专利名称：通过继承性转运抗原特异性的细胞毒t细胞建立的免疫调节方法
技术领域：
本发明涉及抗原特异性细胞毒T细胞(CTLs)的制备和使用，以及作为治疗制剂的这种T细胞和适于作为治疗制剂的CTLs的组合物的具体制备过程。
在动物模型上继承性转运抗原特异性的细胞毒T细胞可建立有效的免疫性。因此，可作为一种治疗病毒感染和肿瘤的方法。
在免疫抑制病人中，由细胞肥大病毒、EB病毒或源于肝炎病毒类病毒的感染引起的慢性感染期的再活化能导致危及生命的症状。这能明显影响进行过骨髓移植、实体器官移植或经受过化疗或放疗以及HIV病毒感染的病人。
EB病毒(EBV)是一种人类疱疹病毒，它一般在活口咽道上皮细胞复制，在体外能使B淋巴细胞获得不死性。在免疫性宿主中，EBV可引起感染性单核细胞产生增多。它还可与几种人类在体肿瘤有关，例如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽道癌及诸如原发性免疫缺陷病人、HIV病毒感染者、器官移植受者和用免疫抑制药物治疗的自身免疫疾病患者这样的免疫缺陷病人所患有的B细胞淋巴瘤。(汉图等人，1985(1)；付曼等人，1987(2)；萨特等人，1988(3)；凯麦等人，1993(4))。EBV引起淋巴增殖的发生在很大程度上与免疫抑制的程度有关。(霍洛维兹等人，1990(23))。
在正常宿主中，EBV引起的淋巴增殖被EBV特异性和MHC限制性T淋巴细胞控制，并能通过MHC非特异性细胞毒T-淋巴细胞(邓柯布等人，1992(7))及直接针对特异病毒抗原的抗体对EBV转化细胞产生细胞毒作用(劳斯顿等人，1975(5)；雷金森等人，1980(6))。相反，在免疫缺陷病人中，这些EBV诱导的细胞的增殖不受控制地进行。据估计这始于多克隆起源的开始阶段。然而，由于免疫抑制的持续存在，这些克隆变成赘生性细胞，最后形成真正的EBV诱导的淋巴瘤(汉图等人，1985(1))。
许多工作指出消除药物引起的免疫抑制，正如突体器官受者的情况，足以自发消除这些情况。然而，如果免疫抑制持续存在，赘生性细胞将显著性生成。骨髓移植以后发生的EBV诱导的BLPD(B细胞型淋巴样增殖失调症)的病例可参见(萨特等人，1988(3)；沙皮罗等人，1988(8))。这种增殖发生的可能性与所进行的骨髓移植的特性有密切关系。关于EBV诱导的BLPD的陆续报导可参见去除T细胞的骨髓移植或在体内使用抗胸腺细胞球蛋白的病例(萨特等人，1988(3)；沙皮罗等人，1988(8))。与实体器官移植受者由于药物引起的免疫抑制不同，骨髓移植受者不能通过消除针对GVHD的药理性免疫抑制(葛拉拉等人，1991(31)；Jakus等人，1992(32))或骨髓排斥来进行迅速的免疫性重建(萨特等人，1988(3)；沙皮罗等人，1988(8))。因此，对于骨髓移植术中发生的EBV诱导的BLPD的诊断迄今为止仍很重要。
由于正常个体只需要少量的特异性细胞毒T细胞来控制EBV转化的B淋巴细胞，所以接受去除T细胞的骨髓移植病人在患BLPD后，可通过植入供体淋巴细胞来供给患者抵抗EBV的免疫力，从而控制这种严重且复杂的疾病(克南等人，1989(10))。然而，确有自身引发或由于使用用于治疗的免疫抑制药物的GVHD而促使EBV诱导的疾病复发的潜在危险存在。
雷戴尔等人(1992)(22)的报导结果表明继承性转运克隆了的对CMV具特异性的T细胞能使免疫缺陷病人的抗病毒免疫力得到恢复。在该项研究中，对一种CMV抗原具特异性的CD3+，CD8+及CD4-CTL克隆产生于三个呈CMV血清阳性骨髓供者，在体外繁殖5-12周后进行继承性转运。这些克隆呈现I型MHC限制性免疫显性保护性CTL反应。在用这些CTLs进行T细胞转运期间，病人用环孢霉素A和泼尼松进行免疫抑制治疗，从而预防移植物-宿主的免疫排斥疾病。
