专利名称：高效广谱抑制肿瘤生长和转移的新型抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和抗体工程技术领域。具体地说，本发明涉及一类能够特异识别大多数常见的人体肿瘤新生血管并抑制肿瘤生长和转移的新型抗体。
癌症是当前危害人类生命健康的头号杀手。我国每年恶性肿瘤的发病人数约160万。死于癌症者占死亡总人数的20％以上，居城市居民死亡原因的第一位(根据1996年统计资料)。
在肿瘤三大常规(放疗，化疗和手术>治疗中，药物治疗是一个重要方面。目前影响肿瘤药物治疗效果的因素是多方面的，包括药物的特异性、运输方式、渗透性以及诱发肿瘤耐药性。其中药物的特异性和耐药性是肿瘤治疗学急需解决的关键问题。
本发明的特色在于它是一类肿瘤特异的、广谱的、无或低耐药性的新型抗癌药物。本发明所采取的策略是通过阻断肿瘤细胞的生命线-营养和血液供应，从而使肿瘤细胞缺血坏死。这种抗癌新策略是基于两点理论①肿瘤依赖于血管而生长的理论。②肿瘤新生血管既不象肿瘤细胞那样缺乏遗传稳定性，又不同于正常血管。正常血管内皮的更新需要100多天，而肿瘤血管仅需数天，且带有一些正常血管内皮所没有的新标志物。这些肿瘤血管特有的标志物是肿瘤药物筛选的新的靶标。
本发明与传统的抗肿瘤抗体相比，其特点在于广谱、特异、高效、不易产生耐药性。作用机理如下，①肿瘤血管内皮细胞相对比较稳定，突变少，因而不会象肿瘤细胞那样易于产生耐药性；②不同类型实体瘤的特异靶分子不同，而它们赖以生存的新生血管结构大致相同，因此抗肿瘤新生血管抗体具有广谱性；③成千上万个肿瘤细胞依赖于一条毛细血管获取氧和营养物质，即使少量药物对于血管的不完全破坏，亦会造成血栓形成，导致大量肿瘤细胞缺血死亡。因此，本发明用药量少，效率高；④肿瘤血管药物直接作用于血管内皮，无需穿透到肿瘤深部，避免了肿瘤组织局部高压所引起的药物渗透和分布问题。
通过文献和IBM专利数据库查询新生血管抑制剂(angiogenesisinhibitor)和新生血管抗体(angiogenesis antibody)，未见与本发明有关的文献和专利发表。
本发明涉及一类作用于人体肿瘤血管的新型抗体，包括鼠单克隆抗体AA98和人-鼠嵌合抗体chiAA98以及小分子功能抗体AA98-Fab和AA98-scFv，它们作用于各种肿瘤血管，包括肝癌，胃癌，大肠癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌及平滑肌肉瘤，而对正常组织几乎不发生任何反应。单克隆抗体本身或抗体结合物均具有抑制多种人体肿瘤生长的作用。
本发明与其它抗体比较，具有独特的优点第一，特异抗体识别肿瘤组织而非正常组织，这种高度特异性将在临床应用中大大减少药物的毒付作用。第二，广谱不同类型实体瘤细胞含有不同的特异抗原，如乳腺癌抗原不同与结肠癌抗原；但是肿瘤生长都需要刺激周围新生血管形成以提供肿瘤疯狂生长的营养。虽然肿瘤组织不同，而肿瘤刺激增生的新生血管都具有一些共同的特征，本发明就是针对这些共同特征而研制的，因此它的抗癌作用是广谱的。第三，高效抗体可根据其结构特点分为五类，大多数仅具有识别功能，少数不仅具有识别功能还具有杀伤作用。本发明单克隆抗体属于IgG2a亚型，是一种罕见的杀伤性抗体。它本身即可单独杀死癌细胞，其作用机理是由于某些抗体在人体效应细胞和血清存在下，具有诱发抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)，从而杀死肿瘤细胞。第四，抗体对肿瘤新生血管的高度选择性是由于它们所识别的靶抗原特异分布于新生血管内皮，参与肿瘤的生长和转移。第五，抗体及其结合物是一类具有广谱、高效、低毒、低耐药性的新型抗肿瘤药物。第六，抗体可用于肿瘤的诊断及定位，通过体内外方法检测癌症。第七，抗体作为一种良好的研究工具，用于研究新生血管形成及其与肿瘤生长和转移的相互作用。
本发明在技术路线方面的创新之处在于①采用肿瘤细胞培养上清诱导人脐静脉内皮细胞，使其成为增殖的血管内皮细胞。后者用于免疫小鼠获得单克隆抗体AA98。这种新方法不仅提高了增生血管内皮细胞标志的丰度，维持了细胞膜抗原的天然构象，而且还可以发现新的靶分子。②利用现代分子生物学和抗体工程技术，研制出各种不同结构形式的基因工程抗体。这些抗体比原代鼠单克隆抗体具有更大的应用价值，主要表现在免疫源性较低、毒副作用小；易于与其它功能分子结合形成高效的免疫复合物；抗体基因易于保存并有利于进行抗体结构与功能的改造，以更好地适应于临床应用。
本发明包括一套识别肿瘤血管的单克隆抗体及基因工程抗体，后者包括嵌合抗体，抗体Fab和单链抗体。其中单克隆抗体及嵌合抗体都具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，这是它们体内抗癌作用的基础。这些抗体本身就具有治疗作用。而抗体Fab和单链抗体在体内不显示ADCC和CDC活性，可用于载体，连接化疗药物、毒素、细胞因子、酶和放射性同位素。因此，这些小分子抗体可作为各种免疫结合物的成分之一，用于肿瘤的诊断和治疗。
为了更全面地理解和应用本发明，提供下列实施例。
实施例一单克隆抗体AA98的制备和鉴定应用杂交瘤技术生产单克隆抗体AA98(Kohler and Milstein,Nature2 56:495,1975；Yeh et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979；Yeh etal.,Int.J.Cancer,1982)。简述如下采用肝癌细胞的培养上清诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生，以增生的HUVEC作为免疫原对BALB/C小鼠进行五次免疫接种。每次接种部位为腹膜内注射和皮下注射。每次注射的细胞总数大约为107。在最后一次免疫接种三天后，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和P3-X63-Ag8.635鼠骨髓瘤细胞进行融合，并用HAT选择性培养基对杂交瘤进行筛选。
