专利名称：：硫－35标记单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及含有放射性核素标记的单克隆抗体，尤其是关于一种核素35S标记单克隆抗体及其制备方法。脑胶质瘤为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其病例占脑肿瘤的50％左右，它的特点是肿瘤中约30％的细胞参与增殖，70％的细胞虽然不参与增殖活动，但具有增殖力，需要时即可转入增殖群，细胞周期时间约2-3天。脑胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤边缘常是正常细胞和肿瘤细胞交织存在的场所，依然存在血脑屏障，致使许多化疗药物不能到达。脑胶质瘤患者的死亡率和手术复发率高，是恶性度较高的肿瘤。放射治疗会在射线杀伤肿瘤的同时杀伤正常细胞。有文献报道在60Gy照射剂量时病人生存时间有增加，但在70-80Gy照射剂量时有可能超过脑的最大耐受量，使生存率反而下降。现在采用γ刀技术，虽然大大改善了射线的剂量分布，但只能是改善。总之，由于脑胶质瘤为恶性肿瘤，病人复发率和死亡率都很高。世界各国均在寻找更好的治疗方法。自从1975年应用细胞杂交技术生产单克隆抗体的研究成功以来[KohlerG.etal.Nature，1975；256405]，应用单抗来研究肿瘤相关抗原，使肿瘤免疫学研究出现了新的飞跃，用放射性核素标记单克隆抗体作为治疗脑肿瘤有较好的前景。碘-131标记单克隆抗体首先被研究(ZanintakyMR，etal.CancerRes.1989；492807)。后来又公布了碘-131标记单克隆抗体SZ39(YangW.L.，etalChineseMed.J.1988；101(12)919)。但由于I-131的γ射线和β射线的能量较高，使医护人员和病人正常组织受到较大的损伤，同时由于体内脱卤酶的存在和作用，使I-131容易从单克隆抗体上脱落下来，非但使药物失效并因I-131浓集在甲状腺造成危害。因此，碘-131标记的单克隆抗体不能作为治疗药物推广使用。近年来，国际上趋向采用发射α和β粒子的放射性核素进行导向放疗。R.G.Fairchild等报道(R.G.Fairchildetal，RadiationOncologyBiol.Phys.，1989；17(2)337-343)以35S标记硫氧嘧啶治疗黑色素瘤荷瘤鼠，治疗量为48.1-370MBq，小剂量可产生抑瘤效果，大剂量可使肿瘤消退。另据报道(G.R.Gottschalketal，CancerRes.1959；191070)，20.7-34.3GBqNa235SO4治疗病人未引起放射性疾病，仅有可逆性白细胞减少。可见从射线杀伤力及安全性考虑，35S有希望应用于导向放疗。为此，采用单克隆抗体为导向物，将35S标记引入到肿瘤部位，即对S-35标记的单克隆抗体及其应用于制备治疗脑胶质瘤的医药制品，是一个很有意义的科研工作。本发明目的是提供一种35S标记单克隆抗体SZ39，它能良好地保持单克隆抗体的免疫活性，并能与人脑胶质瘤细胞特异结合，其35S标记物放射化学纯度可达99％，放射性比活度可高达51.8MBq/mg，能有效地杀伤肿瘤细胞。本发明另一目的是提供35S标记单克隆抗体SZ39的制备方法，该方法首先用硫-35标记的硫酸与苯胺合成35S-对氨基苯磺酸，然后用硫-35标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39进行交联而成35S-对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物。本发明又一目的是提供35S标记单克隆抗体SZ39可应用于制备治疗人脑胶质瘤的医药制品。本发明是一种硫-35标记单克隆抗体SZ39(35S-McAb-SZ39)，它是由35S-对氨基苯磺酸和单克隆抗体SZ39交联而成的放射性标记的35S-对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物。