g，加入5%NaOH溶液80mL，于60°C水浴回 流反应l〇h，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷后加入浓盐酸调节PH值至 5~6,然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液近无色， 收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得白色霞草总次级皂苷提取物约 4g。
[0027] 实施例2 霞草药材(干燥根HOOg粉碎后，分别用10倍量80%、70%和60%乙醇各回流提取一次， 每次1. 5小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；过滤，滤液上HPD100型大孔树脂充分吸 附后，依次用水、20%乙醇、70%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集70%乙醇液洗脱液，减压浓 缩至无醇，减压蒸干，即得浅黄色霞草总皂苷提取物约15g。
[0028] 取上述方法制备的霞草总皂苷提取物8g，加入20%Na0H溶液40mL，于100°C沸水 浴回流反应lh，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷，加入浓HCL调节值至 5~6。然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、70%乙醇液洗脱至洗脱液近无色， 收集70%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得类白色霞草总次级皂苷提取物 约 3. 2g。
[0029] 实施例3 霞草药材(干燥根HOOg粉碎后，分别用10倍量30%、20%和10%乙醇各回流提取一次， 每次0. 5小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；高速离心，离心上清液上AB-8型大孔树 脂充分吸附后，依次用水、20%乙醇、40%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集40%乙醇液洗脱 液，减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得浅黄色霞草总皂苷提取物约17g。
[0030] 取上述方法制备的霞草总皂苷提取物8g，加入l%NaOH溶液240mL，于80°C水浴 回流反应I. 5h，至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失。放冷，加入浓HCL调节值至 5~6。然后上大孔树脂柱充分吸收后，依次用水、20%乙醇、40%乙醇液洗脱至洗脱液近无色， 收集40%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至稠膏，冷冻干燥，即得类白色霞草总次级皂苷提取物 约 3. 4g。
[0031] 对比例1 霞草药材(干燥根）100g粉碎后，分别用8倍量60%、50%和40%乙醇各回流提取一次， 每次1小时，合并三次提取液，减压浓缩至无醇；高速离心，离心上清液上DlOl型大孔树脂 充分吸附后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液近无色，收集50%乙醇液洗脱液， 减压浓缩至无醇，减压蒸干，即得得浅黄色霞草总皂苷提取物约20g。
[0032] 对实施例1和对比例1制备的霞草提取物进行了体外对肿瘤细胞的抑制作用试 验，详情如下： 一、本发明霞草总皂苷及其总次级皂苷体外对肿瘤细胞的抑制作用： 1)细胞系与试剂：Bel-7402(肝癌），BGC-823(胃癌），MCF-7(乳腺癌），HCT-8(结 肠癌），A2780(卵巢癌），KB (口腔上皮癌），Hela(宫颈癌），PC-3M(前列腺癌转移株）， A549(肺腺癌）。DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。小牛血清、非必需氨基酸购自 Hyclone公司。胰蛋白酶、MTT试剂购自Sigma公司。
[0033] 2)受试药物：本发明的实施例1制得的霞草提取物；对比例制备的霞草提取物。阳 性对照药物为阿霉素（Doxorubicin). 3)细胞培养：9种肿瘤细胞均用含10%小牛血清培养液于37°C，5%C02及饱和湿度条 件下培养。取对数生长期状态良好的细胞，用〇. 25%胰蛋白酶消化细胞后计数，调整细胞数 约为I X 10~5个/mL，接种于96孔板内，100 μ L/孔，至于C02孵箱内培养24小时；将霞草 总次级皂苷和霞草总皂苷用质量分数为〇. 9%的氯化钠注射液溶解，过滤除菌，制成不同质 量浓度药液，药物终浓度为12. 5、25、50、100、200、400、800 μ g/ml，共6个剂量组，每个剂量 组设5个复孔，同时以含0. 02%二甲亚砜的培养液为阴性对照组，以阿霉素为阳性对照组。 置于C02孵箱内37°C培养48小时后，终止培养。每孔加 MTT溶液（5 mg /ml) 1〇 μ L，置于 C02孵箱内4小时后取出，倾去孔内液体，每孔加200 μ L二甲基亚砜，充分振荡使其充分溶 解，置酶标仪于560nm波长处记录吸光度（OD)值，取各剂量组中受试药物的3个复孔OD 值平均数，计算细胞的抑制率及IC50。
