专利名称：细胞毒t淋巴细胞应答的诱导的制作方法
背景技术：
本申请引入Syamal Raychaudhuri和William H.Rastetter的未决的美国序列08/919,787号(1992年7月24日提交)和美国序列07/735,069号(1991年7月25日提交)的全部内容(现在已放弃)作为参考，其题目均为“细胞毒T淋巴细胞应答的诱导”。本发明涉及在人、家养动物或农业动物中诱导细胞毒T细胞介导的应答的方法和组合物。
据信在对各种病毒感染和肿瘤或癌症生长应答的过程中，细胞毒T淋巴细胞(CTL)是宿主主要的防御机制。这些细胞是通过识别与被感染或转化的细胞上不同分子(称作MHCI类分子)相关的抗原片段而清除掉被感染或转化的细胞。利用特定细胞中载有某种可溶性抗原的细胞质可对CTL进行实验性诱导。通常单独应用可溶性抗原不足以诱导特异性的细胞毒T淋巴细胞。
一种可以诱导CTL应答的方法包括重组工程技术的应用，以把上述抗原的关键组分掺入到良性感染剂的基因组中。这一策略的目的是通过使宿主产生适度的、自限性感染而对所需的表位产生抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞。可应用牛痘、脊髓灰质炎病毒、腺病毒和逆转录病毒以及细菌(如利斯特菌和BCG)作嵌合载体。例如，Takahashi等在美国国家科学院院刊85，3105，1988中指出用表达HIV gp160被膜基因的重组牛痘作为诱导细胞毒T淋巴细胞的有力手段。
可诱导细胞介导的应答的第二种方法涉及佐剂的应用。尽管本领域对佐剂的应用进行了充分的讨论，但对应用佐剂是否诱导细胞介导的免疫及这种细胞介导的免疫是否包括细胞毒T淋巴细胞应答还不清楚。下面列出了本领域内的几种代表性出版物。
Stover等在自然351，4561991(不作为本申请的现有技术)描述了用含有β-半乳糖苷酶基因的重组BCG诱导对β-半乳糖苷酶的CTL应答。用不完全弗氏佐剂和β-半乳糖苷酶不能诱导这种应答。
Mitchell等在临床肿瘤学杂志8，856，1990(不作为本申请的现有技术)描述了六周内五次施用一种叫做“DETOX”的佐剂和同种黑色素瘤裂解物治疗转移了的黑色素瘤患者，发现少量患者的细胞毒T淋巴细胞增加。作者指出需要提高细胞毒T淋巴细胞的生产水平，并且建议用佐剂和IL-2联合治疗并用环磷酰胺进行预处理以减少可能存在的肿瘤特异性T抑制细胞的水平。DETOX包括来源于明尼苏沙门氏菌的减毒内毒素(单磷酰脂A)、草分枝杆菌的细胞壁骨架、角鲨烯油和乳化剂。
Allison和Gregoriadix在Immunology Today 11，427，1990(不作为本发明的现有技术)指出人类疫苗中“容许使用”的唯一佐剂是铝盐(矾)，它并不持续引发细胞介导的免疫。Allison和Gregoriadis指出“因此，需要开发一种佐剂，这种佐剂具有弗氏完全佐剂的效力但没有它的各种副作用，如肉芽肿”。它们继续指出，存在三种可能的方案，例如利用脂质体；利用被称作免疫刺激复合物(ISCMs，包括皂角苷或Quil A(有两个糖链的三萜类化合物)、胆固醇和磷脂酰胆碱)的佐剂，这些佐剂被容许用于马的流感疫苗(Morein等，ImmunologicalAdjuvants and Vaccines，Plenum Press，153)；利用角鲨烯或角鲨烷(有或无Pluronic剂)和胞壁酰二肽(MDP)乳剂(SAF)。尽管“长期以来认为抗原亚单位不能引发细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答，但据说SAP可引发细胞免疫”。
Takahashi等在自然344，8731990中描述了用ISCOM对小鼠进行单次皮下免疫可诱导MHC II限制的辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞产生。他们指出弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和磷酸盐缓冲液对他们所感兴趣的靶物不诱导细胞毒T淋巴细胞活性。与其它外源性可溶蛋白抗原的结果相反，用利用了ISCOM的完整外源性蛋白进行免疫，可以激发抗原特异性MHC I限制的CD8+CD4-CTL。他们也指出所描述的实验表明了用含HIV蛋白的ISCOM可诱导人类的CTL，基于ISCOM的疫苗可通过纯化蛋白达到既诱导CTL又诱导抗体产生这一长期寻求的目标。
Byars和Allison在疫苗5223，1987中描述了SAF-1的应用，包括吐温80、PLURONIC L121和角鲨烯或角鲨烷，带有或不带有胞壁酰二肽，他们的数据显示有胞壁酰二肽的制剂可用于人用和兽用疫苗。佐剂的加强注射(booster shot)中没有胞壁酰二肽。据说胞壁酰二肽可明显增强抗体的产生，所以佐剂中没有它。通过皮肤试验以迟发型超敏反应测量细胞介导的免疫，以确定辅助性T细胞的产生。当佐剂中存在胞壁酰二肽时，这种超敏反应变得更强烈更持久。Allison等也用了同样的佐剂，美国专利4770874(其中指出胞壁酰二肽和普卢龙尼克多聚醇是对白蛋白产生强大细胞免疫应答和体液免疫应答的本质)；Allison等，美国专利4772466；Murphy-Corb等科学2461293，1989(其中指出佐剂和胞壁酰二肽合用可同时增强免疫应答中的细胞免疫和体液免疫)；Allison和Byars等疫苗8756，1987(其中指出由SAF(包含有胞壁酰二肽)诱导的细胞免疫可通过这些显示迟发超敏，T细胞对抗原的增殖反应，IL-2的产生，载有免疫抗原的靶细胞的特异性遗传学限制性裂解)；Allison和Byars，传染性疾病的免疫药理学非特异性限制的疫苗佐剂和调节剂191-201，1987；Morgan等，医学病毒学杂志2974，1989；Kenney等，免疫学杂志121157，1989、Allison和Byars，免疫学方法95157，1986(其中显示铝盐和矿物油乳剂可增强抗体产生而不增强细胞免疫；胞壁酰二肽制剂诱导细胞免疫)；Byars等，疫苗849，1990(不作为本发明的现有技术，其中指出他们的佐剂可明显增强对流感血胶精抗原的体液应答，低程度地增强细胞介导的反应)；Allison和Byars，分子免疫28279，1991(不作为本发明的现有技术，其中指出胞壁酰二肽的功能是诱导细胞因子的表达和增强主要组织相容性(MHC) 基因的表达；与其它的佐剂相比，可获得较好的抗体和细胞应答，希望确定同样的方案是否对人有效)；Allison和Byars，疫苗研制中的先进技术401，1988(其中描述用SAF介导细胞免疫)；Epstein等，新药评论(Advame drug deliveryReviews)4223，1990(其中对疫苗制备中应用的不同佐剂进行了评述)；Allison和Byars，免疫学方法杂志95157，1986(其中指出佐剂中加入胞壁酰二肽可显著增强对不同抗原产生的细胞免疫应答，抗原包括单克隆免疫球蛋白和病毒抗原)；Morgan等，医学病毒学杂志2974，1989(其中描述了用SAF-1为Epstein-Barr病毒制备疫苗)。
Kawk等，生物学和医学中的个体型网络，Elsevier科学出版社，p163，1990(不作为本发明的现有技术)指出，用不含胞壁酰二肽的SAF作为人类B细胞淋巴瘤基因型的佐剂，特别地，普卢龙尼克L121、角鲨烷和含0.4％吐温80的磷酸盐缓冲液的乳化剂与个体型一起应用。他们指出“佐剂的加入应进一步增强…体液应答，用样也利于诱导细胞应答”。
其它的免疫制剂包含脂质体(Allison等，美国专利4053585和4117113)；环肽(Dressman等，美国专利4778784)；完全弗氏佐剂(Asherson等，免疫学22465，1972；Berman等，国际癌症杂志2539，1967；Allison，免疫增强1873，1973；Allison影响宿主抗性的非特异性因素247，1973)；ISCOM(Letvin等，疫苗87209，1987)；含有矿物油，表面活性剂和吐温80形成的非离子嵌段聚合物的佐剂(Hunter和Bennett，免疫学杂志1333167，1984；Hunter等，免疫学杂志1271244，1981)；由矿物油和乳化剂组成的佐剂，含有或不含有灭活的分支杆菌(Sanchez-Pescador等，免疫学杂志1411720，1988)；及其它的佐剂，如胞壁酰二肽的亲脂性衍生物，与重组蛋白质共价结合的胞壁酰二肽(同前)。
