。这些都属于本发明 的保护范围。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0028] 吗啡是阿片类镇痛药中应用的最为广泛的代表性药物，其它阿片类药物与吗啡具 有相似的作用机制，如在通过与阿片受体结合发挥强大镇痛效应的同时，都能诱导神经小 胶质细胞活化，并且这种神经小胶质细胞炎症影响其镇痛效应的发挥和促进耐受现象的发 生。因此，本实施例主要公开最经典的阿片类药物一一吗啡的研宄结果，吗啡具有广泛的 代表性，专业领域技术人员可以在其他的阿片类药物中重现类似的研宄结果。
[0029] 实施例1(急性镇痛效应增强实验）
[0030] a)试验动物：健康成年雌性ICR小鼠，清洁级，体重18-22g。实验动物饲养于 12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2°C，自由饮水和摄食，在适应环境1周后 进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研宄协会伦理委员会的要求。
[0031] b)试验药品及试剂：
[0032] 药物葛根素，纯度98%，市售。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0033] c)试验方法：
[0034] 葛根素及吗啡给药剂量和方法：葛根素用生理盐水溶解，给药剂量为60mg/kg，给 药方式均为灌胃（i. g.)。吗啡注射剂量分别为l〇mg/kg，给药方式为皮下注射（s.c.)。
[0035]ICR小鼠随机分为三组：吗啡模型组（10mg/kg)、葛根素60mg/kg伴随给药组和空 白对照组。治疗组小鼠在开始测定前15min给予葛根素60mg/kg，模型组和治疗组在开始测 定前30min皮下注射吗啡，随后进行疼痛的行为学测定。
[0036] 小鼠痛阈测定：于试验前及末次给药后0. 5h将小鼠尾1. 5-3. 0cm浸入恒温水浴 中（52±0.5°C)，用秒表记录鼠尾自浸入水中到出现甩尾动作的时间，作为甩尾反应的潜 伏期（tailflicklatency,TFL)，为防止组织损伤，若小鼠10s未甩尾，则TFL记为10s。 TFL用最大效应百分数MPE值表示，：MPE(%)=(给药后TFL-给药前TFLV(10-给药前 TFL)X100%〇
[0037] d)试验结果描述：
[0038] 如图1所示，为全身给予葛根素60mg/kg对皮下给予吗啡10mg/kg的镇痛效应示 意图，水浴甩尾法测定小鼠基础痛阈结果显示，葛根素可以显著提高对小鼠的甩尾反应潜 伏期（TFL)(图1)。以上结果表明：葛根素能够显著延长吗啡的镇痛时间，提升吗啡镇痛效 应。
[0039] 实施例2 (阿片耐受现象减轻实验）
[0040] a)试验动物：
[0041] 雌性ICR小鼠，清洁级，体重18~22g。实验动物饲养于12h~12h昼夜交替的独 立环境中，室温维持在24±2°C，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所 有处理均遵循国际疼痛研宄协会伦理委员会的要求。
[0042] b)试验药品及试剂：
[0043] 药物葛根素，纯度98%，市售。盐酸吗啡，购自沈阳第一制药厂。
[0044] c)试验方法：
[0045] 葛根素给药剂量和方法：葛根素用生理盐水溶解，剂量为60mg/kg，给药方式为灌 田 冃〇
[0046] ICR小鼠随机分为四组：吗啡模型组、吗啡葛根素给药组空白对照组，治疗组小鼠 在开始测定前15min给予葛根素60mg/kg，模型组和治疗组在开始测定前30min皮下注射吗 啡10mg/kg，随后进行疼痛的行为学测定，每天重复以上方式，连续7天。
