE(PDE Ⅴ);用钙调节蛋白亲合柱去除残留的PDE Ⅰ活性。
磷酸二酯酶同功酶的特性除了PDE Ⅱ显示正的协作性外，所有制剂都表示简单的Michaelis-Menton动力学(参见表1)。
PDE Ⅰ这个同功酶活性由Ca2+-钙调节蛋白配合物激化，该同功酶能水解cAMP和cGMP，cGMP是优选的作用物。
PDE Ⅱ这个以cAMP为作用的同功酶活性由cGMP激化。该同功酶能水解cAMP和cGMP，cGMP是在基本条件下优选的作用物。该同功酶的活性不受Ca2+-钙调节蛋白配合物的影响。
PDE Ⅲ这个以cAMP为作用物的同功酶的活性受cGMP抑制。该同功酶能水解cAMP和cGMP，cAMP是优选的作用物。该同功酶的活性不受Ca2+-钙调节蛋白配合物影响。
PDE Ⅳ此同功酶具有对cAMP高的亲合性，其的水解作用不受cGMP抑制。该同功酶的活性不受Ca2+-钙调节蛋白配合物的影响。
PDE Ⅴ此同功酶具有对cGMP高的亲合性，该同功酶的活性不受Ca2+-钙调节蛋白配合物影响。
磷酸二酯酶活性测定用先前记载的(由Reeves等人，1987描述的)硼化物柱的方法(boronate column)测定PDE活性。把酶放在50mM Tris、5mM MgCl2、PH7.5中，于37℃下保温4-30分钟，用3H标记的环状核苷酸(每分钟分解4×105)和14C标记的核苷酸5′-单磷酸盐(每分钟分解3×103)测定酶。通过加热沸腾而停止测定，在硼化物柱上从酶作用物中分离出3H标记的5′-单磷酸盐产物。反应混合物用0.5mL、100mM HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸]、100mM NaCl、PH8.5稀释，并流经硼化物柱的。用相同的缓冲液充分地清洗柱子，再用6ml、0.25M乙酸洗脱5′-核苷酸。由14C-回收物判断产物的收回量大约为80%。在所用实验范围内，全部测定结果都与保温时间和酶浓度成线性关系。
获得IC50值(抑制剂浓度要求抑制50%的活性)的方法是同功酶的保温，利用1μM cGMP作为PDE Ⅰ(没有Ca2+和调节蛋白)PDE Ⅱ和PDE Ⅴ的作用物并用1μM cAMP作为PDE Ⅲ和PDE Ⅳ的作用物。
使用抑制剂浓度的范围为0.1×IC50～100X IC50。
参考BEAVO，J.A和D.H.REIFSNYDER，Primary sequence of cyclic nucleotide Phosphodiesterase isozymes和the design of selective inhibitors.Trends.Pharmacol.Sci.11，150-155(1990)。
REEVES M.L.，B.K.LEIGH和P.J.ENGLAND，The identification of a new cyclic nucleotide Phosphodiesterase activity in human and guinea-Pig cardiac Ventricle.Biochem.J.241，535-541(1987)。
表1磷酸二酯酶的动力学特征同功酶 Km(μM)Vmax cAMPcAMP cGMP Vmax cGMPI. Ca2+/钙调节蛋白激化的 36 5 5II. cGMP-激化的 45 14 1III. cGMP-抑制的 0.5 0.1 5IV. cAMP-特异的 2 > n.dV. cGMP-特异的 > 1 N.da.表示正协作性的酶＞Km＞100μMn.d不能确定，因为PDE不水解一种基质。
结果实施例号 抑制PDE VA PDE IV(IC50μM)1 0.2 32 0.2 9式(Ⅰ)化合物对活的有机体内，由人体的单核细胞产生的TNF的抑制效果第1部分试样的确定利用下面记录的内容检验，式(Ⅰ)化合物对活有机体内人体单核细胞产生TNF的作用。
按照Colotta，R.等人的方法(J.Immunol.132(2);936<1984>)，从血库的血沉棕黄色层或血小板去除残留物分离并纯化人类末梢血液的单核细胞。把这些单核细胞移植在24孔的多孔盘中(24-wellmuiti-dishes)，其密度是每孔有基质为1×106细胞/毫升。让这些细胞粘着达1小时，之后吸走上层清液，以10单位/毫升的速度加入1ml含1%胎儿腓血清(fetal colf serum)和青霉素以及Sueptomycin 的新鲜基质(RPMI-1640(Whitaker Biomedical Products，Whitaker，CA)。上述细胞在有或没有试验化合物情况下，在1nM-10μm 剂量范围(化合物增溶溶解在二甲基亚砜/乙醇中以使培养基中最终的溶解浓度为0.5%二甲基亚砜/0.5乙醇)培育45分钟。然后加入100ng/ml在10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的细胞脂多糖类(E.Colio 55∶B5[LPS]来自Sigma chemicals co)，在含5%Co2的培养箱中于37℃下培育此培养基达16～18小时。培育结束时，从细胞中除去培养基的上层清液，即以每分钟3000转的速度离心去除细胞碎屑，然后用下述的放射免疫测定法测定0.05ml的上层清液TNF的活性。