发明概述申请人发现了一种安全、便利的方法和组合物，这种方法和组合物可在人和家养动物或重要的农业动物中诱导CTL应答。该方法应用了对动物毒性小或无毒、缺乏免疫刺激性肽(如胞壁酰二肽)的抗原制剂，免疫刺激性肽的存在会降低所希望的细胞应答。此外，方法学应用简便，不需要利用DNA重组技术对细胞进行改变使之更具抗原性这样大量的体内工作。因为末料到象这样不含免疫刺激性肽或其类似物的抗原制剂可诱导CTL应答，所以该发现是令人惊讶的。申请人发现这种抗原制剂所应用的疾病状态很广泛或可用作预防剂。例如，这种抗原制剂可用于治疗象HIV感染或流感这样的病毒性疾病，其中CTL应答非常重要；也可扩展应用于细菌性感染、癌症、寄生虫感染等的治疗。作为预防剂，该抗原制剂和合适的抗原联合可用于预防引起上述病毒性疾病病毒的感染，尤其是HIV感染，也可用于象原发肿瘤切除后这样易患肿瘤者的预防。
因此，本发明首先涉及一种诱导人、家养动物(例如猫和狗)或重要的农业动物(例如马、牛或猪)对除B细胞淋巴瘤抗原或卵白蛋白之外的抗原产生CTL应答的方法。该方法包括的步骤是提供CTL应答所需的抗原，提供一种非毒性的抗原制剂，这种制剂包含稳定化去污剂、胶束形成剂和生物可降解和可相容的油，或由它们所组成或基本上由它们所组成。该抗原制剂优选缺少任何免疫刺激性肽或含有肽的部分水平足够低，从而不降低所需的细胞应答。这种制剂优选的是稳定的水包油乳化剂。也就是说，选择每一不同的组分使乳剂保持在乳化状态而没有相分离的时间至少是一个月，优选超过一年。该方法中抗原和抗原制剂混合形成混合物(优选微流体化的)，以足以在动物体内诱导CTL应答的量施用给动物，只需施用1次。
“稳定化去污剂”是指可使乳剂保持在稳定状态的去污剂。这种去污剂包括多山梨醇酯(polysorbate)80(吐温)(山梨聚糖-单-9-十八烷酸-聚(氧-1，2-乙二基)；ICI Americas制造，WilmingtonDE)，吐温40、吐温20、吐温60，两性洗涤剂(Zwittergent)3-12，替波尔HB7，Span 85。这些去污剂通常的用量是约0.05％～0.5％，优选0.2％。
“胶束形成剂”是指可使与其它组分形成的乳剂稳定，从而形成一种胶束结构的药剂。这种药剂优选在注射部位能引起刺激以聚集增强细胞应答的巨噬细胞。该种药剂的例子包括BASF Wyandotte出版物中描述的聚合表面活性剂，例如Schmolka，J.Am.Oil.Chem.Soc.54110，1977和Hunter等，免疫学杂志1291244，1981，在此引入作为参考，普卢龙尼克(PLURONIC)L62LF、普卢龙尼克L101、普卢龙尼克L64、聚乙二醇1000和季酮(TETRONIC)1501、季酮150R1、季酮701、季酮901、季酮1301、季酮130R1。本领域中已熟知这些药剂的化学结构。正象Hunter和Bennett指出的，优选亲水-亲油(HLB)平衡值为0-2的药剂，免疫学杂志1333167，1984。药剂的量优选在0.5％-10％，最优选的量为1.25-5％。
所选用的油用于保持水包油乳剂中的抗原，即为所需的抗原提供一种赋形剂，并且优选熔点低于65℃的，这样无论在室温(大约20℃-25℃)还是在低于室温的情况下都能形成乳剂。这样的油包括角鲨烯、角鲨烷、二十烷(EICOSANE)、四四十烷(tetratetracontans)、甘油、花生油和其它的植物油。油的量优选在1-10％，最优选2.5-5％。油的生物可降解性和生物相容性非常重要，这样在一段时间内机体可把油降解，从而确保不引起象肉芽肿这样的副作用。
上述制剂重要的一点是不含有肽组分尤其是不含胞壁酰二肽(MDP)。如果对每个人施用的普通制剂中所含的量超过20μg，这样的肽就会干扰CTL应答的诱导。尽管它们对免疫系统中体液部分有明显的刺激作用，但仍然优选这些肽在抗原制剂中完全缺如。也就是说，申请人发现尽管这些肽可提高体液应答，但是当需要细胞毒T淋巴细胞应答时它们是不利的。
其它相关的方面是，这种抗原制剂仅由上述三组分中的两个组成，与任何一种卵白蛋白(或其它白蛋白，如HSA、BSA和卵清蛋白)外的所需抗原(包括蛋白质、多肽和它们的具有免疫原性的片段)一起应用可在动物和人中诱导CTL应答。
申请人确信上述制剂用于人时比先前的制剂(包括ISCOM、DEToX和SAF)有明显的优势。与其它制剂不同，该制剂既含有胶束形成剂又不含有肽，细胞壁骨架或细菌的细胞组分。该制剂可诱导先前制剂所不能诱导的CTL应答或与它们相比诱导的强度明显增强。
“非毒性”指在动物和人的治疗中发现该抗原制剂无毒或毒性很小。本领域的技术人员将会发现这一术语的意义很广泛，例如，对于基本健康的动物或人只能耐受轻微的毒性，而对于患有免疫性疾病的人则基本上能耐受较大的毒性。
优选的实施方案是，抗原制剂基本上由去污剂、药剂和油中的两或三种组成；方法基本上由混合物(抗原和抗原制剂)对人或动物施用一次构成；人或动物被病毒感染和患有病毒感染引起的一种或多种症状(通常由相关领域的医生确诊)；抗原制剂对人或动物无毒。
其它优选的实施方案是，抗原选自下列抗原的抗原性部分HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和ReV；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；乙型肝炎表面抗原Pre-S1、Pre-S2、HBc抗原和HBe抗原；流感抗原HA、NP和NA；甲型肝炎表面抗原；疱疹病毒抗原EBV gp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物，人类乳头瘤病毒抗原(例如，HPV抗原，如L1、E4、E6、E7抗原，尤其是从HPV16和18来源的E6和E7，它们是与宫颈癌相关的两种最普通型HPV，从HPV6和11来源的E4和L1它们是与尖锐湿疣相关的两种最普通型HPV；前列腺特异性抗原(PSA)，巨细胞病毒gB，巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒；F蛋白、G蛋白和N蛋白；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97和癌Neu癌基因产物、癌p53基因产物和叫做MAGE的黑色素瘤抗原及在不同的恶性肿瘤中存在的突变p21 ras蛋白。
在相关的方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包括与上述抗原制剂混合的一种抗原，或由其或基本上由其组成，该抗原选自上面列出的抗原性部分。
在其它相关的方面，本发明涉及了一种通过施用组合物治疗患者的方法，该组合物中含有与上述抗原制剂混合的合适抗原(例如选自上面列出的抗原)，患者被HIV病毒感染、患有疟疾、流感、肝炎、癌症、被疱疹病毒感染、患有宫颈癌、尖锐湿疣(生殖器的疣)或感染了呼吸道合胞病毒。这些抗原和治疗方法仅仅是在抗原制剂中可应用抗原的一些示例。
本发明的其它特征和优点将在下面的优选实施方案和权利要求中进一步说明。
优选实施方案的描述首先对附图进行简要描述。
附1A-1C和4A-4C是对不同卵白蛋白制剂诱导CTL应答时进行比较的数据图；在所有的图中ET代表效靶比例。
图2A和2B是对不同β-半乳糖苷酶制剂诱导CTL应答进行比较的数据图；图3是对脂质体中卵白蛋白和抗原制剂中卵白蛋白诱导CTL应答时进行比较的数据图；图5和6是观察CD4、CD8细胞耗竭对诱导CTL应答的影响时的数据图；图7是gp120诱导CTL时的数据图；图8中抗原和吐温、普卢龙尼克混合诱导CTL时的数据图；图9是抗原和角鲨烷、普卢龙尼克混合诱导CTL时的数据图；
图10是抗原和角鲨烷、普卢龙尼克混合诱导CTL时的数据图；图11表现了卵白蛋白和不同抗原制剂对CTL应答的影响；图12是用不同的抗原制剂在猴子中诱导抗-gp120 IIIb抗体的图；图13表现了用佐剂中可溶性E7蛋白免疫一次后，第10天后对HOPE2细胞的抗肿瘤活性；
图14表现了用佐剂中可溶性E7蛋白免疫2次后，第10天和第19天对HOPE2细胞的抗肿瘤活性。抗原制剂该发明中应用的抗原制剂已由前述。该领域中的普通人员将会认识到很易制备同样的制剂，也可预料到在诱导CTL应答时具有同等的特性，应用下面例子中讲述的相同技术很容易对这些制剂的特性进行检测。