然而，该方法的弱点是为了获得特异性CTLs需选择出单个克隆，并需至少5-6周的繁殖期。而且，如此获得的CTL克隆，一个克隆只能针对病毒抗原的某一个表位，并且它只限一类MHC。治疗中的另一个弱点是必须采用另外的免疫抑制治疗，特别是在患爱滋病的病人或事先经历过化疗或放疗的病人的病例中，然而，这种治疗方法不是值得推荐的。
该发明的目的在于避免这些弱点和提供一种有效的生产抗原特异性CTLs的方法。该CTLs可作为有效的治疗试剂，且不需长时间的生产周期，并不会产生严重副作用。
该发明的主要内容是一种生产抗原特异性的优选是CD8+CTLs的细胞毒T细胞(CTLs)的方法。其包括将含T细胞的细胞制备物与所述抗原一起孵育，然后分离出所述抗原的特异性CTLs其特征在于i)与抗原共孵育以激活制备细胞中的CTLs的增殖；ii)可选择性将一个载体导入增殖的CTLs，导入的载体含有一个能区分于标记和非标记细胞的标记基因；和iii)根据所述的标记基因，将转染的抗原特异性CTLs分离出来。
该方法的一个基本优点是避免了极为耗时的选择单个CTLs克隆的过程；通过该方法，CTLs可通过转运标记基因后阳性选择遗传学标记来分离获得。并且，这样制备的CTLs含有至少两种但通常是多种在MHC呈现抗原不同表位的CTLs。这里CD4+(限于II型MHC)和CD8+(限于I型MHC)均可获得。一个优选的例子是CD8+与CD4+的细胞比率可用以预先确定浓度的白介素2在预定长短的培养时间加入来控制。最理想的是，制备的CTLs中含过量的CD8+。通过合适的测量步骤(例如加入一种细胞因子)同样可制备CD4-的CTLs。
T细胞制备可是自体的也可是同种异体的。尽管并不必需，在执行本发明的方法前从其它细胞中富集和分离T细胞，这种经富集的制备物也可用于本发明的方法中。
至于T细胞，优选来源于同种异体供者T细胞(具有合适的HLA类型)，优选的是使用已经去除其它血细胞的纯化的血液制备物(例如用Ficoll梯度纯化)。这种制备通常称作“buffy coat”。
至于载体，有几种优选的病毒载体可作为细胞传递的基因传递系统。作为病毒载体，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒为优选。逆转录病毒是用于基因转染的最好的特征性病毒载体，且已被用于最初基因治疗模式(木力根在第80届诺贝尔专题讨论会的文章DNA水平上的人类病因学(林德思登和皮特森等，143-189，热文印刷))。腺病毒载体也较适合，因为它们在结构上稳定且可得到高滴度的制备(Berkner in Current Topics in microbiology and Immunology158(1992)，穆兹斯卡，N.(ed.)36-66，Springer Verlag)。来源于非病原性的人类腺相关病毒的载体(AAV)也是用于人类基因转染的有前途的工具(穆兹斯卡，supra，97-129)。
由于逆转录病毒只特异性感染处于分裂相的细胞，阳性选择转导的细胞可显著富集抗原特异性的淋巴细胞。因此，逆转录病毒载体是优选的。
在本发明优选的实例中，用作抗原的病毒抗原诸如CM病毒、肝炎病毒、EB病毒、病毒、HSV和HCV。取决于这些基础的疾病，针对不同病毒、细菌或单细胞病原微生物的特异性抗原均可使用。也可将完全未被激活的病毒、病毒组分、分离出的抗原或优选的抗原呈递细胞作为抗原。比如病人的肿瘤细胞、感染的细胞系或病人的感染细胞均是有用的。使用病毒或其组分具有下列优点不仅能产生一种抗原特异性的CTLs，而且可产生许多不同的可对病毒的不同抗原或病毒的不同表位特异的CTLs。也可优选使用两种或两种以上病毒抗原或病毒的结合物作为抗原。
作为载体基因，编码呈现于细胞表面分子(比如受体)的基因较好。血液细胞中LNGFR受体是优选的(波第格农等人，1994(18))。
