专利名称：治疗类风湿性关节炎的包含组蛋白的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及组蛋白H1在改善关节炎之炎性症状中的应用。组蛋白H1降低关节炎的诱发，而且与常规药物相比，可更有效地降低关节炎指数，还具有显著的预防效果。
背景技术：
本发明涉及用于改善进行性、炎性和自体免疫性关节炎之症状的生理活性化合物及包含该化合物的组合物。尽管已研制出许多的抗关节炎药物，但由于老龄人口的增加，关节炎在世界范围内仍是一种严重的疾病。虽然由关节炎导致的死亡非常低，但该病患者的生活质量却由于活动能力较差而受到损害。
在许多类型的关节炎中，最显著的一种是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是由于自体反应性T淋巴细胞的作用而诱发的自体免疫性疾病。T淋巴细胞通过迟发型超敏反应而导致类风湿性关节炎。尚未完全认识到哪一种抗原被T淋巴细胞识别而导致该疾病的产生。已知II型胶原是最有可能的一种，但不排除其他的可能性。已发现了抗组蛋白自体抗体，但还未明确该抗体是否是所述疾病的产生原因。
已使用许多药物来治疗类风湿性关节炎，但没有对其症状产生完全的缓解。常规药物包括非甾体抗炎药(NSAID，阿斯匹林、布洛芬)、金盐、青霉胺、和甾体激素。甾体激素是效力最强而且也是最有效的药物，但长期使用时会产生副作用。最近，人们正在试验在炎症机理中起主要作用的肿瘤坏死因子(TNF)的重组可溶性受体，来作为类风湿性关节炎的新治疗药物。但是，对于治疗类风湿性关节炎的症状，如炎症、浮肿、新血管的异常形成、软骨破损和骨侵蚀，仍需要更好的制剂。
已使用胶原诱导的关节炎(CIA)作为T淋巴细胞样类风湿性关节炎的动物模型(对II型胶原的自体免疫关节炎的实验模型，J.Exp.Med.146857-868(1977))。在将II型胶原注射入易发展成关节炎的小鼠时，在2周中即可诱发出关节炎，其症状是形成血管翳、软骨和骨侵蚀。与类风湿性关节炎类似，CIA也对胶原产生激素和细胞免疫应答。
组蛋白是细胞核成分中的主要一种，并与核酸形成染色体。从除人以外的哺乳动物中已分离出许多不同类型的组蛋白(H1)。对于组蛋白H1的各种生理活性已有许多报道。
Biochem.J.，第244卷，675-682，1987报道了在牛血浆和牛奶中发现并分离了水溶性组蛋白H1。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82卷，4871-4875，报道了体内平衡胸腺激素(HTH)的主要成分是组蛋白H1。组蛋白自由地在淋巴和血管中循环，而且由于具有诸如控制其他激素分泌的能力而起到类似于激素的作用。
Ann.J.Med.Sci.，第250卷，79-85，1965也报道了HTH疗法可增强免疫系统，并解决与胸腺切除术有关的免疫学问题。WO85/03003A提示出，在胸腺切除术或胸腺的放射疗法后，使用具有胸腺激素特征的组蛋白H1片段可起到免疫学疗法的作用，防止白血病。第5,182,257号美国专利公开了组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4可作为淋巴瘤或白血病的治疗药物。
化学文摘74，85743(1971)报道称，在与T2噬菌体一起给药时，组蛋白H1亚单位可减量调节T2噬菌体之抗体的形成。化学文摘73，96837(1970)报道了在皮肤移植后使用组蛋白H1作为免疫抑制剂。
Nature，第360卷，33-39，1992报道称，组蛋白H1可稳定海胆的鞭毛微血管结构。J.Biol.Chem.，第259卷，15523-15531，1984报道称，与从马脑中分离的微管共同作用，组蛋白H1可诱导小管的聚集，该小管与微管的环形结构类似。
但是，现有文献还没有提示使用组蛋白H1作为治疗类风湿性关节炎的药物。
附图简述