本发明的下列例子中应用的抗原制剂(AF)包括大约2.5％的角鲨烷，5％的环氧乙烷酸和吐温80，它们用磷酸盐缓冲液配制。特别地，AF乳化剂包括每1mL pH7.4的水中含15mg角鲨烷，37.5mgPoloxamer 401(普卢龙尼克L121)，6mg多山梨醇酯80(吐温80)，0.184mg氯化钾，0.552mg一代磷酸钾，7.36mg氯化钠，3.3mg二代磷酸钠(脱水)。用常规的技术进行微流体化(微流体仪110F型)，背压量为11-14,000psi，逐渐降到常压，在冰浴中冷却，包裹。
其它的例子中，抗原与微流体化的角鲨烷(S)，普卢龙尼克(P)和吐温(T)的混合物混合，终浓度分别为吐温800.2％，普卢龙尼克1.25％，角鲨烷5％。为了测定子组分在抗原特异性免疫应答诱导中的必要性，角鲨烷-吐温80，普卢龙尼克-吐温80或角鲨烷-普卢龙尼克以同样的浓度配制。分别制备普卢龙尼克、角鲨烷或吐温80以检测单体组分在CTL应答中的作用。在卵白蛋白系统中用吐温20、吐温40或两性去污剂代替吐温80，以检测不同的吐温衍生物在CTL诱导中的作用。同样用Eicosore或Triacontone代替三组分制剂中的角鲨烷，用聚乙二醇1000，普卢龙尼克L62LF和Tetronics 1501和150R，代替复合环氧乙烷-环氧丙烷聚合物(普卢龙尼克)。作为两个组分制剂不同的类似物进行多样组合以测定其对ova特异性CTL的诱导。它们是胆固醇-吐温80，角鲨烷-吐温80，鲨肝油烷-吐温80或橄榄油-吐温80。为了进行稳定性研究，角鲨烷-吐温80流体化的混合物与终浓度为5％的右旋糖混合。全过程中赋形剂在微流体仪中混合以形成稳定的乳剂。在一些实验中，两组分的制剂和不同浓度的MDP混合诱导CTL和体液应答。表1是对本研究中应用各种制剂的综合概括。
表1三或两组分系统中各种替代物的效果三组分制剂中的替代物在E∶T 100∶1下的杀伤率STP 84吐温40(T) 66吐温20(T) 48T1501(P) 0T150R1(P) 0普卢龙尼克L62LF(P)47二十烷(S) *聚乙二醇 *Triacontane(S)*两性去污剂(T) *两组分制剂中的替代物ST76PT45SP26胆固醇+吐温80 0角鲨烷+吐温29(T) 65鲨肝油烷+吐温80 42橄榄油+吐温80 69一组分制剂普卢龙尼克L1210角鲨烷0吐温800角鲨烷+吐温80+5％右旋糖 86*重复进行CTL分析Syntex佐剂制剂(微流体化；SAFm)作为佐剂对照，它包括两部分。第一部分包括磷酸盐缓冲液，其中含终浓度为5％的角鲨烷、1.25％的普卢龙尼克、0.2％的吐温80(赋形剂或1-SAF)。第二部分包括一种分支杆菌的细胞壁成分N-2-酰胞壁酰-L苏氨酸-D异亮氨酸胺。抗原和微流体化的赋形剂(第I部分)混合得到同源性的乳化剂以用于免疫。添加MDP配制成SAFm并进行简单地旋涡搅拌。如果诱导CTL有最佳浓度的话，混合物中MDP的浓度依情况而定。作为佐剂对照，也要用按照厂家工艺与矾混合的可溶性抗原(Pierce Chemical，Rockford，IL)或用完全弗氏佐剂(CFA)对小鼠进行免疫。
这种抗原制剂用于诱导小鼠的细胞毒T淋巴细胞应答。本领域的普通技术人员将认识到，这种小鼠模型可表明在人、家养动物或农业动物中应用同等的实验或治疗也同样能诱导细胞毒T淋巴细胞应答。诱导所需细胞应答时，抗原制剂的量和抗原的量可不经预实验而由本领域一般技术人员所熟知的常规方法，凭经验确定。因此如果希望这种混合物治疗时副作用最小，技术人员就会确定出给人、家养动物或农业动物应用时能诱导细胞毒T淋巴细胞应答的最低水平，因此对所希望的抗原产生免疫力。通常情况下，混合物可用任何一种常规的方法注射应用，但特别优选在局部进行肌肉注射，这样乳剂可在几天或几周内保持在稳定状态。方法若无其它注释，下面列出的例子中应用以下材料和方法小鼠C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)雌性小鼠，购于HarlenSpragne(San Diego，Califrnia)。
抗原卵白蛋白(ova，VII级，西格玛(Sigma)化学试剂公司，St.Lonis，Mo)以天然状态应用。β-半乳糖苷酶(β-gal，VIII级；BRL)在1M NaOH中煮2分钟进行碱消化后以天然状态应用。重组gp120购自美国生物工程公司。
肿瘤细胞和转染子应用的肿瘤细胞系是Ia-系EL4(C57BL/6，H-2b胸腺瘤)和P815(DBA/2，H-2d肥大细胞瘤)。先前Moore等于细胞54，7771988描述了ova-表达EL4转染子的衍生物EG7-ova。β-gal表达转染子P13.1是107P815细胞与10mg Pst I-线性化了的PCH 110(PharmaciaLKB生物工程技术公司，Piscataway，NJ)和1mg Pvu I线性化了的PSv2neo(Southern等，J.Mol.Appl.Genes.1327，1982)在1ml的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行电穿孔，随后在400μg/ml的抗生素G418中进行筛选的产物。C3-4转染子是通过转化编码与IgM重链的第3、4个外显子融合的β-gal基因的质粒而从BALB/c杂交瘤IgM662诱导的。(Rammensee等，免疫遗传学30，2961989)。表达gp160 IIIb的3T3成纤维细胞15-12由NIH的Dr.Germain提供(Bethesda MD)。Kb转染的L细胞系由澳大利亚，Monash大学的Dr.Carbone提供。Dd和Ld转染的L细胞系由St.Louis华盛顿大学的Dr.Ted Hensen提供。
免疫如Moore等同上和Carbone等(实验医学杂志169603，1989)所述，在胞浆负载后用200μl 25×106的脾细胞悬液静脉内对小鼠进行免疫。ova-抗原制剂或β-gal抗原制剂免疫时，每只鼠足垫或尾根部皮下注射时每种蛋白抗原30μg。每次注射包括67μl的微流体化的抗原制剂(按常规程序制备)和30μg的蛋白抗原，终体积为200μl。终体积与HBSS一起配制，参照Whittaker手册(Welkerstille，MD)。MDP的浓度为0-300μg。需要指出的是用溶于CFA或矾中，终体积为200μl的可溶于抗原对小鼠进行免疫。
效应物的体外刺激从正常鼠或至少14天前已接触过抗原的免疫鼠中获取的脾细胞(30×106)与1.5×106的EG7-ova(用2000 rad，放射性照射)或1.5×106C3-4细胞(用2000 rad放射线照射)在24孔板中，37℃，7％ CO2/空气的条件下培养，以进行ova应答或β-gal应答。所有的组织培养均在含IMDM培养基的完全培养基中进行，参照Whittaker手册(Welkersville，MD)补充10％的胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺、庆大霉素和2×10-5M2-巯基乙醇。体外进行耗竭实验时，体内启动或体外刺激的脾细胞用单克隆抗体(mAbs)RL.172(抗CD4)或mAbs 3.168(抗-CD8)处理，以去除CD4+或CD8+细胞(Sarmiena等，免疫学杂志1252665，1980和Cereding等，自然3498，1985)，mAb RL.172和mAb 3.168由CA.LaJoua，Scripps临床和基础研究所的Dr.Joanthan Sprent赠送。细胞毒性分析靶细胞(1×106)用100μCi[51Cr]铬酸盐标记60分钟。为了让肽与靶细胞结合，在靶细胞标记51Cr的时候，加入50μl 1mg/ml溶在HBSS中的肽。洗涤以后，104标记的靶细胞和系列稀释的效应细胞在200μlRP10中37℃培养4h。吸取100μl的上清液，按下面公式计算特异性杀伤特异性杀伤的百分率＝100×{(CTL释放-自然释放)/(最大释放-自然释放)}。在所有的实验中，在无细胞毒T淋巴细胞(CTL)时由去污剂所引起的自然释放＜最大释放的25％。
小鼠和猴子中抗体应答的检测96孔板的每一孔在U形板底(Costar，Cambridge，MA)覆盖着50μl溶于HBSS的ova或gp120 150ng，培养过夜。为了检测小鼠中抗-gp120和抗-ova抗体的应答，用1％ BSA封闭板1h。每孔加入25μl系列稀释的血清，培养2hrs。洗板，每孔加入50μl在1％ BSA中1∶1000稀释的联有HRPO的羊抗鼠IgG。培养1h后，洗板，每孔加入100μl的底物，10到15分钟后测OD450值。用于检测猴抗gp120抗体的应答时，除用Hank’s平衡盐溶液配制的5％普通羊血清封板和稀释血清外，所有的步骤均相同。
