比，（D)病灶处脊髓平均有髓神经纤维G值。
[0082] 图5,过表达MSX3的小鼠小胶质细胞促LPC模型小鼠再髓鞘化进程；(A，B)病灶 处脊髓背侧脱髓鞘面积LFB染色及定量分析，（C-E)电镜检测脊髓成髓鞘轴突百分比（D)， 平均有髓神经纤维G值（E)。
[0083] 图6,过表达MSX3的人小胶质细胞呈M2极化，并缓解EAE进展；(A，B)过表达MSX3 的小胶质细胞上调IGF-I和⑶206水平，下调TNF- α水平，向M2极化；（C)过表达MSX3的 人源小胶质细胞移植入EAE小鼠可缓解EAE病情进展。
[0084] 图7，MSX3激活转录因子PPARy、STAT6和激酶JAK3相关M2极化信号通路。（A-C) 染色质免疫共沉淀检测发现15乂3可结合？?八1?丫、3了4了6和激酶从1(3的3'非编码区段， (D-F)免疫印迹检测可见过表达MSX3诱导PPARy、STAT6和JAK3表达上调，同时STAT6磷 酸化增加。MSX3结合PPARy、STAT6、JAK3并上调PPARy、STAT6、JAK3蛋白水平和磷酸化 STAT6 的蛋白水平。（A-C)MSX3 可结合在 PPARy、STAT6、JAK3 的 3' UTR。（D-F)MSX3 可以 上调PPARy、STAT6、JAK3蛋白水平和（7E)磷酸化STAT6的蛋白水平。
【具体实施方式】
[0085] 现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0086] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如萨姆布鲁克、拉塞尔主编《分子克隆实验指南III》 (科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比 和份数按重量计算。
[0087] 实施例1 :构建慢病毒过表达MSX3-GFP和干扰MSX3i-GFP，感染小鼠和人小胶质细 胞。
[0088] 1、小胶质细胞纯化制备
[0089] 原代培养制备小鼠小胶质细胞。人小胶质细胞来自SCIENCELL公司。
[0090] 2、制备小胶质细胞总RNA
[0091] 用上海生工生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获 得人表皮细胞总RNA。方法如下：
[0092] 取一皿直径3. 5cm的培养皿的单层生长的小胶质细胞，直接弃去培养基，加入1ml 的TRIzoI溶解细胞，细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物移出。将细胞裂解样品在 15~30°C条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。每1ml TRIzoI加0.2ml氯仿，盖紧 样品管盖后用手摇晃试管15秒并在30°C下孵育2~3分钟。在2~8°C条件下以不超 过12, OOOXg的离心力冷冻离心15分钟。离心后的混合物可分成三层：下层为红色的苯 酚-氯仿层，中间层和上层无色的水样层。RNA存在于上层水样层当中，其容量大约为所加 TRIzol容量的60%。将水样层转移到一用DEPC处理过的，无 RNase的试管中，通过跟异丙 醇混合来沉淀RNA。每1ml TRIzol加入0. 5ml异丙醇。将混合的样品在15~30°C条件下 孵育10分钟然后在2~8°C条件下以不超过12, OOOXg的离心力高速冷冻离心10分钟。 RNA沉淀在离心后可以形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。用75%的乙醇（用DEPC 处理过的超纯水进行配制）洗绦RNA沉淀一次，每1ml的TRIzol至少加入1ml的75%乙 醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C条件下以不超过7, 500Xg的离心力高速冷冻离心5 分钟。空气干燥5~10分钟RNA沉淀。不能让RNA沉淀完全干燥，会降低它的可溶性。用 DEPC处理过的超纯水溶解RNA样品。
[0093] 3、构建MSX3过表达型（MSX3-GFP)慢病毒和干扰型（MSX3i-GFP)慢病毒
[0094] A、设计并合成引物如下：
[0095] MSX3_Age I-F :
[0096] GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID N0:1)
[0097] MSX3-Age I-R ：
[0098] TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO :2)
[0099] 采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线性化模板，方法如 下：反应体系：P1 〇.4yL，P2 0.4yL，10X 缓冲液 2.0yL，MgCl20.5yL，dNTPs(2.5mmol/ L) 0. 8 μ L，Taq多聚酶0. 2 μ L，模板I μ L(阴性对照组不加），由ddH20配置为20 μ L。PCR 反应条件：94°C热启动30s - 94°C变性30s - 60°C复性30s - 72°C延伸30s，30个循环， 最后 72°C 聚合 6min。得到 MSX3cDNA(SEQ ID N0:3)。
[0100] 挑选阳性克隆，送生工公司进行测序鉴定，测序正确。
[0101] 使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切；
[0102] 酶切反应体系：
[0103]
【主权项】
1. MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的所述的MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特 征在于，其中所述脱髓鞘疾病是指多发性硬化。 3. MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用。
4. 根据权利要求3所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其 特征在于，所述的应用为一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，具体步骤为： A、 构建MSX3过表达型慢病毒 设计并合成引物如下： Pl 如 SEQ ID NO: 1 所示； P2 如 SEQ ID NO:2 所示； 以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA，MSX3cDNA的序列 如 SEQ ID NO:3 所示； 对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒； B、 将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
5. 根据权利要求4所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其 特征在于，其中的步骤A中采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线 性化模板； 使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切； PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，制备过表达MSX3的慢病毒MSX3-GFP ; MSX3-GFP慢病毒转染小鼠或人小胶质细胞。
6. 根据权利要求4所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其 特征在于，其中步骤B的具体步骤为： 实验前一天接种IX IO5个小胶质细胞于24孔培养板中，所加培养基体积为500 μ L，细 胞的融合率约为30~50% ; 先将三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中，加入的病毒量分别为IXlO5TU, 1父1061^，5\1061^，三个孔的感染系数分别为1、10、50; 每孔中加入10 μ L的Polybrene稀释液； 在水平方向轻轻晃动培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培 养箱孵育； 培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基； 感染3~4天后，观察荧光表达情况；对于生长缓慢代谢慢的细胞，延长观察时间，中途 换液，保持细胞的活性； 选择MOI值>10的M2极化状态的细胞。
7. -种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，该方法包括但不限于： A、构建MSX3过表达的慢病毒； 设计并合成引物如下： Pl ：SEQ ID N0:1 P2 ：SEQ ID N0:2 ； 以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA，MSX3cDNA的序列 如 SEQ ID NO :3 所示； 对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒； B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
8. 权利要求7所述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制备在治疗多发性硬 化疾病药物中的应用。
9. 权利要求7所述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法得到的功能性小胶质细 胞。
10. 权利要求9所述的功能性小胶质细胞在制备治疗脱髓鞘疾病中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程和医学领域，具体涉及MSX3基因特异诱导小胶质细胞选择性极化的方法及其在制备治疗多发性硬化疾病药物中的应用。本发明的主要技术方案如下：(一)根据MSX3的基因结构，制备MSX3 cDNA序列，构建MSX3过表达的真核表达载体，构建MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒。(二)将过表达型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。研究表明，过表达MSX3的小胶质细胞同样呈现M2表型，有效缓解了EAE病情进展。
【IPC分类】C12N15-12, C12N15-867, A61P25-00, A61K48-00, A61P37-02, C12N5-10
【公开号】CN104826130
【申请号】CN201510063521
【发明人】何成, 曹莉, 俞仲望
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年2月6日