McAb-SZ39属于IgG2亚类，重链分子量为55KD，免疫转移电泳证实，McAb-SZ39抗体识别抗原为胶瘤细胞膜上MW180000的糖蛋白(参见杨伟廉，中华神经外科杂志1988；4(4)234)，该单抗效介较高，经1∶10000稀释后，ELISA测定对靶细胞仍呈强阳性反应。免疫组化、免疫荧光及ELISA法测定结果显示，McAb-SZ39绝大多数胶质瘤细胞系和颅内恶生胶质瘤呈强结合反应，而与其它被检测肿瘤及肿瘤细胞系无反应。组织特异性测定显示McAb-SZ39与正常淋巴细胞，ABO型红细胞、白细胞、血小板骨髓细胞、皮肤成纤维细胞及肝、脾、肺、胰、子宫、胃、食道、大脑、小脑、皮肤、横纹肌等12种正常人体细胞组织均无反应，由此可见，McAc-SZ39对人脑胶质瘤能特异结合。35S标记的单克隆抗体SZ39，既保持了McAb-SZ39与人脑胶质瘤结合的特异性，又有35S核素发射纯β射线线性能量转移高的特点，35S发射的β粒子最大能量为0.167Mev，组织中最大射程为300μm，约为30个细胞直径的杀伤范围。对肿瘤细胞杀伤力强，而对正常细胞组织及周围人员无损害。在对荷人胶质瘤裸小鼠的实验中，证实其对肿瘤的生长抑制率在用药5天后就高达30％以上。因此，35S标记McAb-SZ39用于制备放射性导向治疗人脑胶质瘤的医药制品有着良好的应用前景。本发明硫-35标记单克隆抗体SZ39的制备方法以H235SO4为初始物质的核素硫-35标记McAb-SZ39路线示意图如下制备方法分二步进行一、35S-对氨基苯磺酸的制备将H235SO4加入苯胺中，再加入H2SO4作为载体进行反应，H235SO4加入量极微，对苯胺而言可以忽略，苯胺与H2SO4的克分子比例为1∶1-4，反应温度175-185℃，反应时间38-60小时。反应得粗产物用板层析分离，得35S-对氨基苯磺酸Rf值为0.36，35S-苯氨硫酸盐Rf值为0。放射生板层析扫描图(图1)显示35S-苯氨硫酸盐转换成35S-对氨基苯磺酸的转换率。将制得的35S-对氨基苯磺酸与对氨基苯磺酸标准品在紫外分光光度计上测定光谱图，证实两者光谱图相一致(见图2)。二、硫-35标记单克隆抗体SZ39的制备采用碳二亚胺(CDC)法将35S-对氨基苯磺酸与单抗SZ39交联成35S标记McAb-SZ39交联物。将上面制得的35S-对氨基苯磺酸加入到单抗SZ39和碳二亚胺的磷酸缓冲液(PH＝7.4)中进行交联反应。35S-对氨基苯磺酸与单抗SZ39的克分子比例为1∶1.2，单抗SZ39与CDC的重量比为1∶10，在12-25℃温度范围内搅拌反应，时间15-45分钟，标记单抗反应完毕后，装透析袋对蒸馏水透析。然后用液体闪烁谱仪测定放射性强度，根据放射性投料量计算出放射化学产率。根据单抗的化学量计算出35S标记McAb-SZ39的放射性比活度。并用高压液相色谱鉴定35S标记单克隆抗体的放射化学纯度，用ELISA方法检测35S标记单克隆抗体SZ39的免疫活性，它稀释至1∶10000仍呈阳性。碳二亚胺法方法简便，只要调节好反应液中单抗SZ39和碳二亚胺一定比例，反应就能很好进行，由于反应在温和条件下进行，又无需调节PH，使单抗活性不受PH变化影响，且免疫活性保持时间长，在二周内无变化。本发明35S标记单抗SZ39在裸鼠体内进行治疗的实验。以荷瘤裸小鼠为模型，即将人脑胶质瘤NHG-1皮下移植裸小鼠为模型，给药方法均为腹腔注射，103.6MBq/只小鼠，实验分三组进行1)35S-McAb-SZ39治疗组；2)35S-IgG治疗组；3)空白对照组。在裸小鼠接种后7天给药，连续观察肿瘤生长情况，测量肿瘤的短径(a)和长径(b)，以公式计算肿瘤体积＝a2×b/2，计算各组肿瘤大小。再按下列算式求出35S-McAb-SZ39治疗组与35S-IgG治疗组对空白对照组的肿瘤生长抑制率(I)实验结果显示，103.6MBq剂量的35S-McAb-SZ39对荷瘤鼠脑胶质瘤具有明显的抑制作用，给药后5天即可使肿瘤生长阻滞，肿瘤生长抑制率大于30％，具有肿瘤治疗所必须的杀伤力。而35S-IgG因缺乏单抗的特异浓聚作用，抑制作用不明显。这主要是因为35S-McAb-SZ39中单抗将35S核素特异性地带到肿瘤部位，而35S核素产生的β衰变释放的能量杀伤肿瘤细胞，达到抑制肿瘤生长的目的。