肽的合成按照卵白蛋白(ova 253-276)的氨基酸序列253-276(SEQ IDNo.1EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER；这里所应用的一个标准字母代表每一氨基酸)，鞘磷脂基质蛋白(MBP 84-102)的氨基酸序列84-102(SEQ ID No.2DENPWHFFKNIVTPRTPP)合成的肽，和按照gp120 IIIb的氨基酸序列308-322(18IIIb序列)合成的肽用实用生物系统430A合成仪，通过固相肽合成进行装配。通过预先形成的对称酐与额外的天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸连结形成羟基苯三唑酯。联结效率参照Kaister等的方法(生化年刊34595，1970)由茚三酮反应控制。随着Tam等在美国化学协会杂志216442，1983所描述的“低-高”过程，肽与HF从支持物中释放，用10％乙酸乙酯从树脂中提取肽。冷冻干燥后在Sephadex G-25柱上对肽进行脱盐，接着样品肽经Vydame制备C-18柱，通过反相色谱进行HPLC纯化。纯化的肽(98％)溶于HBSS中，终浓度为1mg/ml，在完全培养基中稀释到所需的浓度。
溴化氰消化用100倍克分子的溶在100mM三氟乙酸中的过量溴化氰处理蛋白质样品(例如β-半乳糖苷酶)。在室温(大约20℃)，搅动的情况下，反应可超过18小时。前述反应时间作用完之后，用SEP-PAK C-18仪(Waters)从反应物中分离肽片段，用95％的乙腈洗脱，冷冻干燥。
碱消化蛋白样品(例如β-半乳糖苷酶)用1N NaOH处理，煮2分钟，用C-18 CEP-PAK仪(Wasters)分离所得的肽片段，用95％的乙腈洗脱并进行冷冻干燥。实施例1受MHCI类分子限制的CTL的启动Moone等在UCLA Symp.Mol.Cell.Biol.113，1989和Carbone与Bevam于实验医学杂志171377，1990。指出用胞浆中载有可溶性ova的脾细胞免疫小鼠，可诱导ova-特异性I类分子限制的CTL应答。用表达ova的EL4转染子EG7-ova体外刺激体内已与抗原接触了的脾淋巴细胞并且用作ova-特异性CTL介导杀伤作用的靶物。该研究也证明，由EG7-ova转染子或胞浆中载有ova的脾细胞诱导的CD8+效应物识别遗传背景为H-2Kb的肽ova-258-276定位的抗原决定簇，分解EG7-ova并且杀伤被有ova-258-276的EL4细胞。因此，为了确定可溶性抗原是否可诱导内源性I类分子限制的CD8+T细胞途径，应用上述系统以检测某种抗原制剂是否可把可溶性抗原带入I类分子限制的途径。
a)ova用含有或不含有抗原制剂的不同量ova(每只小鼠30μg-1mg)，皮下或尾根部注射一次免疫C57BL/c小鼠。至少免疫2周以后，取免疫小鼠的脾细胞，用EG7-ova转染子进行体外刺激。ova在30μg的低浓度与1mg时同样有效。因此，CTL的研究中常用30μg ova所免疫鼠的脾细胞，与EG7-ova体外培养5天后通过能裂解EG7-ova的ova-特异性效应物的存在来评价其诱导能力。
用高达1mg溶于HBSS的可溶性抗原给小鼠注射，并没有CTL启动。(图1A)。但是用30μg溶在上述抗原制剂(图中以AF表示)中的ova免疫小鼠则产生显著的转染子特异性CTL应答(图1C)。并且，ova-AF免疫的脾细胞对EG7-ova的杀伤程度与用载有ova的脾细胞免疫小鼠的脾细胞的杀伤程度进行了比较(图1B)。
当用EG7-ova体外刺激的时候，β-半乳糖苷酶免疫小鼠脾淋巴细胞没有显示第二次CTL应答，说明体内CTL启动的特异性是Ag特异的。没有发现ova-诱导ova特异性CTL。
b)β-半乳糖苷酶用另外一种可溶性抗原β-gal也得到相似的结果。为了测定β-gal特异性CTL的应答，用来源于BALB/c的表达β-gal的C3-4转染子作靶物。用可溶性β-gal免疫BALB/c产生轻微的CTL应答。因此为了检测特异性的CTL应答，至少要达到8周才能收集脾淋巴细胞，在受照射的C3-4转染子的存在下培养5天。
图2B表明，溶于AF的30μg β-半乳糖苷酶可对转染子诱导强烈的特异性CTL应答。效靶比(E∶T)为3∶1时，β-gal-AF免疫的小鼠显示出大约80％的特异性C3-4杀伤。但是从溶于HBSS中的β-gal免疫的小鼠分离到的效应物，以同样的效靶比对相同靶物的杀伤仅达20％。因为EL4和P815均不表达MHCII类基因产物，并且裂解具有同系限制性，所以ova和β-gal的特异性效应物是MHCI类分子限制的。
为了检测抗原制剂的效用，用包埋在2型脂质体中的可溶性抗原免疫小鼠，其中一种是pH敏感性脂质体。一周以后，按前述的方法体外刺激脾细胞，并且用51Cr标记的EG7-ova或EL4进行检测。图3给出的代表性结果表明脂质体中的ova不能启动小鼠进行基本的CTL诱导。当ova溶在矾中进行免疫时可得到类似的结果。实施例2CTL对表位的识别Carbone和Bevan，同上证实，用EG7-ova转染子和胞浆载有ova的脾细胞免疫C57BL/6小鼠，诱导的CTL可识别被有ova 258-276表位的EL4细胞。为了检测是否AF中的可溶性卵白蛋白也诱导同样的CTL应答，从免疫鼠制备脾细胞，体外用EG7-ova刺激效应物对被有ova 258-276肽或被有从髓磷脂碱性蛋白(MBP 84-102)分离出的对照肽的EL4细胞的作用进行检测。结果证明，ova-AF启动的CTL和由转染子或胞浆载有ova启动的CTL具有相似的效果。(图1A、1B和1C)。ova-AF启动的效应细胞有效的裂解EG7-ova和每108细胞被有50μgova肽的未转染的EL4细胞，但并不裂解包被有10μg MBP肽/108细胞的EL4细胞。
Carbone和Beran同上指出在β-半乳糖苷酶系统表达β-gal的转染子和胞浆有可溶性β-gal的脾细胞诱导的CTL，可裂解表达β-gal的转染子和被有碱消化β-gal未转染的P815细胞。当可溶性β-gal在AF中进行免疫时所诱导的CTL具有同等的特异性。(图2)。实施例3CTL效应物为CD8+T细胞下面显示了在AF中的可溶性抗原诱导CD8+效应性T细胞。从免疫鼠获得的脾细胞与放射线照射的转染子体外培养5天。此后，收集细胞用抗CD4或抗CD8的单克隆抗体和补体来耗竭CD4+或CD8+T细胞。然后耗竭群体在ova系统中对51Cr-EG7-ova进行检测或在β-gal系统中对51Cr-P13.1进行检测。图4的结果显示，在ova系统中整个效应细胞群证实CD8+T细胞的耗竭终止了细胞裂解活性，但是，CD4+T细胞的耗竭对EG7-ova的裂解没有任何影响。
同样在β-gal系统中，CD8+T细胞的耗竭终止了β-gal-抗原制剂免疫脾细胞的细胞裂解活性。实施例4AF中的可溶性ova启动CD8+T细胞为了证明ova-AF体内启动CD8+T细胞群，且在体外的第二次应答中具有限制性，把CD4+或CD8+细胞群从ova-AF免疫鼠和正常小鼠的脾细胞中耗尽。接着，经这样处理的群体体外单独与EG7-ova或与ova-AF免疫鼠的CD4+和CD8+T细胞一起或与ova-AF免疫鼠的CD4+或CD8+T细胞与正常鼠的CD4+或CD8+细胞的不同组合一起进行激活。图5显示启动CD8+细胞对于证实体外的第2次CTL应答是必要的。这些数据同样显示体外有效的第2次CTL应答需要CD4+T细胞，启动不需要CD4+T细胞。同样，体外β-gal特异性第2次CTL应答也需要CD8+T细胞。
上述例子证实了抗原制剂对可溶性蛋白抗原诱导产生I类分子限制的CTL应答的效果。抗原制剂介导可溶性抗原诱发CTL启动，并且与转染子和胞浆载有可溶性ova或β-gal脾细胞诱导的具有相似的活性。在卵白蛋白系统中，EG7-ova，胞浆载有ova的脾细胞和ova-AF包括(a)I类分子限制的CD8+CTL；(b)CTL识别经ova 253-276合成肽敏感化了的靶物；(c)仅一次免疫后，有长时间存活的CTL。在β-半乳糖苷酶系统中，β-gal-AF诱导的CTL识别β-gal表达的转染子C3-4，也识别经碱消化β-gal敏感化了的未转染P815细胞。这与用胞浆载有β-半乳糖苷酶的脾细胞进行免疫诱导的CTL相似。AF所诱导的ova-特异性CTL是独一无二的，因为包在pH敏感的脂质体中或在矾中的ova均不能在体内诱发CTL启动。