运用Douillard,et al.,Enzyme-linked Immunosorbent Assay forScreening monoclonal antibody production using enzyme-labeledsecond antibody,Meth.Enzymol,.92:168-74,1983介绍的方法，将细胞接种到96孔培养板内培养过夜。用新鲜配置的0.5％的戊二醛固定细胞15分钟，用PBS洗三遍。加入牛血清白蛋白封闭1小时。然后先后加入分泌抗体的杂交瘤培养上清，酶标抗体和底物。通过ELISA反复筛选，最后获得与增生HUVEC发生特异反应的高亲和力的抗体。
用稀释法多次克隆分泌特异抗体AA98的杂交瘤细胞HE2A5。大量培养扩增杂交瘤细胞HE2A5，收集含有抗体AA98的培养上清用于抗体功能鉴定。另外将杂交瘤细胞HE2A5制成细胞悬液，用于制备抗体腹水。
腹水的制备方法简述如下六周龄BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Pri stane)0.5ml/只。10天后，将杂交瘤细胞悬液接种于BALB/C小鼠腹腔，1×107/ml/只，十天后，收集腹水，离心取上清。
通过蛋白A亲和层析，从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体。将纯化单克隆抗体无菌过滤，并冷藏或冷冻保存。
应用Zymed公司抗体亚型鉴定试剂盒，ELISA方法鉴定出抗体AA98属于IgG同型抗体。
利用冷冻组织切片和免疫组化方法(Immunology Methods Manual,Edited by Ivan Lefkovits,1997)鉴定抗体AA98与人体正常组织和肿瘤组织的反应，结果表明抗体AA98与许多肿瘤组织的微血管高特异反应，而与正常组织的反应十分有限。表1反应了抗体AA98对各种肿瘤组织和正常组织的免疫组化染色情况。在免疫组化切片上，清楚可见抗体只对肿瘤组织中的微小血管反应，而不与大中血管和正常组织中的血管反应。
表1免疫组化鉴定抗体AA98与人体正常组织和肿瘤组织中新生血管的反应
采用FACS细胞分类器分析单克隆抗体及其Fab对各种细胞系的结合活性。将1×106培养细胞悬浮在100μl含10μg/ml抗体AA98的培养基中，浮育1小时。用培养基洗三遍，加入培养液稀释的FITC-羊抗鼠IgG抗体，浮育45分钟。洗三遍后，将细胞重新悬浮在200μl-500μlPBS中。在FACS上进行免疫荧光分析并测定平均荧光密度。实验结果表明抗体AA98能够特异结合增殖的血管内皮细胞。
采用MTT方法研究抗体AA98对靶细胞的天然细胞毒作用及补体介导的细胞毒作用。在实验中观察到了意想不到的结果，既抗体AA98不仅具有补体介导的细胞毒作用，而且在未加任何修饰的情况下，抗体本身能够单独杀伤靶细胞，其杀伤率随抗体剂量的增大而增强。加入补体后杀伤效率进一步提高。实验结果归纳于表2。
表2．抗体AA98对增生血管内皮细胞的杀伤效应杀伤率(％)抗体剂量(μg/ml)抗体抗体+补体 补体1.0 4.8351.42 0.0010.015.72 50.76 0.00100.0 35.32 58.33 0.00动物实验表明，抗体AA98单独使用或标记同位素131I，均能够抑制人体多种肿瘤的生长和转移。下面举例说明抗体AA98在未加任何修饰的情况下抑制人胰腺癌生长的实验结果。
荷人胰腺癌(中分化导管腺癌Fwk-3)的BALB/C-NU小鼠40只，给药前平均瘤体积为130mm3，随机分组。(1)抗体AA98,(4)人IgG,(5)未治疗组。腹腔注射给药，每周给药两次。每三天测量肿瘤最长、最短直径，依公式(瘤体积=(短径2×长径)×π/6)计算肿瘤体积。依下面公式计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率(％)=(1-治疗组瘤体积/非治疗组瘤体积)×100％。观察结果如
图1所示。
实施例二人-鼠嵌合抗体chiAA98的制备由于鼠单克隆抗体在人体免疫系统中缺乏生物效应功能，同时还被识别为外来物质，诱发机体的免疫排斥反应，因而不适用于人体治疗。为了克服这一缺点。本发明采用现代分子生物学技术，研制出了人/鼠嵌合抗体chiAA98。该抗体的可变区(抗原结合区)来自鼠源蛋白(占抗体分子的1/3)，其他不变区来自人IgG(占抗体分子的2/3)。这种抗体保持了鼠单抗结合抗原的特异性，能够竞争抑制单克隆抗体AA98与其靶抗原的结合；而且降低了抗体分子中的鼠源成分，增加了抗体的生物学效应功能。研制嵌合抗体的操作步骤如下1)从杂交瘤细胞HE2A5中分离纯化mRNA，合成第一链cDNA；2)设计引物轻链可变区5’gg tct aga gag ctc gtg atg aca 3’(23mer)和5’at gga tcc agc ccg ttt tat ttc c 3’(24mer)；重链可变区5’ccg ctc gag gag gtg cag ctg ctg gaa tct 3’(30mer)和5’ccc aag ctt tga gga gac ggt ga 3’(23mer)3)用PCR方法克隆和扩增抗体轻、重链可变区基因；4)序列分析人抗体可变区基因，推导出该基因所编码的氨基酸序列；抗体AA98重链可变区是由118个氨基酸组成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser 118抗体AA98轻链可变区是由112个氨基酸组成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 1125)把抗体AA98的轻重链可变区基因分别与人的轻重链恒定区基因连接，构建可编码完整嵌合抗体的融合基因；6)将这种融合基因插入到有选择性标记和基因控制区(如启动子，增强子，终止子)的表达载体pdHL2.4中；7)在细菌中扩增这种表达载体，分离纯化含有嵌合抗体基因的表达载体；8)用lipofectin将含有嵌合抗体基因的表达载体导入哺乳动物细胞CHO中；9)用MTX筛选转化细胞，获得转基因细胞株CHO-chiAA98；10)用ELISA筛选分泌抗体并鉴定细胞株CHO-chiAA98的稳定性；11)检测嵌合抗体的抗原结合特异性和效应功能。
