A. , Franklin, R. J. , et al. 2013. M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat Neurosci 16:1211-1218.)〇
[0005] 鉴于此，调控小胶质细胞的极化状态可能是治疗MS的一种潜在策略。但是目前对 于小胶质细胞这一中枢神经系统原位定居的吞噬细胞极化机制知之甚少，对于M2极化的 转录机制的调控机制依然不清，对于将小胶质细胞向特定状态极化尚无有效手段，更没有 一种方法能将小胶质细胞极化状态由Ml型转变并锚定在M2型表型。
[0006] MSX3(msh-like homeobox-3，GeneID:17703，NM-010836)序列如 SEQ ID N0:7 所 示，前人研究只在发育阶段的神经系统中发现MSX3的表达，并认为该分子同神经管的腹 背侧发育相关（Shimeld，S. M.，McKay，I. J.，and Sharpe，Ρ· T. 1996. The murine homeobox gene Msx_3shows highly restricted expression in the developing neural tube. Mech Dev 55:201-210. ；Wang, W. , Chen, X. , Xuj H. , and Lufkin, T. 1996. Msx3: a novel murine homologue of the Drosophila msh homeobox gene restricted to the dorsal embryonic central nervous system. Mech Dev 58:203-215·)。目前尚无 MSX3 在小胶质 细胞或疾病中的相关研宄。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供MSX3基因新的医药用途，具体是MSX3基因在制备治疗脱 髓鞘疾病、多发性硬化疾病（MS)药物中的应用；以及在促进小胶质细胞转为M2极化状态中 的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法。
[0009] 本发明的又一目的在于提供上述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制 备在治疗多发性硬化疾病（MS)药物中的应用。
[0010] 本发明的第一方面，提供了 MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。
[0011] 所述 MSX3 的序列如 SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 3 所示，SEQ ID NO: 3 是第 SEQ ID N0:7的第90-704位核苷酸片断，即MSX3开放阅读区、编码序列。
[0012] 进一步地，所述的脱髓鞘疾病是指多发性硬化。
[0013] 申请人研宄发现MSX3 基因（msh-like homebox-3，GeneID:17703, NM_010836)在 不同发病阶段的EAE模型小鼠的小胶质细胞中差异表达，在M2型小胶质细胞中选择性高表 达。过表达MSX3促进小胶质细胞M2极化，抑制其Ml极化。下调小胶质细胞中MSX3水平， 加速小鼠脱髓鞘和神经退行性变。而过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARy、 STAT6和激酶JAK3,分泌activin-A、IGF-I等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神 经突起生长，缓解EAE病情进展，并促进EAE和LPA模型小鼠的再髓鞘化进程。更有意思的 是，过表达MSX3的人源性小胶质细胞同样呈现M2表型，并缓解EAE病情进展。本研宄揭示 了一个驱动小胶质细胞M2极化的同源盒基因依赖性机制，MSX3有望成为促进再髓鞘治疗 的一个新祀点。
[0014] 本发明的第二方面，提供了 MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应 用。
[0015] 所述的应用，也即提供了一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法。
[0016] 本发明的主要技术方案如下：（一）根据MSX3的基因结构，制备MSX3cDNA序列， 构建MSX3过表达的真核表达载体，构建MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒。（二）将过表 达型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。（三）用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上 清与神经元或少突胶质细胞前体细胞共培。（四）MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒转染小 鼠和人小胶质细胞，并移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE)和溶血卵磷脂（LPA)诱导 的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室和脊髓中。（五）检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信 号通路和分泌因子。
[0017] 条件上清：慢病毒转染小胶质细胞12小时后为小胶质细胞换新鲜培液，72小时后 收集的该培液即为条件上清。
[0018] 进一步地，所述促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法的具体步骤为：经MSX3过 表达型（MSX3-GFP)慢病毒转染72小时后呈M2极化状态的小鼠和人小胶质细胞。
[0019] A、构建MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒
[0020] 设计并合成引物如下：
[0021] Pl：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID NO:I)
[0022] P2 ：TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO :2)；
[0023] 以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA (SEQ ID NO:3)〇
[0024] MSX3cDNA(SEQ ID Ν0:3)序列如下：
[0025] Atggcccgggcgacattcgacatgaacgcggcggggctcgaagctcgcggcgggggccacacagagc acggaccactccccttcagcgtcgagtctctgctggaggctgagcgcgtaccgggctccgagtctggggagctgg gggtggagaggccgctcggcgcctcgaagcctggagcctggccccctccagtcgcgcactcttgtcccccacgtg ccccgagccctccaccctgcaccctccgcaaacacaaaaccaatcgcaaaccacggacgccattcaccaccgcgc agctgctggcgcttgagcgcaagtttcaccagaagcaatacttatccattgcggagcgcgccgagttctccagca gcttgagcctcactgagactcaggtcaagatctggtttcagaaccgccgagccaaagccaagcggctgcaggaag ctgagetggagaagctgaagctggcagcgaagccactactgccggcggcgtttgccctgcccttcccgctgggca cccagctgcacagctccgcggccactttcggcggcaacgcggttcctgggatcctcgccgggcctgtcgcggcct atggcatgtactacttgtcttag
[0026] 对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
[0027] B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细 胞。
[0028] 其中的慢病毒载体的构建方法可参见工具书（萨姆布鲁克拉塞尔主编，分子克隆 实验指南III，科学出版社）。也可以用以下的具体步骤：
[0029] (1)设计并合成引物如下：
[0030] MSX3-Age I-F 如 SEQ ID N0:1 所示，
[0031] MSX3-Age I-R 如 SEQ ID N0:2 所示；
[0032] (2)采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线性化模板；
[0033] (3)使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切；
[0034] (4)PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，制备过表达质粒Ubi-MSX3-3FLAG-SV40 -EGFP (MSX3-GFP)的慢病毒；
[0035] (5)MSX3-GFP慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞；
[0036] (6)将MSX3-GFP慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞移植入小鼠自身免 疫性脑脊髓膜炎（EAE)和溶血卵磷脂（LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠（构建方 法参见 Miron, V. E.，Boyd, A.，Zhao, J. W.，Yuen, T. J.，Ruckh，J. M.，Shadrach，J. L. , van Wijngaardenj P. , Wagers, A. J. , Williams, A. , Franklin, R. J. , et al. 2013. M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat Neurosci 16:1211-1218.)的侧脑室和脊髓中；
[0037] (7)检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信号通路和分泌因子。
[0038] 其中步骤 B 参见（Balcaitis，S.，Weinstein，J. R.，Li, S.，Chamberlain，J. S.，and Mollerj T.