第Ⅱ部分TNF活性的放射免疫测定法试样缓冲剂的PH为7.4，由0.01M NaPO4、0.15M NaCl、0.025M EDTA和0.1%叠氮化钠组成。通过下面第Ⅲ部分所述的改进的氯胺-T法对人类重组体TNF(rhTNF)进行碘化，rhTNF是用chen等人的方法[Nature，330∶581-583<1987>)得到的。
为了得到样品(50μl培养基的上层清液)或rhTNF标准物，把多克隆兔子的抗rhTNF(Genzyme，Boston MA)的1/9000稀释液和8000cpm的125I-TNF加入到最终400μl体积的缓冲剂中，并在4℃下过夜培养(18小时)。普通的兔子血清和山羊抗-兔子IgG(Calbiochem)相互被滴定以达到最大量的抗-rhTNF沉淀，然后，使适当的稀释液沉淀，其中稀释液为载体普通兔子血清(1/200)、山羊抗-兔子IgG(1/4)和25单位的肝素，(Calbiochem)，每个测试管加200μl的上述配合物，并在4℃下过夜培养。试管在2000rpm条件下离心30分钟，仔细地吸走上层清液，用Beckman Gamma 5500计数器测定有关片状物的放射性。对数值Log的直线变化曲线作为计算之用。从rhTNF标准曲线读出样品中TNF的浓度，即直线在157～20，000Pg/ml范围。
第Ⅲ部分rhTNF的放射性碘标记用改进的氯胺-T方法(Frolik等人，J.Biol chem，25910995-11000<1984>)进行对rhTNF的碘化。简单地说，用15ml 0.5M KPO4和10ml无载体125I(100mCi/ml;ICN)稀释溶于5ml、20MM Tris PH7.5中的5mg rhTNF。开始反应，加入浓度为100mg/ml(含水)氯胺-T溶液的5ml等分试样。室温下2分钟后，添入附加的5ml等分试样，1.5分钟后再加入最后5ml氯胺-T。
此反应停止1分钟后连续加入20ml的50mM焦亚硫酸钠、100ml的120mM碘化钾和200ml的1.2mg/ml尿素。混合这些成份，让反应混合物流经预先装好的Sephadex G-25柱(PD10 Pharmacia)，用含0.25%明胶的PH7.4的磷酸盐缓冲盐水进行平衡和洗脱。含馏分的最高放射性物质被洗下来，并存于-20℃下。125I-TNF的特异的活性成份是80-100mCi/mg的蛋白质。用L929细胞毒素测定法(由Neale，M.L.等人，Eur.J.Can.Chn.Oncol.，25(1)133～137(1989))检测碘化TNF的生物活性，发现80%具有生物活性的未标记TNF。
第Ⅳ部分测定TNF ELISA用改进的基本Sandwich ELIST测定法也可测定TNF值，其方法记载在Winston等人(current protocols in Molecular，Biology，11、2、1页Ausubel等人，Ed.<1987>)John Wiley和Sons.New York.USA)。ELISA利用鼠色的单克隆抗-人体TNF抗体(见下述)作为收集的抗体，多克隆兔子抗-人体TNF抗体(见下述)作为第二抗体。为了检测，加入过氧化物酶-共轭的山羊抗-兔子抗体(Boehringer Mannheim，Indianopolis，Indiana，USA，Catalog ＃605222)，再加入一种基质以用于过氧化物酶(具有0.1%过氧化尿素的1mg/ml正苯二胺)。从标准曲线计算样品中的TNF值，标准曲线是由重组体人体TNF产生的，其制法记载在E.coli中(得自Smithkline Beecham Pharmaccuticals，King of Prussia，PA，USA)。
第Ⅴ部分制备抗-人体TNF抗体用重组体人体TNF免疫了的BALB/C鼠脾制备人体TNF的单克隆抗体，所用的是Kohler和Millstein的改进方法(Nature 256495(1975))，该方法的全部内容在此引作参考文献。通过重复对New Zeland White(NZW)兔子的免疫来制备多克隆兔子抗-人体TNF抗体。所述的兔子利用在完全Freund′s辅助剂(DIFCO.IL，USA)中被乳化了的重组体人体TNF免疫。
结论确定存在8-(4-乙酸基-3-乙酸基甲基)-1-丁基氨基-1，3-二(环丙基甲基)-7-对-甲氧基苄基黄嘌呤，这表现在活的有机体内TNF产物的试样体系中有约0.30μM的IC50。