免疫调节是指瞬时转运抗原特异性T细胞以刺激病人对肿瘤细胞或被感染细胞的免疫反应。
另外，这些基因修饰的CTLs最好含有自杀基因(诱导后可表达一种能直接引起或通过中介引起感染细胞死亡的物质，例如WO92/08796)，在成功的治疗后这样的细胞在体内可被特异性去除。为此，可选用能使转导的CTLs在体内对药物Gancialovir产生敏感，从而在体内特异性地消除那些能引起GVHD细胞的胸腺核苷激酶基因。比如，如果病人出现急性GVHD的症状肝功能酶增加及皮肤活检阳性时，优选静脉注射两次剂量约为10mg/kg的Gancyclovir药物。这可导致标记的淋巴细胞减少到最低程度。
优选的基因修饰的CTLs如
图1所示。
白喉毒素基因也是一个较好的自杀基因，它在WO92/05262(36)中已被叙述。在GVHD之后体内CTLs的消除也可导致细胞凋亡。因此优选使用一个修饰的FAS受体和一剂量的相关配基。
本发明的方法在继承性免疫治疗的研究方面有着广泛的应用，例如，控制allo-BMT之后白血病细胞的复发，在此采用大量的供体淋巴细胞(寇伯等人，1990(25)；瑞戴尔等人，1992(26)；库利斯等人，1992(27)；克林格曼等人，1991(28)；海格等人，1993(29)；巴等人，1993(30))。
通过载体感染和正性辨别载体基因表达正性选择抗原特异性细胞的方法的另一个优点是产生一群含有高几率肿瘤特异性细胞的供体淋巴细胞的同时又可降低可导致GVHD的异常反应细胞的数量。值得一提的是该技术可应用于表达所述肿瘤相关抗原继承性免疫治疗的。(台乌赛瑞等人，1992(33)；范德布拉根等人，1991(34))。
本发明的一个优选实例中，加入IL-2的浓度从10到50单位/105细胞，最好是10-25单位/105细胞。
本发明的另一个实例中，另外加入IL-2，浓度约为5个单位/105细胞。
令人惊奇的是发现为了生产载体转导的抗原特异性的CTLs，优选是在用抗原激活CTLs增殖2-30天后(优选2-10天)及在将载体转染增殖的CTLs前，在IL-2存在的条件下，培养淋巴细胞感染所述的载体后细胞将再在IL-2的存在下，培养2-4天，然后根据标记基因选择、分离CTLs(优选是CD8+)。
用病毒载体感染T细胞可通过将载体病毒产生细胞与所述的T细胞和载体病毒产生细胞的培养上清共培养或用纯化的病毒感染来完成。
优选用肿瘤细胞特异性抗原、肿瘤细胞或呈递这些抗原的细胞来激活T细胞。它的一个例子是对部分恶性骨肉瘤或部分乳癌呈特异性的MAGE-抗原。(范德布拉根等人，1991(34))。
本发明可用图示和下面的例子来进一步说明。
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实施例1用于产生载体转导的抗原特异性CTLs混合淋巴细胞肿瘤培养(MLTC)物0天自体的外周血淋巴细胞(PBLs)悬浮于补充有L-精氨酸(0.55mM)，L-天冬酰胺(0.24mM)，L-谷氨酰胺(1.5.mM)和10％人血清(HS)的Iscove氏液中。HS来源于AB、O型健康供血者，合并使用，去补体(56℃，30分钟)，并灭菌。
一百万应答者(responder)PBL在24孔培养板上与105刺激物自体的表达EB病毒抗原的肿瘤细胞混合，在终体积为2ml的上述溶液中接受辐射(到目前为止，对肿瘤细胞株10,000拉德的剂量足够)，并混入20ng/ml重组人白细胞介素-4(5U)。较高浓度诱导IL-2产生并阻断外源性IL-2的活性，这样可抑制细胞毒作用。
第三天，加入重组人白细胞介素2(r-hu-Il2)至终浓度为10-25单位/毫升，同时加入感染病毒。第七天，收集应答者淋巴细胞，离心，计数并将之重悬浮于新鲜的培养基中，于24孔培养板上，用溶于2ml含10-25单位/毫升IL-2和20ng/ml的IL-4的相同培养液中的105辐射过的肿瘤细胞再刺激浓度为3-5×105的淋巴细胞液。
