2005. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia 50:48-55.)，也可 以用以下的具体步骤：
[0039] 实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种I X IO5个小胶质细胞于24孔 培养板中，所加培养基体积为500 μ L。（细胞的融合率约为30~50%左右）。
[0040] (1)先将三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为 IX 105TU，IX 106TU，5X IO6TU,三个孔的感染系数（MOI)分别为 1、10、50。
[0041] (2)每孔中加入10 μ L的Polybrene稀释液。
[0042] (3)在水平方向轻轻晃动培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板 放回培养箱孵育。
[0043] (4)培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。
[0044] (5)感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当 延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。
[0045] (6)通过细胞感染效果，确认MOI值>10可获得好的感染效果。得到M2极化状态 的细胞就可移入小鼠体内进行下一步实验。
[0046] (以上第5步所得细胞为M2极化状态的细胞，得到M2极化状态的细胞就可移入小 鼠体内进行下一步实验。）
[0047] 本发明的第三方面，提供了一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，该方法 包括但不限于：
[0048] A、构建MSX3过表达的慢病毒；
[0049] 设计并合成引物如下：
[0050] Pl：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID N0:1)
[0051] P2 ：TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO :2)；
[0052] 以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA (SEQ ID NO:3)；
[0053] 对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
[0054] B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细 胞。
[0055] 进一步地，本发明还提供上述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制备 在治疗多发性硬化疾病（MS)药物中的应用。
[0056] 用原位杂交和细胞组化方法验证并观察转染小鼠小胶质细胞的MSX3核酸水平和 形态变化。实验结果：镜下可见下调MSX3核酸水平的小胶质细胞呈阿米巴样形态，符合Ml 极化特征，上调MSX3核酸水平的小胶质细胞呈分支样，符合M2极化特征。
[0057] 用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上清与神经元或少突胶质细胞前体细 胞共培，检测神经元或少突胶质细胞前体细胞生存力、分化和退行性变。MSX3干扰病毒转染 的小胶质细胞的条件上清对神经元存在毒性作用，并抑制少突胶质细胞前体细胞的分化成 熟，而MSX3过表达型慢病毒转染小鼠小胶质细胞促进少突胶质细胞前体细胞的分化成熟。
[0058] 构建小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE)和溶血卵磷脂（LPA)诱导的脱髓鞘模型小 鼠。将MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞，并采用脑立体定位手 术将细胞移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE)和溶血卵磷脂（LPA)诱导的脱髓鞘模型 小鼠的侧脑室和脊髓中。MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞均明 显抑制了 EAE病情进展，减少局部炎细胞浸润，并促进脊髓神经轴突的再髓鞘化。
[0059] 采用RNA-IP、Q-PCR、ELISA在小胶质细胞中检测MSX3下游信号通路和特异细胞 分泌因子。结果发现过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARy、STAT6和激酶 JAK3,分泌IGF-I等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长，缓解EAE病情 进展，并促进EAE和LPA模型小鼠的再髓鞘化进程。
[0060] 本发明的第四方面，提供了上述促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法得到的 功能性小胶质细胞。
[0061] 本发明的第五方面，提供了上述功能性小胶质细胞在制备治疗脱髓鞘疾病中的应 用。
[0062] 如前所述，M2型小胶质细胞的缺失很可能是导致慢性非活动性MS病灶处再髓鞘 失败的重要因素。目前对于小胶质细胞这一中枢神经系统原位定居的吞噬细胞极化机制知 之甚少，对于将小胶质细胞向特定状态极化尚无有效手段，我们的研宄发现上调MSX3可 以将小胶质细胞锚定在M2型极化状态（图2)，并从体外和体内实验证明其能促进脱髓鞘病 灶再髓鞘化和神经突起生长（图4,6,7)。更有意思的是，过表达MSX3的人源性小胶质细胞 同样呈现M2表型，显著缓解EAE病情进展。综上，MSX3有望成为促进再髓鞘治疗的一个新 靶点。