实施例三抗体识别功能片段AA98-Fab的制备利用抗体识别肿瘤血管的特异性，将抗体识别功能片段与具有免疫活性或抗肿瘤活性物质连接，研制出具有识别和杀伤作用的双能够融合蛋白。其中抗体成分主要是Fab。生产抗体Fab功能片段的操作步骤如下1)设计一套引物5’agg tcc agc tgc tcg agt ctg g3’(mH1)和5’gatatc act agt ggg ccc gct ggg ctc3’(for IgG2a/2b)，抗体轻链引物5’primer gat att gag ctc gtg atg ac(c/a) ca(g/a) (t/a)ctcc和3’primer 5’gc tct aga aag ctt a tta aca ctc att cct gttgaa2)用快速制备、纯化mRNA试剂盒(Promega)从大约2×107个杂交瘤细胞HE2A5中提取并纯化mRNA。
3)以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。
4)用PCR方法，以cDNA为模板，在PCR反应体系中分别加入引物，进行30个循环的PCR扩增。每个循环的条件是94℃变性30s,55℃退火90s,72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10min。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
5)把扩增抗体AA98的Fd(抗体可变区和恒定区CH1)基因和轻链基因克隆到pComb3H表达载体上。
6)把Fab-pCom3H重组质粒转入大肠杆菌XL-Blue(DE3)，用含氨苄青霉素选择性培养基筛选重组菌。
7)用IPTG诱导重组菌表达可溶性抗体AA98-Fab。
8)从胞周质中分离纯化抗体AA98-Fab。
9)ELISA和免疫印记鉴定可溶性AA98-Fab抗体片段。
10)核苷酸序列分析抗体AA98-Fab的基因并推导出其氨基酸序列如下抗体AA98轻链是由217个氨基酸组成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112113 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 128129 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 144145 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 160161 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 176177 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 192193 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 208209 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Trp 217抗体AA98重链Fd是由222个氨基酸组成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp lle Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 128129 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 144145 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 160161 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Cys Ala His Leu Pro Ala Val Leu Gln 176177 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Met Thr Val Thr Ser Ser Thr 192193 Trp Ala Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser208209 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Asn Gly Ala Thr Ser222实施例四单链抗体AA98-scFv的制备小分子单链抗体AA98-scFv的特点是保留着抗体AA98的特异性且分子量小，免疫源性小，穿透力强，有利于作为载体携带药物和毒素。制备方法如下1)设计引物轻链可变区引物5’primer for VL(25mer) ccg gag ctcgtg atg aca caa tct c和3’primer for VL(26mer) gc tct aga ccgttt tat ttc cag ctt重链链可变区引物5’primer for VH(27mer)ccg ctc gag tct gga gct gag ctg gtg和3’primer for VH(26mer)gg act agt tga gga gac ggt gac cgt。