这些实施例表明，上面应用的AF和它的等同物在人类治疗和在各种癌症，病毒性疾病诱导CTL疫苗的研制中是有益的。实施例5这是一展示上述AF在HIV可溶性gp120诱导I类分子限制性CTL启动的特殊实施例。
gp160 IIIB表达细胞系(15-12)是Balb/c成纤维细胞分化的3T3细胞系产生的。它是从Bethesda，M.D.国家健康研究所的Ron Germain和Jay Berzofsky博士得到的。gp160 IIIB表达细胞系用于体外激活已在体内接触抗原的脾淋巴细胞并在gp160特异性CTL的诱导中作靶物。用10μg含或不含有AF的gp160 1次免疫Balb/c小鼠，在足底和尾根部注射。免疫2周后取免疫鼠的脾细胞，体外用放射线照射过的gp160转染子刺激，培养5天后，通过具有裂解gp160转染子而不裂解未转染细胞系这样的异效应物的存在来评价启动效应。图7列出了结果，AF和gp120促进了CTL应答。
下面的实施例展现了仅用该发明一或二部分抗原制剂的应用。这些实施例证明仅用上述三组分中的两组分就可诱导CTL应答。实施例6诱导CTL所必需的关键组分的确定为了检测上述提到的所有组分是否都是抗原特异性CTL的诱导所必需，用上述AF三组分中不同2组分组合的微流体化制剂的卵白蛋白免疫小鼠。应用的2组分组合如下角鲨烷/吐温溶于PBS，角鲨烷/普卢龙尼克溶于PBS或普卢龙尼克/吐温溶于PBS。另一套组别包括用在一部分系统中配制的ova免疫小鼠，也就是说PBS中仅有用鲨烷、普卢龙尼克或吐温。调整上述三组分抗原制剂，每次排除一组分，用PBS代替之。
上述的所述抗原制剂包含0.300g吐温80(Aldrich，WI)，1.875g普卢龙尼克L121(BASF，NJ)和7.5g角鲨烷(Aldrich，WI)，用PBS配成50ml。
2组分制剂为角鲨烷/吐温0.300g吐温80和7.5g角鲨烷，PBS配成50ml。
普卢龙尼克/吐温1.875g普卢龙尼克L121和0.300g吐温80，PBS配到50ml。
普卢龙尼克/角鲨烷1.875g普卢龙尼克L121和7.5g角鲨烷，PBS配到50ml。
接着通过微流体仪110T型，Microfluids公司，对样品进行处理，分装贮存在4℃备用。
称取卵白蛋白(Sigma，MO)用PBSS配成0.3mg/ml的溶液。该贮存液按下列数量与2组分制剂合并5份0.3mg/ml的卵白蛋白溶液，3.3份2组分制剂和1.7份PBSS。
制剂在冰上进行旋转搅拌直到注射，所有的溶液在注射前即刻合并。
每只鼠在双侧后足底注射含ova 30μl的制剂200μl，余留的溶液在尾根部皮下注射。2-4周后收集脾细胞。
免疫2周后制备脾细胞，用照射了的EG7-ova体外刺激。培养5天后通过测定4h内51Cr-EG7-ova或51Cr-EL4的释放来检测ova-特异性CTL的存在。图8-10列出的数据证明，微流体化的2组分系统中的卵白蛋白制剂可在体内启动ova特异性CTL。
我们又进一步评价了当与蛋白抗原合用时每一组分在它们诱导CTL能力中的相对作用。在免疫过程中，可溶性抗原与微流体化的赋形剂混合以得到颗粒大小长围为250～300μm的稳定同类乳剂。为了进一步确定角鲨烷-吐温80-普卢龙尼克(STP)制剂组分在诱导CTL中起到的作用，我们用角鲨烷-吐温80(ST)混合物，普卢龙尼克-吐温80(PT)混合物或角鲨烷-普卢龙尼克(SP)混合物中的ova免疫小鼠，用角鲨烷(S)，吐温80(T)或普卢龙尼克(P)中的ova作为对照(未免疫小鼠)。也用ova-SAFm(含70μg MDP)或ova-矾作为佐剂对照未免疫小鼠。作为阳性对照，用胞浆载有可溶性ova的脾细胞免疫小鼠。也可用其它结合和替代，结果见表1。
为了查明CTL启动过程，免疫小鼠1次。免疫2周后，脾细胞与放射线照射了的EG7-ova(ova表达的EL4细胞)混合5天，测验其对51Cr-EG7-ova或51Cr EL4细胞的作用。结果(图11)表明，30μg的ova与STP或ST联合应用，在小鼠体内启动I类分子限制的CTL应答。由STP中ova或ST中ova所启动的ova特异性CTL比胞浆载有可溶性ova的脾细胞诱导的要好。PT中或SP中的ova可在小鼠体内诱导ova-特异性CTL应答，但微弱且不持久，与SAFm不同，ST制剂中加入MDP在小鼠体内并不破坏ova-特异性CTL的诱导(表2)。当ova与单独组分S、P或T混合对小鼠进行免疫或用ova-SAFm或ova-矾免疫小鼠时，不诱导ova-特异性CTL。用高达1mg溶在(a)HBSS，(b)SAFm或(c)被矾吸收的ova免疫小鼠，不启动ova-特异性CTL。
表 2ST+MDP不阻断诱导ova-特异性CTL应答免疫小鼠的细胞毒百分率*ova-ST-MDP ova-ST-MDP刺激物 靶物**E-T ova-ST ova-ST 300μg小鼠 72μg小鼠EG7-ova EG7-ova 100∶1 0 10082 7633∶1 0 86 67 6211∶1 0 33 39 253∶10 6 13 31∶10 0 0 03∶10 0 0 0*用30μg不同制剂中的ova免疫小鼠**减去对抗原非表达细胞系的杀伤率来计算细胞毒百分率。实施例7产生ova特异性抗体的必要组分每间隔2周用30μg溶在HBSS、STP、ST、PT或SP中的ova免疫小鼠3次。因为已知SAFm能诱导强烈的抗体应答所以也用ova-SAFm作为阳性对照来免疫小鼠。第2次和第3次免疫以后7天，放血处死小鼠，血清用于ova特异性抗体应答的测验。结果如表3所示，结果表明用溶于STP、ST或SAFm中的ova免疫小鼠2次后，显现出相同的抗-ova应答。
表3抗-ova抗体应答的诱导30μg ova制剂/动物反应小鼠数/注射小鼠数1/血清稀释度HBSS 0/3 ＜1/20，＜1/20，＜1/20STP 3/3 ＜1/4860，＞1/4860，＜1/4860ST 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860PT NA NA NA NASP NA NA NA NASAF-M3/3 1/4860， 1/4860， 1/4860*NA未得到实施例8HIV gp120特异性CTL的诱导用HIV gp120 IIIB作为第二个抗原系统以检测其在STP、ST或MP-T中时对CTL的诱导能力。用1μg溶于HBSS、STP、PT或ST中的gp120 IIIb免疫小鼠。用1μg SAFm或CFA(完全弗氏佐剂)或含MPL(单磷酸脂A)和TDM(海藻糖二霉菌酸酯)的RIBI佐剂系统中的gp120 IIIb免疫小鼠作为对照。三周后，制备脾细胞，用丝裂霉素处理的转染子细胞15-12或用18 IIIb肽体外刺激。培养5天后，测验所获效应细胞对靶物牛痘gp160 IIIB或胃肠外牛痘感染的P815细胞的作用。结果表明是gp120-角鲨烷-吐温80制剂在小鼠体内诱导特异性CTL应答而并非gp120-角鲨烷-吐温80-普卢龙尼克或gp120-HBSS制剂。
表4 小鼠内gp120特异性CTL应答的诱导免疫小鼠的细胞毒百分率(％)*刺激物 靶物**E-T gp120-HBSSgp120-STgp120-STP18IIIb/IL2 vac∶gp120 100∶12342 NA***33∶1 2338 NA11∶1 0 0 NA3∶1 0 35 NA18IIIb/IL2 15-12 100∶10 50 033∶1 0 35 011∶1 0 27 03∶1 0 18 018IIIb/IL2 3T3+18IIIb 100∶10 59 1333∶1 0 59 211∶1 0 57 03∶1 0 29 015-12 vac∶gp120 100∶13584 NA33∶1 1965 NA11∶1 1237 NA3∶1 0 22 NA1∶1 0 0 NA*用1μg不同制剂中的gp120III免疫小鼠**通过减去对抗原非表达细胞系的杀伤率来计算细胞毒百分率(％)***NA；未得到。实施例9小鼠体内gp120特异性体液应答的诱导为了诱导gp120特异性的体液应答，每2周间隔用1μg的gp120 IIIb免疫小鼠3次。放血处死小鼠，用固相ELISA法检测gp120 IIIb以验证IgG抗体的存在。结果表明gp120-ST的抗原性强于gp120-HBSS，gp120 SAFm(表5)或gp120-STP。