第十四天，如第七天一样再刺激应答者淋巴细胞，或通过有限稀释法克隆。用有限稀释法在96孔板(圆底板)中克隆MLTC中的应答者淋巴细胞。10、3、1和0.3应答者细胞接种于含50单位/毫升IL-2，3000辐射过的肿瘤细胞(10,000拉德)和5×104辐射过的自体的外周血淋巴细胞(6000拉德)的作为饲养细胞的100ul培养基中。第二十一天，加入100ul含有50单位/毫升IL-2，3000辐射过的肿瘤细胞(10,000拉德)和5×104辐射过的自体同源的外周血淋巴细胞(6000拉德)的作为饲养细胞的培养基再刺激克隆。EB病毒特异性供体淋巴细胞出现的频率在接触了辐射过的EB病毒感染的自体B细胞和正性识别载体转导淋巴细胞后增加超过了100倍。
这种时间动力学正提供了产生转基因高细胞毒性CTLs的最高效力。
实施例2感染病毒的制备载体DNA是通过一种转染模式转化入相应病毒的。简单地说，载体DNA是通过标准磷酸钙的共沉淀转染入psi2 ecotropic包装系中的。(Mann等人，Cell 33(1983)153)。转染48小时后，收集psi2上清，在8ug/ml polybrene存在，用之感染两性包装系PA317(米勒等人，分子细胞生物学6(1986)2895)16小时。在含10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，UT)及0.8mg/ml G418(Gibco)的DMEM(Gibco，Grand Island，New Nork)中选出被感染的PA317细胞，并用之产生滴度为104∶105CFU/ml的不含helper而含有病毒的上清液。所有的载体含有一个neoR基因，其可编码能在体外抵抗新霉素物G418的新霉素磷酸转移酶。
除了psi2和PA317以外，具有高度安全标准的包装细胞系也可使用。(例如E86和AM12(Markoitz等人，1988(35)；Markowitz等人，1988(24)；WO 89/07150(9))。
抗原特异性CTLs的感染可将经刺激的CTLs(根据例1)暴露于有polybrene存在(8ug/ml)的无细胞的病毒贮液中6小时而感染病毒。感染48小时后，在含有2mmol/l L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、5％人血清(HS)及含0.4mg/ml G418的100U/ml r-hu-IL2(完全培养基)的RPMI1640中选择PBLs。在两星期的G148选择期间，细胞密度保持恒定(5×105细胞/ml)。逆转录病毒转导的人T淋巴细胞还可在Terasaki板中在含有0.4mg/mlG418及以辐射过的人CTLs为饲养细胞的完全培养基中以不同的细胞浓度(1×103)被克隆。
为了提高逆转录病毒感染效率，可将人CTLs与病毒生成细胞在完全培养基中一起孵育48到72小时。也可在transwell板中共同孵育以防止细胞之间的接触。3×105生成细胞被接种至一系列六孔板中并于37℃温孵过夜。将5×105的被刺激的CTLs加至transwell中并让其在8ug/ml polybrene的存在下生长48至72小时。
对于逆转录病毒转导的细胞，可用流式细胞仪分析其受体表达，也可对其做进一步的分析。