2)以抗体AA98-Fab基因为模板，用PCR方法分别扩增抗体的轻重链可变区基因。PCR反应进行30个循环。每个循环的条件是94℃变性30s,55℃退火90s,72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10min。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
3)把扩增的抗体可变区基因克隆到pComb3H表达载体上，构建VH-linker-VL融合基因。
4)单链抗体AA98核苷酸序列分析以及推导出的氨基酸序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser 112113 Arg Arg Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly GLy Pro Gly Gly GLy GLy Ser 128129 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 144145 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 160161 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 176177 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 192193 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 208209 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 224225 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 240241 Thr Val Thr Val Ser Ser5)构建可溶性单链抗体高效表达载体。6)氨苄青霉素筛选分泌抗体的重组菌，IPTG诱导培养，离心收集含有可溶性抗体功能片段的上清。7)ELISA，免疫印记和免疫组化鉴定可溶性抗体AA98-scFv片段。8)层析分离纯化单链抗体。
权利要求
1．一类对新生血管具有特异反应的抗体及其功能片段，其特征在于这类抗体包含杂交瘤单克隆抗体和基因工程抗体，它们能够特异识别新生血管内皮细胞膜抗原，具有诱发ADCC和CDC的能力，这类抗体本身及其结合物均可以抑制新生血管的形成，具有特异而广谱的抗癌作用。
2．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于这类抗体可以是一种鼠单克隆抗体，命名为AA98。
3．根据权利要求2所述的抗体，其特征在于抗体可以是一种由杂交瘤HE2A5产生的AA98抗体。
4．根据权利要求3所述的杂交瘤HE2A5，其特征在于用肿瘤细胞培养上清诱导人脐静脉内皮细胞增生，并用增生的血管内皮细胞免疫小鼠，获得分泌抗体AA98杂交瘤的方法。
5．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于抗体可以是一种人-鼠嵌抗体ChiAA98，它含有权利要求2所述抗体AA98的可变区和人抗体的恒定区，其抗原结合区竞争抑制抗体AA98与其靶抗原的特异性结合。
6．根据权利要求5所述抗体ChiAA98，其特征在于该抗体是由CHO-AA98工程细胞系产生。
7．根据权利要求2或5所述的抗体，其特征在于抗体重链可变区和轻链可变区基因导的氨基酸序列。抗体重链可变区是由118个氨基酸组成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser 118抗体轻链可变区是由112个氨基酸组成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112
8．如权利要求1所述的抗体，其特征在于抗体可以是一种Fab功能片段(AA98-Fab)，该抗体基因推导出的氨基酸序列如下，抗体AA98-Fab轻链是由217个氨基酸组成，序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 112113 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 128129 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 144145 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp GIy Ser Glu Arg Gln Asn 160161 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 176177 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 192193 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 208209 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Trp 217抗体AA98-Fab重链Fd是由222个氨基酸组成，序列如下1 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 3233 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 4849 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 