表 5 抗-gp120抗体应答的诱导1μggp120制剂/动物 反应小鼠数目/注射小鼠数目1/血清稀释度HBSS0/3 ＜1/20，＜1/20，＜1/20STP 1/3＜1/20，＞1/4860，＜1/20ST 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860PT 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860SP 2/3＜1/20， 1/540， 1/540Saf-M 2/3 1/180， ＞1/4860， 1/540实施例10猴子体内gp120特异性抗体应答的诱导用gp120-SAFm，gp120-STP，gp120-ST或gp120-HBSS免疫猴子(每组2只)。用含gp160 IIIb的重组牛痘免疫一组猴子作对照，间隔2周对猴子进行免疫，在第2次免疫2周和3周后放血。对从每个猴子得到的原血清和免疫血清进行一系列稀释，如材料和方法中描述的用ELISA方法测定抗gp120活性。数据(图12)显示用gp120-STP或gp120-SAFm免疫小鼠能诱导相似的应答。用gp120-ST免疫组中的1只猴子与用gp120-SAFm或gp120-免疫组诱导的应答相似。1只用gp120-ST免疫的猴子在免疫2周后也没有诱导强的抗-gp120应答。实施例11AF与HPV 16 E7体内联合应用时的活性1.免疫用重组HPV 16 E7蛋白质的产生a)E7基因的克隆和PCRHPV 16 E7基因在由Dr.Karen Vousden提供(Ladwing研究所)的质粒中克隆，它能编码来源于癌细胞系Caski的E7基因。用PCR扩增编码区域，应用的引物可编码侧翼有Bam HI和SalI克隆位点基因的5′和3′末端。把E7的PCR产物结合到PGEX-4T1表达载体(Pharmacia生物工程)从而形成PGEX·E7表达质粒。用该质粒转染E.coli系XL1-blue (Stratagene)。从克隆质粒中得到的E7序列与Caski细胞中获得的E7序列一致。
b)细菌表达的E7的产生和纯化
PGEX·E7这一细菌的表达质粒编码一种在氨基末端包含有GST，在羧基末端有E7蛋白和纤维蛋白酶裂解位点的谷酰甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。按PGEX-4T-1载体(Pharmacia Biotech)厂家说明书制备纯化E7蛋白质。首先在培养基加入异丙基-b-D-硫代半乳糖苷酶诱导含PGEX·E7表达质粒的细菌表达融合蛋白。用缓和的声波裂解细胞并收获它，裂解物经谷光甘肽琼脂糖4B柱(Pharmacia生物工程)，融合蛋白与基体结合以后，冲洗树脂移去非特异性结合蛋白，用凝血酶消化结合的融合蛋白以使GST融合部分释放出E7蛋白。
用SDS-PAGE分析E7蛋白制剂并且用Bradford方法(BioRad)来确定E7蛋白的浓度，每1L细菌培养物中获得9mg可溶性E7蛋白。
2.X21 E7转染子的形成HPV 16 E7蛋白质的编码序列插入到IDEL适宜的真核表达质粒INPEP4中。该载体中E7的表达由细胞巨大病毒启动子/增强子转录元件控制。此外，E7编码序列的前3个核苷酸被移去且由免疫球蛋白轻链引导序列所代替，放置在直接上游，E7编码区域的框架内，转染小鼠细胞系X21之后，用Northern印迹法检测单体的G418抵抗克隆用于E7信使产物。每一克隆显示出可检测的E7信使。接着对4E7和1C72克隆的细胞裂解物进行Nestern印迹法检测，证明了E7蛋白的产生。
3.E7/AF可溶性抗原的体内活性本研究中应用C3H雌性小鼠(H2k/k，Harlan Spnague Dawley)。依照“实验动物护理和应用指南”(DHHS出版社No.NIH 86-23，Bethesda，MDNIH，1985)一书饲养动物，随意给食物和水。本研究中应用E7转染子细胞系HOPE2(H2k/k)。肿瘤细胞系通过体外连续传代进行培养。
Western印迹法检测及随后的体外传代重复显示出该细胞系能维持E7胞浆抗原的表达。给同源C3H小鼠皮下注射15000个体外传代细胞引发肿瘤。
2周内在两个垂直方向测量肿瘤。肿瘤体积可按下列公式计算V(mm3)＝(L×W2)/2L＝最长的轴线，以毫米计算W＝垂直轴线(mm)
表6的数据代表肿瘤小鼠(荷瘤鼠数量/所有接受注射小鼠的数量)。图13和14的数据代表每一治疗组或对照组肿瘤大小的均值(mm3)。每一治疗组与未接受治疗的对照组进行比较。注射HOPE2细胞10天后，当大部分肿瘤可触及的时候(大约50～75mm3)进行治疗。治疗以用AF或矾佐剂中的可溶性E7蛋白免疫小鼠而开始(皮下，总体积为0.2ml)。免疫前即刻，AF与E7蛋白在Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中混合60秒，这样每只小鼠可接受0.2ml的E7蛋白30μg或90μg。按照厂家说明书A1(Pieme化学药剂公司)与E7蛋白混合，这样每只小鼠可接受0.2ml的E7蛋白90μg。在第2次治疗组中的动物9天后接受第2次免疫(接种肿瘤19天后)。如前所述，在接种之前立即准备加强免疫。
本实施例中(表6Xp#233)，接种肿瘤细胞41天后，接受溶于AF中的可溶性E71次注射的小鼠(每只30μg或90μg)仅4/8和5/8有可测量的肿瘤。与此相对，所有用矾中可溶性E7蛋白免疫的小鼠(8/8)均发生活动性。进行性的肿瘤。另外，如图13所示，与对照组(未治疗)或矾治疗组相比，仅仅在用溶于AF中的E7蛋白进行免疫的治疗组可观察到显著的肿瘤生长抑制作用。接受1次溶于矾中E7注射的小鼠中没有发现肿瘤生长的抑制(图13)或抑瘤率的增加(表6)。
尽管在接受2次矾中E7注射的小鼠中可观察到一些肿瘤生长受阻，但用肿瘤攻击后第10天和第19天接受2次免疫的治疗组观察可得到相似的结果(图14和表6)。
结果显示，以荷瘤鼠数量的减少和肿瘤 的抑制作用计算，随着AF中可溶性E7的免疫，可观察到明显的抗肿瘤活性。与此相对，所有用矾中可溶性E7蛋白免疫1次或2次的动物均有进行性生长的肿瘤。总而言之，用溶于AF中的可溶性E7蛋白免疫小鼠可明显抑制肿瘤细胞的生长而用溶在矾中的可溶性E7免疫则观测不到。
权利要求
1.一种组合物，其包含与微流体化的抗原制剂混合的抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，所说的抗原制剂以稳定的水包油乳剂形式配制，基本上不含免疫刺激性肽并且所述组合物在施用给动物时能够诱导针对组合物中包含的抗原的特异性细胞毒T淋巴细胞应答，所述的动物选自人、家养动物和农业动物。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗原选自下列抗原的抗原性部分HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；乙型肝炎表面抗原Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag；流感抗原HA、NP和NA；甲型肝炎表面抗原；疱疹病毒抗原EBV gp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物，巨细胞病毒gB，巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白、N蛋白；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物和突变的p21 ras蛋白。
3.一种组合物，其包含与微流体化的抗原制剂的混合的抗原，该所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，所说的抗原制剂以稳定的水包油乳剂形式配制，不含免疫刺激性肽并且应用给动物的组合物能够对组合物中包含的抗原诱导特异性细胞毒T淋巴细胞应答，所用的动物选自人、家养动物和农业动物。
4.权利要求3的组合物，其中抗原制剂基本上由去污剂、药剂和油组成。