实施例3病例一位患有G级淋巴瘤的29岁的妇女，在一年的传统化学治疗后复发，她接受了来自其兄弟的HLA相同、MLC相匹配的排除T细胞的骨髓移植。移植前的条件与柯南等人(11)相比有所改进，包括在移植前四天进行TBI(将1320cGy分十一次于四天照射)，环磷酰胺(连续两天每天服用60mg/kg/die)，VP16(连续两天每天服用375mg/kg/die)，及兔抗胸腺细胞球蛋白(连续四天每天服用5mg/kg/die)。用大豆凝血素凝集反应及E玫瑰花环试验排除T细胞(12)。为抑制移植排斥反应(13)，移植后第一个六十天给病人服用强的松(1mg/kg/day)。移植后第40天，病人出院转入设备完善的住所。在第55至60时，病人右侧颈旁发现块状物，并伴有高烧、外周血量剧减及AST、ALT、LDH和碱性磷酸脂酶的增多(参看结果)。对颈部块状物的X线生态体层照相分析表明存在多个约2厘米大的裹缠在一起的淋巴结。对胸部进行CT扫描发现右侧气管处有多个更小的淋巴结。对颈旁的淋巴结进行活组织检查，确定伴有部分坏死的膨胀了的细胞淋巴结的存在。EBV的原点杂交表明了肿瘤细胞核中存在EBV RNA。对骨髓抽出物及骨髓的活组织检查证明了骨髓发育不良体系的存在和骨髓对柱旁淋巴样小结的显著性渗透。在此基础上，进行对EBV诱导的继发性淋巴细胞增生的诊断。通过施用供体白细胞从而将供者对EBV的免疫力提供给患者以控制这一严重病患的继承性移植免疫治疗的可能性也被考虑(10)。
通过基因修饰供体白细胞在异基因移植中应用的临床方案已在theNational(Italian)Committee for Biosafety的指导下由the EthicalCommittee of Istituto Scientfico San Raffaele批准。相应地，根据这一方案，供体白细胞在体外的转导是通过逆转录病毒载体的转运及对两种基因的表达1、一种修饰过的(无功效)的对神经生长因子基因(LINGFR)亲合性较低的受体、它用于体外转导的细胞的选择及植入体内的供体白细胞的增殖；2、使转导的PBL在体内对药物ganciclovir(15)产生敏感性的胸腺嘧啶基因，所述基因可在体内调节供体的抗肿瘤反应及特异性消除具有GVHD应答潜能的细胞。
诊断后，征得患者的同意，将其供体兄弟的2×106/Kg的CD3+淋巴细胞分两次灌注患者体内。结果部分详细描述了灌注供体淋巴细胞的临床意义。简单的说，从第一次灌注供体淋巴细胞开始的两周内，病人的EBV淋巴瘤的临床症状消失。针对II级G的生成情况，她服用了能从外周血液中完全消除标记的PBLs的ganciclovir，在BMT(骨髓移植)后的第116天出院，此时无EBV淋巴增殖、GvHD及相关疾病的症状出现。她血液中抗EBV淋巴细胞的频率在1/3000这一范围。这与包括频率为1/1100的移植供体者在内的正常个体的数值相仿。
供体淋巴细胞灌注的临床意义施用载体转导的供体细胞后的两周后，与EBV诱导的B细胞增殖相关的所有临床症状消退了，造血功能也得到了恢复。通过FACS(荧光激活细胞分析)对LINGFR表达的细胞的分析，发现此时患者外周血液中标记的供体细胞数显著增至总单核细胞的13.4％。图3显示，当临床症状消除时，PBL的数量显著上升。循环的转导了的供体淋巴细胞几乎是具有较高增殖指数的CD3+/CD8+淋巴细胞(从第10天到第15天，大于单核细胞总数的90％)。多于1/10的细胞被确认为体外EBV感染的自体的B细胞。
供体对载体转导淋巴细胞中宿主活性异常的免疫调节灌注基因修饰过的淋巴细胞约四周后，患者产生伴有肝功能性酶增加及皮肤活检阳性的急性GVHD症状。静脉注射两剂量(10mg/Kg)的药物ganciclovir，使得标记的淋巴细胞降至3.1％，皮肤GVHD的临床症状消失，改变了的肝功能性酶降至50％以上。治疗六周后患者出院时再无症状出现。
方法EBV基因组的原位杂交为了检测EBV，用与以Epstein-Barr病毒编码的两个核EBER RNAs相互补的30-mers的脱氧核糖-寡聚核苷酸进行原位杂交(Dako，Glostrup，Denmark)(16)。
用ApoB，ApoC和YNZ22的PCR多态性来分析患者BM、PBLS及EBV-淋巴瘤细胞浸润的淋巴结中的嵌合体(17)。