本发明优点35S标记的单克隆抗体SZ39，既保持了单克隆抗体SZ39与人脑胶质瘤结合力强的特性，又有35S核素线性能量转移高对肿瘤细胞杀伤力强的特点。与131I-McAb-SZ39相比较，又显示其安全有效的特点。131I-McAb由于体内脱卤酶的存在，I-131很容易从McAb上脱落下来，达不到杀伤肿瘤细胞的作用，而35S-McAb中35S不易脱落，并由于35S的核素发射能量为0.167Mev的纯β射线，最大射程为细胞直径的30倍，它对正常细胞组织和周围人员无损伤，不像I-131发射较大能量的γ和β射线，可对正常细胞组织和周围人员有较多的辐射损伤。此外，35S-McAb-SZ39的制备方法简便，反应条件温和，其产物免疫活性保持时间长，二周内无变化。总之，本发明35S-McAb-SZ39，因其对人脑胶质瘤细胞具有较强的导向性和较大的杀伤力，应用于制造治疗人脑胶质瘤的放射性医药制品有良好的前景。本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。图1是显示35S-苯氨硫酸盐转换成35S-对氨基苯碳酸转换率的放射性板层析扫描图。图2是35S-对氨基苯磺酸和对氨基苯磺酸标准品的紫外光谱比较图。实施例135S-对氨基苯磺酸的制备。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反应瓶中，再加入0.05mM硫酸，反应瓶用水泵减压抽干封管，在170℃温度下反应，时间为60小时。开封后加入40μlNaCl饱和水溶液溶解，用硅胶GF板(20×20cm)展开分离，展开剂为正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36处得到35S-对氨基苯磺酸纯品，计算其转换率为58％。用UV-240紫外分光光度计测定紫外光谱图，证实与对氨基苯磺酸标准品的紫外光谱图相一致(见图2)。实施例235S-对氨基苯磺酸的制备。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反应瓶中，再加入0.025mM硫酸，反应瓶用水泵减压抽干封管，在185℃温度下反应，时间为38小时。开封后加入400μlNaCl饱和水溶液溶解，用硅胶GF板(20×20cm)展开分离，展开剂为正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36处得到35S-对氨基苯磺酸纯品，计算其转换率为64％。用UV-240紫外分光光度计测定紫外光谱图，证实与对氨基苯磺酸标准品的紫外光谱图相一致(见图2)。实施例335S-对氨基苯磺酸的制备。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反应瓶中，再加入0.0125mM硫酸，反应瓶用水泵减压抽干封管，在180℃温度下反应，时间为45小时。开封后加入40μlNaCl饱和水溶液溶解，用硅胶GF板(20×20cm)展开分离，展开剂为正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36处得到35S-对氨基苯磺酸纯品，计算其转换率为62％。用UV-240紫外分光光度计测定紫外光谱图，证实与对氨基苯磺酸标准品的紫外光谱图相一致(见图2)。实施例435S标记单抗SZ39交联物的制备将828MBq35S-对氨基苯磺酸，40μl0.9％氯化钠溶液加入到200μl含有6mg单克隆抗体SZ39和60mg碳二亚胺(CDC)的PH7.4磷酸缓冲溶液中，在12℃水浴下搅拌反应45分钟进行交联，然后装透析袋对蒸馏水透析4次。产物用液体闪烁仪测量放射性强度为310.8MBq，计算放射化学产率为37.4％。用ELISA方法检测其免疫活性，显示35S-McAb-SZ39能良好保持单克隆抗体的免疫活性，1∶10000稀释时免疫活性仍为阳性。用HPLC测定其放射化学纯度为99％，其35S标记单克隆抗体的放射性比活度为51.8MBq/mg。