5.权利要求3的组合物，其中抗原制剂对人、家养动物或农业动物无毒。
6.权利要求3的组合物，其中的抗原选自HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；乙型肝炎表面抗原Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag；流感抗原HA、NP和NA；甲型肝炎表面抗原；疱疹病毒抗原EBVgp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物，巨细胞病毒gB，巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白、N蛋白；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物、人类乳头瘤病毒抗原；前列腺特异性抗原(PSA)和突变的p21 ras蛋白。
7.一种在动物体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的方法，所述动物选自人、家养动物和农业动物，所述方法包括给动物施用一种包括抗原和微流体化的抗原制剂的混合物，该所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，所说的抗原制剂不含免疫刺激性的肽组分，以稳定的水包油乳剂形式配制；所说的混合物以有效量施用给动物，可在动物体内诱导针对混合物中所含抗原的特异性的细胞毒T淋巴细胞应答。
8.权利要求7的方法，其中抗原制剂基本上由去污剂、药剂和油组成。
9.权利要求7的方法，其基本上由对人和动物施用1次所述混合物构成。
10.权利要求7的方法，其中的人或动物感染了病毒或患有由病毒感染引起的一或多种症状。
11.权利要求7的方法，其中的抗原制剂对人或动物无毒。
12.权利要求7的方法，其中的抗原选自HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；乙型肝炎表面抗原Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag；流感抗原HA、NP和NA；甲型肝炎表面抗原；疱疹病毒抗原EBV gp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物，巨细胞病毒gB，巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白、N蛋白；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物和突变的p21 ras蛋白。
13.一种治疗感染了HIV病毒的患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的HIV抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂的形式配制；该混合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
14.权利要求13的方法，其中HIV抗原选自gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev。
15.一种治疗疟疾患者的方法，其包括给患者施用一种微流体化的组合物，该组合物包含与抗原制剂混合的疟疾相关抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂的形式配制；该混合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
16.权利要求15的方法，其中疟疾相关抗原选自CS蛋白和子孢子表面蛋白2。
17.一种治疗流感患者的方法，其包括给患者施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的流感相关抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激肽组分，以稳定的水包油乳剂形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
18.权利要求1 7的方法，其中的流感相关抗原选自HA、NP和NA。
19.一种治疗肝炎患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的肝炎相关抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
20.权利要求19的方法，其中肝炎相关抗原选自甲型肝炎表面抗原、Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag。
21.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的癌症相关抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
22.权利要求21的方法，其中的癌相关抗原选自癌CEA、癌相关粘蛋白、P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物和突变的p21 ras蛋白。
23.一种治疗感染了疱疹病毒的患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的疱疹抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
24.权利要求23的方法，其中疱疹病毒抗原选自EBV gp340、EBVgp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物、巨细胞病毒gB和巨细胞病毒gH及IE蛋白gp72。
25.一种治疗感染了呼吸道合胞病毒的患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的呼吸合胞体抗原，所述抗原制剂包含(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂不含有免疫刺激性肽组分，以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
26.权利要求25的方法，其中呼吸道合胞抗原选自F蛋白、G蛋白和N蛋白。
27.一种在人、家养动物或农业动物体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的方法，其包括如下步骤施用一种抗原与微流体化抗原制剂混合形成的混合物，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂形式配制，该混合物以足以在人或动物体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给人或动物。
28.权利要求27的方法，其中的人、家养动物或农业动物被病毒感染并患有由所述病毒感染引起的一种或多种症状。
29.权利要求27的方法，其中抗原制剂对人、家养动物或农业动物无毒。
30.权利要求27的方法，其中抗原选自下列抗原的抗原性部分HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；乙型肝炎表面抗原Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag；流感抗原HA、NP和NA；甲型肝炎表面抗原；疱疹病毒抗原EBV gp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物，巨细胞病毒gB，巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白、N蛋白；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物和突变的p21 ras蛋白。
31.一种治疗感染了HIV病毒的患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的HIV抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