将基因导入外周血液淋巴细胞的方法参见实例1及参考文献(18)。
对抗原特异性淋巴细胞前体频率的确定对文献(19)中所述方法做极少量的修改后，用有限稀释法测定EBV特异性T细胞及异体特异T细胞的频率。简单地说，将有限数量的PBMC在圆底微量滴度板中与2×104辐射过的(5000rads)自体的EBV转导的B细胞或作为剌激剂的辐射过的(3000rads)异源PBMC及103作为饲养细胞的溶于200ul RPMI 1640(Gibco，含有5％的自体血清)营养液中的辐射过的(3000rads)同源PBMC一起孵育。每一应答者溶液均设立24个浓度。第六天加入20单位的hr-IL-2。第八天和第十二天时用同源EBV-B细胞和异源PBMC作为靶细胞检测铬释放。第八天在同样的细胞培养条件下，参入3H胸腺嘧啶(Amershan)六小时后进行增殖分析。用所描述的反应细胞数与非反应细胞数关系的Poisson分布来计算前体的频率(20、21)。
细胞表面表型用非直接荧光标记的方法(18)将LNGFR单克隆抗体20.4(ATCC)用于通过流式细胞仪的方法监测细胞表面LNGFR的表达。用PE耦合的抗人CD4(T4)，CD8(T8)，CD5，B4，CD25R，Leu7，CD34单克隆抗体(MoAb)(Coulter Immunology，Hialeah，FL)通过流式细胞仪确定T淋巴细胞系和克隆的细胞表型。简单地说，4℃时用100ml稀释抗体将5×105细胞染色30分钟，用无FCS的缓冲液洗两次后在0.5ml用于FACS分析的PBS或100ml稀释与FITC耦合的二抗中重悬。然后与可与FITC-及PE-耦合的抗体孵育，从而进行第二次染色分析。
权利要求
1.通过将含T细胞的细胞制备物与抗原共孵育和分离抗原特异性CTLs来制备抗原特异性细胞毒T细胞(CTLs)的方法，其特征在于i)通过与抗原共孵育激活细胞制备物中的CTLs的增殖；ii)选择性将载体转运增殖的CTLs，所述载体含有标记基因，借此基因可将标记和未标记细胞分离；iii)基于所述标记基因分离转染的抗原特异性CTLs。
2.权利要求1的方法，其特征在于以逆转录病毒作为所述载体。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于将低亲合力NGF受体作为标记基因。
4.权利要求1至3的方法，其特征在于载体另外含有自杀基因。
5.权利要求4的方法，其特征在于用HSV的TK基因作为自杀基因。
6.权利要求1至5的方法，其特征在于将灭活病毒或其部分、分离的抗原或抗原呈递细胞作为所述抗原。
7.权利要求6的方法，其特征在于将CMV，HBV，EBV，HIV，HSV及HCV作为病毒而应用。
8.权利要求1至7的方法，其特征在于在IL-2存在时培养激活CTLs2至30天后，用所述载体感染细胞，再在IL-2存在时培养细胞2至4天，然后根据标记基因选择CTLs。
9.权利要求8的方法，其中选择CD8+CTLs。
10.一种包含有至少两种直接针对病毒抗原的不同表位的、并能由权利要求1至9的方法获得的CTL克隆的治疗组合物。
11.权利要求10中组合物在制备免疫调节治疗剂中的应用。
全文摘要
一种通过将含T细胞的细胞制备物与抗原共孵育和分离抗原特异性CTLs来制备抗原特异性细胞毒T细胞(CTLs)的方法,其特征在于:i)通过与抗原共孵育激活细胞制备物中的CTLs的增殖;ii)选择性将载体转运增殖的CTLs,所述载体含有标记基因,借此基因可将标记和未标记细胞分离;iii)依据所述标记基因分离转染的抗原特异性CTLs,该方法可应用于免疫调节。
文档编号A61K48/00GK1174506SQ94195140
公开日1998年2月25日 申请日期1994年5月16日 优先权日1994年5月16日
发明者C·波迪农, F·马维力奥 申请人:曼海姆泊灵格股份公司