实施例535S标记单抗SZ39交联物的制备将393MBpq35S-对氨基苯磺酸，40μl0.9％氯化钠溶液加入到200μl含有4mg单克隆抗体SZ39和40mg碳二亚胺(CDC)的PH7.4磷酸缓冲溶液中，在20℃水浴下搅拌反应30分钟进行交联，然后装透析袋对蒸馏水透折4次，产物用液体闪烁仪测量放射性强度为136.9MBq，计算放射化学产率为34.9％。用ELISA方法检测其免疫活性，显示35S-McAb-SZ39能良好保持单克隆抗体的免疫活性，1∶10000稀释时免疫活性仍为阳性。用HPLC测定其放射化学纯度为99％，其35S标记单克隆抗体的放射性比活度为34.2MBq/mg。实施例635S标记单抗SZ39交联物的制备将1422MBq35S-对氨基苯磺酸，400μl0.9％氯化钠溶液加入到200μl含有12mg单克隆抗体SZ39和120mg碳二亚胺(CDC)的PH7.4磷酸缓冲溶液中，在25℃水浴下搅拌反应15分钟进行交联，然后装透析袋对蒸馏水透析4次。产物用液体闪烁仪测量放射性强度为481.0MBq，计算放射化学产率为33.8％。用ELISA方法检测其免疫活性，显示35S-McAb-SZ39能良好保持单克隆抗体的免疫活性，1∶10000稀释时免疫活性仍为阳性。用HPLC测定其放射化学纯度为99％，其35S标记单克隆抗体的放射性比活度为40.0MBq/mg。实施例735S-McAb-SZ39在荷人脑胶质瘤裸鼠体内的治疗实验将体重为20±0.2克，鼠令为6-8周的裸小鼠(雌雄兼用)分成三组(A)空白对照组(5只)，(B)35S-McAb-SZ39治疗组(5只)，(C)35S-IgG治疗组(3只)，在裸小鼠皮下接种人脑胶质瘤NHG-1，7天后分别腹腔注药，35S-McAb-SZ39治疗组和35S-IgG治疗组注射剂量均为104.6MBq/只，对照组注射同体积生理盐水。在给药当天及5、12、20、26天时测量肿瘤的短径(a)和长径(b)，计算出各组肿瘤体积平均值和标准误差，列于表1。表1各治疗组肿瘤体积(mm3)变化情况</tables>X±SD，Δ与对照组比较有显著差异(P＜0.05)n＝实验裸鼠数由表1可以看出，35S-McAb-SZ39治疗组的荷瘤裸小鼠肿瘤体积明显小于35S-IgG治疗组和空白对照组的肿瘤体积。按公式计算各治疗组肿瘤生长抑制率列于表2表2各治疗组肿瘤生长抑制率(％)*二组间有显著差异(P＜0.05)从表2中可以看出，35S-IgG治疗组对肿瘤虽然也有些抑制，但抑制率很小，而35S-McAb-SZ39治疗组5天后抑制率在30％以上，26天时抑制率达49.9％与35S-IgG治疗组有显著差异。权利要求1.一种硫-35标记单克隆抗体SZ39，其特征在于它是由35S-对氨基苯磺酸和属于IgG2亚类并具有55KD重链分子量的单克隆抗体SZ39交联而成的放射性35S标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物。2.一种硫-35标记单克隆抗体SZ39的制备方法，其特征在于该方法分二步进行a.制备35S-对氨基苯磺酸，将H235SO4加入苯胺中，再加入作为载体的H2SO4进行反应，反应温度175-185℃，反应时间38-60小时，苯胺与H2SO4克分子比例为1∶1-4，b.采用碳二亚胺(CDC)法将35S-对氨基苯磺酸与单抗SZ39交联成35S标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物，35S-对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39克分子比例为1∶1-2，单克隆抗体SZ39与CDC的重量比为1∶10，反应温度为12-25℃，反应时间为15-45分钟。3.如权利要求1所述的硫-35标记单克隆抗体SZ39，其特征在于它可应用于制造治疗人脑胶质瘤的放射性医药制品。全文摘要一种硫－35标记的单克隆抗体SZ39(文档编号A61K51/02GK1194271SQ9811070公开日1998年9月30日申请日期1998年3月11日优先权日1998年3月11日发明者吴元芳,周桢堂,张雨龙,庄道玲,要福增申请人:中国科学院上海原子核研究所