32.权利要求31的方法，其中HIV抗原选自gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rv。
33.一种治疗疟疾患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的疟疾相关抗原，抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
34.权利要求33的方法，其中疟疾相关抗原选自CS蛋白和子孢子表面蛋白2。
35.一种治疗流感患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的流感相关抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
36.权利要求35的方法，其中流感相关抗原选自HA、NP和NA。
37.一种治疗肝炎患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的肝炎相关抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
38.权利要求37的方法，其中肝炎相关抗原选自甲型肝炎表面抗原、Pre-S1，Pre-S2，Hbc Ag和Hbe Ag。
39.一种治疗癌症患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的癌症相关抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
40权利要求39的方法，其中的癌相关抗原选自癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P21、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97、癌Neu癌基因产物，癌p53基因产物和突变的p21 ras蛋白。
41.一种治疗感染了疱疹病毒的患者的方法，其包括施用一种组合物，该组合物包含与微流体化抗原制剂混合的疱疹抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
42.权利要求41的方法，其中疱疹病毒抗原选自EBV gp340、EBVgp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物、巨细胞病毒gB、巨细胞病毒gH和IE蛋白gp72。
43.一种治疗感染了呼吸道合胞病毒的患者的方法，其包括施用与微流体化抗原制剂混合的呼吸道合胞抗原，所述抗原制剂基本上由下面三种物质中的两种组成(a)稳定化去污剂，(b)胶束形成剂，和(c)生物可降解和可相容的油，该抗原制剂以稳定的水包油乳剂的形式配制；该组合物以足以在患者体内诱导细胞毒T淋巴细胞应答的量施用给患者。
44权利要求43的方法，其中呼吸道合胞病毒抗原选自F蛋白、G蛋白和N蛋白。
45.权利要求25-44中任一权项的方法，其中抗原制剂基本上包括所述去污剂和胶束形成剂。
46.权利要求25-44中任一权项的方法，其中抗原制剂基本上包括所述去污剂和油。
47.权利要求25-44中任一权项的方法，其中抗原制剂基本上包括所述油和胶束形成剂。
48.权利要求6的组合物，其中乳头瘤病毒抗原选自HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、HPV18 E6抗原、HPV18 E7抗原、HPV6 E4抗原、HPV6 L1抗原、HPV11 E4抗原和HPV11 L1抗原。
49.一种治疗宫颈癌的方法，其包括施用有效量的权利要求48的人类乳头瘤病毒抗原制剂。
50.一种治疗尖锐湿疣的方法，其包括施用有效量的权利要求48的人类乳头瘤病毒抗原制剂。
51.一种治疗前列腺癌的方法，其包括施用权利要求6的组合物，其中抗原是前列腺特异性抗原。
52.权利要求1的组合物，其中稳定化去污剂选自多山梨醇酯80、吐温20、吐温40、吐温60、两性去污剂3-12、替波尔HB7和Span85。
53.权利要求1的组合物，其中去污剂的量的范围大约是0.05-0.5％。
54.权利要求53的组合物，其中去污剂的量大约为0.2％。
55.权利要求1的组合物，其中胶束形成剂的亲水-亲油平衡值在0和2之间。
56.权利要求1的组合物，其中胶束形成剂选自poloxamer 401、普卢龙尼克L62LF、普卢龙尼克L101、普卢龙尼克L64、聚乙二醇1000、季酮1501、季酮150R1、季酮701、季酮901、季酮1301和季酮130R1。
57.权利要求1的组合物，其中胶束形成剂的量的范围为0.5-10％。
58.权利要求57的组合物，其中胶束形成剂的量的范围为1.25-5％。
59权利要求1的组合物，其中油的熔点低于60℃。
60.权利要求59的组合物，其中油选自角鲨烯、角鲨烷、二十烷、四四十烷、鲨肝油烷、甘油和植物油。
61.权利要求1的组合物，其中油的量的范围为1-10％。
62.权利要求61的组合物，其中油的量的范围为2.5-5％。
63.权利要求1的组合物，其含有的胞壁酰二肽少于20μg。
64.权利要求63的组合物，其不包含任何胞壁酰二肽。
65.权利要求1的组合物，其中去污剂是多山梨醇酯80，胶束形成剂是poloxamer 401。
66.权利要求65的组合物，其中的油是角鲨烷。
67.权利要求1的组合物，其中去污剂选自吐温20、吐温40、吐温80，油选自角鲨烷、二十烷和鲨肝油烷，胶束形成剂选自普卢龙尼克L62LF和polyoxamer 401。
68.权利要求7的方法，其中去污剂选自多山梨醇酯80、吐温20、吐温40、吐温60，两性洗涤剂3-12，替波尔HB7和Span85。
69.权利要求7的方法，其中去污剂的量的范围大约为0.05-0.5％。
70.权利要求69的方法，其中去污剂的量大约为0.2％。
71.权利要求7的方法，其中胶束形成剂的亲水-亲油平衡值在0至2之间。
72.权利要求7的方法，其中胶束形成剂选自polyxamer 401、普卢龙尼克L62LF、普卢龙尼克L101、普卢龙尼克L64、聚乙二醇1000、季酮1501、季酮150R1、季酮701、季酮901、季酮1301和130R1。
73.权利要求7的方法，其中胶束形成剂的量的范围为0.5-10％。
74.权利要求71的方法，其中胶束形成剂的量的范围为1.25-5％。
75.权利要求7的方法，其中油的熔点低于60℃。
76.权利要求7的方法，其中油选自角鲨烯、二十烷、四四十烷、甘油、鲨肝油烷和植物油。
77.权利要求7的方法，其中油的量的范围为1-10％。
78.权利要求77的方法，其中油的量的范围为2.5-5％。
79.权利要求7的方法，其中混合物中包含的胞壁酰二肽少于20μg。
80.权利要求7的方法，其中的混合物不包含任何胞壁酰二肽。
81.权利要求7的方法，其中的去污剂是多山梨醇酯80，胶束形成剂是poloxamer 401。
82.权利要求81的方法，其中的油是角鲨烷。
83.权利要求7的方法，其中去污剂选自吐温20、吐温40、吐温80，油选自角鲨烷、二十烷、橄榄油和鲨肝油烷，胶束形成剂选自polyoxamer401和普卢龙尼克L62LF。
84.权利要求7的方法，其中混合物中颗粒大小的范围为250-300nm。
85.权利要求1的组合物，其中组合物中颗粒大小的范围为250-300nm。
全文摘要
在人、家养动物或主要的农业动物中诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答的方法和组合物。该方法包括这样的步骤:提供希望引起CTL应答的抗原并且提供抗原制剂,抗原制剂中包含稳定化去污剂、胶束形成剂和油中的2种或更多种,或由其或基本上由其组成。抗原制剂优选不含有免疫刺激性肽组分,或含有该组分的水平足够低,不致于减弱所希望的CTL应答。该制剂以稳定的水包油乳剂的形式提供。
文档编号A61K47/00GK1175260SQ95197570
公开日1998年3月4日 申请日期1995年11月29日 优先权日1994年12月7日
发明者S·雷查德胡列, W·H·拉斯泰特 申请人:艾德药品公司