[0063] 此外，发明人对抑制其Ml极化也作了相关研宄。
[0064] 本发明的主要技术方案如下：（一）根据MSX3的基因结构，制备MSX3干扰RNA序 列，构建MSX3干扰的真核表达载体，构建MSX3干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒。（二）将过干 扰型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。（三）用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上 清与神经元或少突胶质细胞前体细胞共培。（四）MSX3干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒转染小 鼠和人小胶质细胞，并移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE)和溶血卵磷脂（LPA)诱导 的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室和脊髓中。（五）检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信 号通路和分泌因子。
[0065] MSX3干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒构建。该方法包括：
[0066] A、构建MSX3干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒载体；
[0067] B、将MSX3干扰型（MSX3i_GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。
[0068] 该方法具体包括
[0069] A、筛选并确定MSX3基因特定的干扰序列为：
[0070] 5,-GAGCATCTCAGATCTCCCATT-3'（SEQ ID N0:4)，
[0071] 5,-CAGGGTTAGGATGCTCTGGTT-3'（SEQ ID NO:5)，
[0072] 5' -AATCCGGACTTGTACCTTTAT-3'（SEQ ID NO:6);
[0073] B、连接到pGCL-GFP慢病毒载体中，构建MSX3干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒为： pGCL-MSX3i-GFP ；
[0074] C、MSX3i_GFP慢病毒转染小鼠小胶质细胞；
[0075] D、将MSX3i_GFP慢病毒转染小鼠小胶质细胞移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎 (EAE)的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室中。
[0076] 实验发现，上调MSX3表达的小鼠和人小胶质细胞转为M2极化状态，分泌促神经生 长因子和促少突胶质细胞分化和成髓鞘化的细胞因子。下调MSX3表达的小鼠和人小胶质 细胞转为Ml极化状态，分泌免疫炎症因子，加速神经元退行性变，抑制少突胶质细胞分化 和再髓鞘化。
[0077] 通过整体动物实验发现，小胶质细胞中的MSX3在EAE病程中整体上升，但在不同 发病阶段差异表达，峰值期达峰，后期逐步下调；进一步在体外实验中发现其在M2极化小 胶质细胞中上调，24小时达到高峰（图1)。过表达MSX3抑制小胶质细胞Ml极化和阿米巴 样形态（图2, 3)，促进其M2极化（图2)。共培实验中下调小胶质细胞中MSX3水平，加速小 鼠神经突起退行性变，而上调MSX3水平，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长（图 4)。将过表达MSX3的小胶质细胞移植到EAE小鼠的实验显示，过表达MSX3的小胶质细胞 缓解EAE病情进展，减少继发性炎细胞浸润和脱髓鞘程度，并促进EAE和LPA模型小鼠的再 髓鞘化进程（图5,6, 7)。而过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARy、STAT6和 激酶JAK3,分泌activin-A、IGF-l等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生 长。本研宄揭示了一个驱动小胶质细胞M2极化的同源盒基因依赖性机制。
【附图说明】
[0078] 图1，调控MSX3调节小鼠小胶质细胞极化状态；(A-D)病毒转染调控小鼠小胶质细 胞MSX3水平，Q-PCR观察小胶质细胞极化。（A，B)下调MSX3水平，促进小胶质细胞Ml极 化，抑制M2极化；（C，D)上调MSX3水平，促进小胶质细胞M2极化，抑制Ml极化。
[0079] 图2,上调MSX3促小鼠少突胶质细胞前体细胞分化和神经突起生长；(A)下调小胶 质细胞中MSX3水平抑制少突胶质细胞前体细胞分化成熟。（B)调节小胶质细胞的MSX3水 平对皮层神经元的突起有损伤和保护作用。
[0080] 图3,过表达MSX3的小鼠小胶质细胞缓解EAE进展；(A)移植MSX3过表达（MSX30E MG)和干扰（MSX3i MG)小胶质细胞的EAE小鼠病情评分，（B，C)病变脊髓LFB染色检测白 质脱髓鞘程度，（D，E)病变脊髓H-E染色观察炎细胞浸润程度。星号，脱髓鞘部位，箭头，炎 细胞浸润部位。（B，D)右图为方框放大图。
[0081] 图4,过表达MSX3的小鼠小胶质细胞促进再髓鞘化；(A) EAE评分，（B)脊髓电镜代 表图，（C)小鼠成髓鞘轴突百分