ESI)m/z[M+H]+calcd for C25H37BrNO6:526. 1804 ；found 526. 1801.
[0028]
[0029] 实施例3 Daphmalenine A的0-(二乙胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0030] 将化合物II (263mg，0. 5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾 (345mg，2. 5mmol)，碘化钾（84mg，0. 5mmol)和二乙胺（1460mg，20mmol)，混合物加热回流 l〇h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取四次，合并有机相。依次用 水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产 物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化（流动相为：石油醚/丙酮=100:1，v/v)，收集黄色 集中洗脱带即得到Daphmalenine A的0-(二乙胺基）乙基衍生物（III)的黄色胶状固体 (196. 8mg, 76% ) 〇
[0031] 1H 匪R (500MHz, DMS0-d6) δ 3. 78 (s, 1H)，3. 68 (s, 3H)，3. 45 (s, 2H)，3. 09 (s ,1Η), 2. 94(d, J = 59. 8Hz, 5Η), 2. 79(s, 1Η), 2. 71 (d, J = 10. 0Hz, 2Η), 2. 63 (d, J = 1. 4Hz, 4Η), 2. 43 (t, J = 16. 7Hz, 3Η), 2. 36 (d, J = 5. 9Hz, 1Η), 2. 19 - 2. 12 (m, 5Η), 2. 09 - 2. 00 (m, 4Η), 1. 90 (dd, J = 10. 7, 8. 0Hz, 1Η), L 85 (d, J = 23. 9Hz, 1Η), 1. 72 (s, 1Η), 1. 65 (s, 1Η), 1. 13 (d, J = 7. 0Hz, 7Η), 1. 06 (s, 3Η).
[0032] 13C NMR (125MHz, ,DMS0-d6) δ 219. 80 (s) ,21L 16 (s), 176. 74 (s) ,66. 30 (s) ,63. 64 (s)，61. 62 (s)，59. 51 (s)，54. 88 (s)，52. 27 (s)，51. 99 (s)，47. 76 (s)，46. 30 (s)，46. 06 (s)，4 5· 55 (s)，45. 26 (s)，40. 31 (s)，37. 86 (s)，37. 63 (s)，36. 28 (s)，30. 87 (s)，28. 53 (s)，26. 01 ( s)，25. 23 (s)，12. 37 (s)，8· 50 (s).
[0033] HRMS(ESI) :m/z[M+H].calcd for C29H47N2O6:519. 3434 ;found:519. 3429。
[0034]
[0035] 实施例4化合物III抗肝纤维化活性
[0036] 由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是 TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞 上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
[0037] 实验例1 :化合物III对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用
[0038] 一、实验方法：
[0039] NIH/3T3细胞株购自引自 ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海细胞所细胞库。
[0040] 三乙胺（化合物IV)为市售分析纯。
[0041]
[0042] 将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0. 25%胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM 培养液（含10% FCS)制成IX IO4ceIVml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴定存活率大于95%， 按每孔IOOul加入96孔板中，在37°C、5% CO2培养24h同步处理后，弃上清，加入含有药物 的DMEM培养液（含10 % FCS) 200ul，培养48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加 入150ulDMS0,振荡10分钟，使结晶溶解，酶标仪490nm处读取OD值，结果以OD 49tl表示。
[0043] 二、实验结果：
[0044] 1、形态学观察
[0045] NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖的速度 快；而加药物化合物III 24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短，细胞排 列混乱，细胞内代谢产物增多。化合物IV无此作用。
[0046] 表1 :MTT法检测化合物III对NIH/3T3增殖的抑制作用
[0048] 注：#，与细胞阴性对照P〈0. 01
[0049] 结果：化合物III在20ug/ml对成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3的细胞增殖有显著的抑制作 用。表明化合物III体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。化合物IV无此作用。
[0050] 实验例2 :化合物III对转化生长因子-β i (TGF- β i)诱导的成纤维细胞增殖的抑 制作用
[0051] TGF-β i是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β dOng/ ml刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β 1诱导的细胞增殖的抑制作用，以分析判断化合物 ΙΠ 的作用机理。
[0052] 表2 :MTT法检测化合物III对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
[0055] 注：与细胞+TG F对照Ρ〈(λ 01
[0056] 结果：化合物III在20ug/ml对成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF-β 诱导下的细胞 增殖有显著的抑制作用，化合物IV无此作用。表明化合物III体外对纤维细胞增殖的抑制 作用可能是通过干预TGF信号通路实现的。
[0057] 结论：化合物III对成纤维细胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖 有显著的抑制作用；化合物III对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β 诱导下的细胞增殖有 显著的抑制作用。化合物III可以用来制备抗肝纤维化药物。化合物IV对成纤维细胞 见!1/3了3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖无显著的抑制作用，对成纤维细胞见!1/3丁3 在TGF-β i的诱导下的细胞增殖无显著的抑制作用，不可以用来制备抗肝纤维化药物。
[0058] 实施例5本发明所涉及化合物III片剂的制备
[0059] 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备片剂的常规辅 料180克，混匀，常规压片机制成1000片。
[0060] 实施例6本发明所涉及化合物III胶囊的制备
[0061 ] 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备胶囊剂的常规 辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。
【主权项】
1. 一种具有式in所示结构的DaphmalenineA衍生物（III)及其药学上可接受的盐 在治疗肝纤维化药物中的应用：2. 如权利要求1所述的DaphmalenineA衍生物（III)及其药学上可接受的盐在治疗 肝纤维化药物中的应用，其特征为抑制成纤维细胞增殖。3. 如权利要求1所述的DaphmalenineA衍生物（III)及其药学上可接受的盐在治疗 肝纤维化药物中的应用，其特征为抑制生长因子诱导的成纤维细胞增殖。4. 如权利要求3所述的DaphmalenineA衍生物（III)及其药学上可接受的盐在治疗 肝纤维化药物中的应用，其特征为所述生长因子为TGF-0 1。
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及Daphmalenine A衍生物、制备方法及其在制备抗肝纤维化药物上的用途。本发明合成了一个新的Daphmalenine A衍生物，并公开了其制备方法。药理学实验表明，本发明的Daphmalenine A衍生物具有抗肝纤维化的作用，具有开发抗肝纤维化药物的价值。
【IPC分类】A61K31/439, A61P1/16, C07D491/107
【公开号】CN104922120
【申请号】CN201510278748
【发明人】江春平, 吴俊华
【申请人】南京广康协生物医药技术有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月27日