图1是显示在给药组蛋白H1后类风湿性关节炎的诱导作用的变化的图(I…I接种胶原后没有治疗(对照组)；▲_▲服用预防效果的地塞米松的组；▲...▲服用治疗效果的地塞米松的组；n-n服用预防效果的组蛋白H1的组；n...n服用治疗效果的组蛋白H1的组)。
图2A是显示组蛋白H1对类风湿性关节炎的预防效果的图(I…I接种胶原后没有治疗(对照组)；▲_▲注射地塞米松的组；n-n注射组蛋白H1的组)。
图2B是通过关节炎指数随时间的变化来显示组蛋白H1对类风湿性关节炎的治疗效果的图(I...I接种胶原后没有治疗(对照组)；▲_▲注射地塞米松的组；n-n注射组蛋白H1的组)。
图3A是胶原接种后6周时对照组中表现出浮肿的小鼠的前肢的照片。
图3B是胶原接种后6周时给药组蛋白H1的小鼠的前肢的照片。
图4A和4B是胶原抗原接种后10周时表现出血管翳形成、软骨损坏、骨侵蚀并有炎性细胞出现的对照组小鼠的膝关节的切片(P＝血管翳，C＝软骨，J＝关节空间)。
图4C是胶原抗原接种后10周时进行组蛋白H1治疗的实验组小鼠的膝关节的切片(P＝血管翳，C＝软骨，J＝关节空间)。
发明概述本发明的一个目的是提供一种药物组合物，该组合物可比常规制剂更为有效地改善进行性、炎性和自体免疫关节炎的症状。
本发明的另一个目的是提供一种包含组蛋白的药物组合物，以改善进行性、炎性和自体免疫关节炎的症状。
本发明的再一个目的是提供一种包含组蛋白的药物组合物，以预防进行性、炎性和自体免疫关节炎的发病。
本发明的再一个目的是提供一种降低患者之类风湿性关节炎症状的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的组蛋白。发明详细描述本发明涉及组蛋白的新用途，并提供包含组蛋白作为活性成分的药物组合物，以改善进行性、炎性和自体免疫关节炎的症状。
症状缓解包括(1)改善与关节炎有关的症状；(2)预防进行性疾病的发展；以及(3)预防在易患关节炎之个体中的侵入。
本发明的药物组合物包括作为活性成分的组蛋白、特别是组蛋白H1，而且如果需要还可包括药物学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可以其本身或者与其他常规关节炎药物复合使用。
为确定自体免疫类风湿性关节炎的症状是否已被组蛋白H1的治疗缓解，可向已患有关节炎或者易于患有关节炎的哺乳动物给药组蛋白H1亚单位。在实验小鼠中诱发胶原诱导的关节炎，其是众所周知的类风湿性关节炎动物模型(实施例1)。
在本发明中，哺乳动物可扩大至人，而关节炎可扩大至类风湿性关节炎。本发明对分离组蛋白的物质没有限制。同样，组蛋白可扩大至组蛋白2A、H2B、H3和H4或它们的混合物。
另外，本发明涉及一种降低患者之类风湿性关节炎症状的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的组蛋白。
本领域技术人员可容易地确定组蛋白H1足以预防关节炎之症状的需要量。
在本发明中，给药间隔为3-4天，但该间隔也可延长至1、2或4周。理想的给药途径是静脉或腹膜内注射，但也可使用其他的方法。
根据医生的诊断或处方给药后，观察症状的发展或患者的反应，由此可控制最有效的给药途径、剂量和间隔。
以下将通过实施例来进一步详细地描述本发明，但这些实施例并不是对本发明范围的限制。
为估算各实验组的平均值，在本发明的实验中使用Student′s t-检验。用Chi-square检验来估算标准偏差。如果p＜0.05，则认为结果具有统计学上的显著性。实施例1在实验小鼠中诱导类风湿性关节炎诱导关节炎从Charles River Japan进口5周龄DBA/1J雌性小鼠，并使它们适应动物房间2周，在7周龄时将它们用于实验(20-25g)。