6465 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 8081 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 9697 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 112113 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 128129 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 144145 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 160161 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Cys Ala His Leu Pro Ala Val Leu Gln 176177 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Met Thr Val Thr Ser Ser Thr 192193 Trp Ala Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 208209 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Asn Gly Ala Thr Ser 222
9．如权利要求1所述的抗体，其特征在于抗体可以是一种单链抗体AA98-scFv，该抗体基因推导出的氨基酸序列如下1 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1617 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 3233 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 4849 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 6465 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 8081 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 9697 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser 112113 Arg Arg Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly GLy Pro Gly Gly GLy GLy Ser 128129 Glu Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 144145 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 160161 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp lle 176177 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 192193 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 208209 Met Leu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Phe Cys 224225 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 240241 Thr Val Thr Val Ser Ser 246
10．如权利要求2、5、8、9中任何一项所述的抗体，其特征在于其中任何一种抗体可以是一种重组蛋白质，它含有权利要求2、5、8、9中任何一项所述的抗体氨基酸序列，及其具有类似功能的抗体衍生物。
11．如权利要求2、5、8、9、10中任何一项所述的抗体及其衍生物，其特征在于抗体结合物，其中任何一项所述的抗体与其结合的物质可以是一种抗肿瘤药物，一种毒素，一种放射活性剂，一种酶或另一种抗体。
12．根据权利要求1所述的特异识别新生血管抗体，其特征在于这类抗体如权利要求2、5、8、9、10所述的任何一种抗体及其衍生物可应用于人体肿瘤成像定位诊断。
13．如权利要求2、5、8、9、10所述的任何一种抗体及其衍生物，其特征在于本发明所述任何一种抗体所识别的相应靶分子抗原。
14．如权利要求13所述的靶抗原，其特征在于本发明所述任何一种抗体所识别的靶分子抗原可以应用于药物筛选和肿瘤疫苗。
15．如权利要求2、5、8、9、10所述的任何一种抗体及其衍生物，其特征在于其中任何一种抗体可应用于新生血管有关的免疫效应和基础理论研究。
全文摘要
本发明是利用生物技术研制出的一类抑制肿瘤生长和转移的新型抗体。本发明包括:鼠单克隆抗体AA98,人－鼠嵌合抗体ChiAA98,和抗体AA98的Fab和Fv功能片段。这类抗体的特点在于特异识别肿瘤新生血管,具有诱发ADCC和CDC的能力,特异而广谱地抑制肿瘤的生长和转移。这些抗体本身或抗体结合物都将成为具有广谱抗癌作用的高效低毒新型药物。同时也可用于肿瘤的早期诊断,以及肿瘤与其血管相互作用的基础研究。
文档编号A61P35/04GK1234405SQ9910758
公开日1999年11月10日 申请日期1999年5月25日 优先权日1999年5月25日
发明者阎锡蕴, 袁玖, 李力, 吴小平 申请人:中国科学院微生物研究所