[0034] 按下式计算细胞抑制率： 细胞抑制率（％)=(阴性对照组OD值一受试物组OD值）/阴性对照组OD值X 100%。 [0035] 以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的 半数抑制浓度（IC5tl)，结果见表1。
【主权项】
1. 一种霞草提取物的制备方法，包括下述的步骤： (a) 霞草干燥根为原料，以4-10倍量的10-80%乙醇回流提取2-3次，每次0. 5-1. 5小 时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上大孔树脂柱，以 乙醇-水系统梯度洗脱，合并40-70%乙醇洗脱液，减压蒸干，得到霞草总皂苷； (b) 将1重量份步骤（a)中所得的霞草总皂苷和5-20重量份1-10%氢氧化钾或氢氧化 钠水溶液于40-KKTC水浴中温热或回流进行反应1-40小时，至反应液中的霞草总皂苷提 取物主斑点消失；反应液放冷后加酸调节pH值至5-6,然后上大孔树脂柱，以乙醇-水系统 梯度洗脱，合并40%-70%乙醇液洗脱液，减压回收乙醇至相对密度1. 08-1. 25的稠膏，冷冻 干燥，即得。
2. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中大孔树 脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。
3. 根据权利要求2所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中大孔树 脂柱为DlOl大孔树脂柱。
4. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（a)中乙 醇-水系统梯度洗脱为,先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上浓度乙醇洗脱， 收集40-70%乙醇洗脱液。
5. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（b)中氢氧化 钾或氢氧化钠水溶液浓度为5%，氢氧化钾或氢氧化钠的用量为10ml/g霞草总皂苷，水浴温 度为60°C,回流进行反应时间为10小时。
6. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（b)中大孔树 脂柱为D101、D1、HPD100、HPD300或AB-8大孔树脂柱中的一种。
7. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤（b)中乙 醇-水系统梯度洗脱为,先用20%以下的乙醇洗脱去除杂质，再用30%以上浓度乙醇洗脱， 收集40-70%乙醇洗脱液。
8. 根据权利要求1所述的霞草提取物的制备方法，其特征在于，详细步骤为： (a) 取霞草干燥根为原料，以6-8倍量的40-60%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并 提取液，减压浓缩至无醇味，过滤或高速离心，滤液或离心上清液上DlOl型大孔树脂充分 吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液无色，收集50%乙醇洗脱液，减压蒸 干，得到霞草总皂苷； (b) 步骤（a)中所得的霞草总皂苷加入5%氢氧化钾或氢氧化钠水溶液，氢氧化钾或氢 氧化钠水溶液的用量为l〇ml/lg霞草总皂苷，于60°C水浴中温热或回流进行反应10小时， 至反应液中的霞草总皂苷提取物主斑点消失；反应液放冷后加浓盐酸调PH值至5-6,然后 上DlOl大孔树脂柱，充分吸收后，依次用水、20%乙醇、50%乙醇液洗脱至洗脱液无色，收集 50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至相对密度1. 12-1. 18的稠膏，冷冻干燥，即得。
9. 权利要求1-6任一权利要求所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应 用。
10. 根据权利要求7所述的霞草提取物在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用，其特征 在于，所述癌细胞为肝癌细胞Bel-7402、胃癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞 HCT-8、卵巢癌细胞A2780、口腔上皮癌细胞KB，宫颈癌细胞Hela，前列腺癌细胞PC-3M，肺腺 癌细胞A549中的一种或几种。
【专利摘要】本发明属于天然药物领域，具体涉及一种霞草提取物的制备方法及其应用。本发明霞草提取物的制备方法，包括下述的步骤：（a）霞草干燥根为原料，经乙醇回流提取后上大孔树脂柱，以乙醇-水系统梯度洗脱，合并40-70%乙醇洗脱液，得到霞草总皂苷；（b）步骤（a）中所得的霞草总皂苷碱水解上大孔树脂柱，即得。本发明通过碱水解将大量存在于霞草根中没有抗肿瘤活性的，或活性较弱的总皂苷转变成具有强抗肿瘤活性的提取物。经药理实验证明，本发明的制备方法制备的霞草提取物具有优异的抗肿瘤活性。
【IPC分类】A61P35-00, A61K36-36
【公开号】CN104688798
【申请号】CN201510129709
【发明人】孙敬勇, 解龙霄, 汪海洋, 牟艳玲, 谢天封, 张浩超, 邓志鹏, 刘爱芹, 王凤玲, 王燕
【申请人】山东省医学科学院药物研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月24日