以2mg/ml的浓度将已分离并定量的鸡II型胶原(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO，USA)溶解在0.1 N乙酸中。在4℃下将该溶液与等量的完全Freund′s佐剂混合，形成悬浮液。将100微升该混合物围绕尾静脉的端点进行静脉注射，然后在第一次注射后的第3和6周进行进一步的接种(D.E.Trentham等人，Autoimmunity to Type II collagenAnExperimental Model of Arthritis，J.Exp.Med.146857-868(1977))。第一次注射后的4周起诱导出关节炎。估算关节炎检查关节炎的临床发病率(C.I.A.)和关节炎指数。C.I.A.以全部小鼠中患有关节炎症状的小鼠的百分数来表示。以关节炎指数表示的炎症程度如下分为0-3类，并由2位研究人员每周观察。给药胶原后6周时拍摄一些小鼠的脚部照片。
0正常1略微肿胀和/或红斑2有限的浮肿性肿胀3严重的浮肿和关节僵直计算4只爪(2只后爪和2只前爪)的关节炎指数，最大值为12。6-8的指数被认为是严重的，因为胶原诱导的关节炎通常主要侵入后爪。实施例2组蛋白H1的提取和分离从Boehringer Mannheim(目录号223549，冻干物，得自于牛胸腺，具有电泳均匀性)得到组蛋白H1用于实验中。实施例3组蛋白H1对关节炎的预防作用给药组蛋白H1作为检查预防作用的实验组，从第一次注射后的第3周起(诱导关节炎之前)至第10周，每周2次通过腹膜内注射向10只小鼠给药1mg/kg体重的组蛋白H1。组蛋白H1在PBS中稀释至5mg/ml的浓度。作为比较组，从第一次注射后的第3周起(诱导关节炎之前)至第10周，每周2次通过腹膜内注射向10只小鼠给药1mg/kg体重的地塞米松——当前抗类风湿性关节炎药物。作为对照组，从第一次胶原注射后的第3周起至第10周，每周2次通过腹膜内注射向20只小鼠给药300μl的PBS。关节炎诱导作用和关节炎指数的估算在每个组的小鼠中接种抗原后，观察诱导关节炎4周。在胶原注射后没有进行治疗的对照组中，接种后4周开始关节炎诱导作用(30％)。C.I.A.在第5和6周时为64.3％，在第7周时为100％。与该结果相比，注射组蛋白H1的实验组小鼠在第6周时完全防止了关节炎诱导作用。实验组的C.I.A.在第7和8周时为60％，在第10周时为80％。注射常规地塞米松的对比组小鼠在4-10周时具有20-30％的C.I.A.。
对比组的关节炎指数是严重性的，抗原接种后，在第4周时为1.50±0.55，在第5周时为3.00±1.00，在第8周时为具有最大值6.00±2.05(图2A和2B)。与该结果相比，接种后第7周时才在实验组中观察到关节炎，其关节炎指数为对照组的60％。在有关节炎的小鼠中，关节炎指数约为对照组的一半，在第8周时其值为2.67±1.15，在第10周时为2.25±1.26，这表明预防作用至少持续10周。在注射地塞米松的小鼠中，在第5和6周时的关节炎指数分别为2.00和1.50，这表明其预防作用最多持续6周，低于组蛋白给药组。估算免疫反应抗胶原抗体浓度在第10周时，通过心脏穿刺得到血样，并由其中分离血清。将该血清保存在-80℃下，并在实验前才将其溶化，以通过ELISA法(D.E.Tretham & R.A.Dynesius-Trentham，J.Immunol.1302689-2692(1983))测量抗胶原抗体浓度。将在0.1 PBS中的II型胶原(25μg/ml)放入96孔聚苯乙烯微量板(Nunc，Denmark)的各个孔中，并在4℃下温育8小时。经培养后，用PBS-0.05％Tween 20溶液冲洗几次所述孔。为防止非特异性免疫反应，在各孔中加入PBS-0.5％卵清蛋白，并在室温下温育1小时，随后再用PBS-0.05％Tween 20溶液冲洗。血清用缓冲液稀释500倍，然后添加至各孔中，并在室温下反应2小时，再用PBS-0.05％Tween 20溶液进一步冲洗。使各孔与碱性磷酸酶结合山羊抗鼠IgA和IgM反应2小时并添加1mg/ml对硝基苯基磷酸酯后，测量450nm处的吸光度。每个样品的抗胶原抗体浓度测2次，并取平均值。