D-gal-过敏老鼠的内毒素休克该试验特别记载在Galanos等人的方法中(Proc，Natl Acad.Sci USA，765939-43(1979))中，其内容在此引作参考。简单地说，D-gal(D(+)半乳糖甙酶)使各种老鼠过敏，结果是由内毒素导致死亡。静脉内(i.v)引入D-gal(300-500mg/Kg)让老鼠过敏，使脂多糖(LPS)剂量降低到0.1μg。简单说，给雄性C57BL/6老鼠静脉注射溶于0.20-0.25ml无热原盐水中的混合了D(+)-gal(Sigma500mg/Kg)的0.1μg LPS，其来自Salmonella typhosa(Difco Laboratories，Detroit，Michigan，USA)，所述的老鼠为6-12周大小并来自Charles Kiver Laboratories(Stone Ridge，New York，USA)。作试验的化合物可以在静脉注射LPS/D-gal的前、后随时加入。在本实验中，注射LPS之后，受试动物一般5-6小时死亡，但个别的则在24-48小时间死去。
测定TNF活性用改进的基础三明治(Sandwich)ELISA方法测定血浆的TNF值，该方法记载在Winston等人的Current protocols in Molecular Biology(Pg 11、2、1，Ausubel等人Ed(1987)John Wiley和Sons，New York，USA)中，以利用腮鼠的单克隆抗-幼鼠TNF(Genzyme，Boston，MA，USA)的Elisa作为俘获的抗体，以利用抗-幼鼠TNF(Genzyme，Boston，MA，USA)的多克隆兔作为测试的抗体。从以重组体鼠TNF(Genzyme，Boston，MA，USA)产生的标准曲线计算实验老鼠中TNF值，由ELISA测定的TNF值与用L929生物鉴定法测的值有关联，L929生物鉴定法记载在Ruff等人的J Immunol，1251671 1677(1980)中，即生物鉴定中1单位的活性相应ELISA中70微微克(Pg)的TNF。ELISA测得的TNF值降到25Pg/ml。
在上述试验中，活性化合物在活有机体内具有正反应，如对于血清TNF的降低表现在ED50降低到约50mg/Kg口服给药。
权利要求
1.一种制备式(Ⅰ)的一种化合物或其一种合适的药物可接受的盐的方法，式(Ⅰ)为
其中R1和R2分别表示式(a)部分-(CH2)m-A (a)其中m表示0或整数1，2或3，A表示一个取代或不取代的环状烃基；R3表示氢、取代或不取代的烷基，或是在芳基部分取代或不取代的芳烷基；和R4表示氢，烷基或烷基羰基。制备方法包括一个式(Ⅱ)化合物与一个式(Ⅲ)化合物反应，式(Ⅱ)为
其中R1a表示如式(Ⅰ)定义的R1或一个能转变为R1的基团，R2a表示如式(Ⅰ)定义的R2或一个能转变为R2的基团，R3a表示如式(Ⅰ)定义的R3或一个能转变为R3的基团；式(Ⅲ)为其中R5表示羟保护基，L1表示一个离去基团；另外，根据需要进行一项或几项下面的选择性步骤。(ⅰ)除去保护基(ⅱ)把任一基团R1a转化为R1和/或把任一基团R2a转化为R2和/或把任一基团R3a转化为R3；(ⅲ)把式(Ⅰ)的一个化合物转化为式(Ⅰ)的另一个化合物；(ⅳ)把式(Ⅰ)的一个化合物转化成其药物可接受的盐。
2.一种根据权利要求1制备一种化合物的方法，其中A表示一个环丙基。
3.一种根据权利要求1或2制备一种化合物的方法，其中R3表示一个芳烷基。
4.一种根据权利要求1-3中任一项制备一种化合物的方法，其中R3表示取代或不取代的苄基。
5.一种根据权利要求1-4中的任一项制备一种化合物的方法，其中R3表示4-甲氧基苄基。
6.一种根据权利要求1-5中任一项制备一种化合物的方法，其中R4表示氢。
7.一种根据权利要求1-5中的任一项制备一种化合物的方法，其中R4表示烷基羰基。
8.一种根据权利要求1制备一种选自在本发明中实施例1-4中任一个化合物的方法。
9.一种制备一种药物组合物的方法，该组合物包括一个式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或药物可接受的溶合物以及药物可接受的载体，其方法包括混合式(Ⅰ)的化合物或其合适的药物可接受的盐和/或其药物可接受的溶合物和药物可接受的载体。
全文摘要
一种式(I)的化合物或其合适的药物可接受的盐，式(I)为其中R-(CH其中m表示0或整数1，2或3，A表示取代或不取代的环状烃基；R
文档编号A61K31/52GK1094046SQ9310758
公开日1994年10月26日 申请日期1993年5月20日 优先权日1992年5月21日
发明者A·E·芬韦克 申请人:史密丝克莱恩比彻姆有限公司