实验组的抗胶原抗体浓度为0.588±0.214(p＜0.00005)，对比组的值为0.925±0.075，前者显著低于后者。但是，因为抗胶原抗体浓度在各组中都比较高，生理作用并不是明显的。实施例4组蛋白H1的关节炎治疗作用给药组蛋白H1作为检查治疗作用的实验组，从第一次注射后的第6周起(诱导关节炎之后)至第10周，每周2次通过腹膜内注射向10只小鼠给药1mg/kg体重的组蛋白H1。组蛋白H1在PBS中稀释至5mg/ml的浓度。作为比较组，从第一次注射后的第6周起(诱导关节炎之后)至第10周，每周2次通过腹膜内注射向10只小鼠给药1mg/kg体重的当前抗类风湿性关节炎药物——地塞米松。对照组与实施例1的相同。关节炎诱导作用和关节炎指数的估算实验组的小鼠在抗原接种后的第6周时用组蛋白H1治疗，该组小鼠的C.I.A.在第6周时为37.5％，在第7周时降低为12.5％。该治疗作用持续至第10周，C.I.A.在第8和10周时为14.3％。在用地塞米松治疗的对比组中，C.I.A.在第7、8、和9周时分别为22.2％、33.3％和22.2％，这表明组蛋白H1的治疗效果整体上要更好。
接种后第5周时，经过组蛋白治疗的实验组的关节炎指数为3.33±0.58。在第6周时给药组蛋白H1后，C.I.A.仍与第5周时的相同，但关节炎指数降低为2.67±0.58。第7周后，2/3被诱导出的关节炎都痊愈。对于仍有关节炎的小鼠，在第7、8和10周时关节炎指数分别降低为1.00、2.00和1.00，这表明组蛋白H1对早已发展的类风湿性关节炎具有显著的治疗作用。用常规地塞米松治疗的对比组中，关节炎指数在第7、8和10周时分别为2.67、1.67和3.00(图2A和2B)。在给药胶原后的第6周时拍摄一些小鼠的前爪的照片。对比组的前爪产生浮肿，其为关节炎的一个症状，而在用组蛋白H1治疗的实验组中观察到浮肿的改善。估算免疫反应抗胶原抗体浓度如实施例3测量抗胶原抗体浓度，以估算免疫反应。实验组的抗胶原抗体浓度为0.540±0.170(p＜0.00005)，对比组的值为0.925±0.075，前者显著低于后者。但是，因为抗胶原抗体浓度在各组中都比较高，生理作用并不是明显的。通过H-E染色进行病理学观察由心脏放血，由此杀死小鼠。在杀死后立即切除各腿，并固定在甲醛中。去钙后，用苏木精—曙红染色各腿。通过H-E染色所进行的病理学观察表明，在抗原接种后的10周内在对照组的切片中观察到了血管翳的形成、软骨的侵蚀和炎性细胞的存在(图4A和4BP＝血管翳，C＝软骨，J＝关节空间)。
作为对比，在进行组蛋白H1治疗的实验组的切片中，在10周内没有观察到血管翳的形成、软骨的侵蚀和炎性细胞的存在，这表明其具有正常的组织结构(图4C)。
权利要求
1.一种治疗类风湿性关节炎的组合物，其包括治疗有效量的组蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组蛋白是组蛋白H1。
3.一种预防类风湿性关节炎的组合物，其包括治疗有效量的组蛋白。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述组蛋白是组蛋白H1。
5.一种降低患者之类风湿性关节炎症状的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的组蛋白。
全文摘要
本发明涉及组蛋白的新用途,并提供包含组蛋白作为活性成分的药物组合物,以改善进行性、炎性和自体免疫关节炎的症状。本发明的药物组合物包括作为活性成分的组蛋白、特别是组蛋白H1,而且如果需要还可包括药物学上可接受的载体。组蛋白H1降低关节炎的诱发,而且与常规药物相比,可更有效地降低关节炎指数,还具有显著的预防效果。
文档编号A61K38/00GK1255857SQ99800067
公开日2000年6月7日 申请日期1999年1月23日 优先权日1998年1月24日
发明者裴仁洙, 金东洙, 任惠准, 郑年哲, 李龙源, 洪承绪, 李贤秀 申请人:株式会社三养吉耐克斯