[0047] 测试慢性耐受：每天吗啡注射（10mg/kg，皮下），连续7天，每次注射30min后测定 镇痛效应（水浴甩尾法）。于试验前及末次给药后0. 5h将小鼠尾1. 5-3. 0cm浸入恒温水 浴中（52±0.5°C)，用秒表记录鼠尾自浸入水中到出现甩尾动作的时间，作为甩尾反应的 潜伏期（tailflicklatency,TFL)，为防止组织损伤，若小鼠10s未甩尾，则TFL记为10s。 TFL用最大效应百分数MPE值表示，：MPE(%)=(给药后TFL-给药前TFLV(10-给药前 TFL)X100%〇
[0048] d)试验结果描述：
[0049] 如图2所示，为全身给予葛根素延缓慢性给予吗啡导致的镇痛耐受的最大镇痛百 分率-时间动态变化示意图。由图2可知，7天慢性吗啡皮下注射使小鼠对吗啡镇痛效应出 现耐受，第7天10^值仅为32.4%。而葛根治疗组（6〇!1^/1^)的10^值显著高于模型组，第 7天高剂量组的MPE值为64%，较吗啡耐受组提高1. 5倍以上。以上结果表明：葛根素能够 减轻慢性给予阿片类药物导致的阿片耐受现象。
[0050] 实施例3 (抑制炎症因子mRNA上调实验）
[0051]a)试验细胞：
[0052]BV2小胶质细胞培养含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%C02,37°C恒温孵箱培养。 覆盖培养瓶底面80%时可传代。实验前24小时，将培养基换成0. 5%胎牛血清高糖DMEM。
[0053] b)试验药品及试剂：
[0054]胎牛血清购于 Hyclone;DMEM、Trizol购于 Invitrogen;TaKaRaPrimeScript试 剂盒购于大连宝生物工程有限公司。
[0055] c)试验方法：
[0056] 实时定量PCR:应用Trizol法抽提各组细胞RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒的SYBRGreenAssay，反应体系为：5XPrimeScriptBuffer2yl， PrimeScriptRTEnzyme0.5u1?OligodTPrimer0.5u1?Random6mers0.5u1? TotalRNA定量至500ng，RNaseFreeddH20,终体系为lOuK反转录反应条件如下： 37°C15min(反转录反应）；85°C5sec(反转录酶的失活反应）。Real-timePCR应用 7300Real_timePCR系统（AppliedBiosystems，Warrington，UK)。cDNA样品米用三步法 PCR扩增标准程序。反应体系为：cDNA模板4u1，上游引物1U1，下游引物1Ul，ddH20，R0X 10U1，终体系为20u1。
[0057] 引物序列如下：
[0059] PCR反应条件如下：95°C10min，40个循环：60°C60s，95°C15s，溶解曲线 60°C_90°C保证扩增为单一产物。以Ct值进行结果分析，采用相对量法与内参GAPDH比较。 计算公式为：2-AGT，ACt= Ctgene-Ctcontrol。
[0060] d)试验结果描述：
[0061]BV2细胞随机分为对照组、吗啡模型组、吗啡葛根素治疗组和葛根素组。吗啡葛根 素治疗组和葛根素组葛根素（10yM/L)预给药5min后，吗啡模型组和吗啡葛根素治疗组给 予吗啡200yM，共孵育6小时。
[0062] 结果如图3、图4所示，其中图3为葛根素对急性吗啡处理诱导的小胶质细胞 TNF-a的mRNA表达示意图，图4为葛根素对急性吗啡处理诱导的小胶质细胞IL-10 的mRNA表达示意图。由图中可知，吗啡处理使BV-2细胞前炎症因子L-10、TNF-a和 IL-6mRNA表达增加，而葛根素治疗组显著抑制了前炎症细胞因子mRNA水平的高表达，并且 葛根素基础给药对BV-2细胞均没影响。以上结果表明：葛根素能够抑制吗啡诱导小胶质细 胞多种炎症因子mRNA的上调。
[0063] 实施例4 (复方制剂）
[0064] a)处方：葛根素0. 2g，吗啡0. 6g，氢氧化钠4. 3g，盐酸适量，加注射用水至20L，制 成1〇〇支。
[0065]b)制备工艺：取氢氧化钠，加入50%用量的注射用水，搅拌至完全溶解，加热至 90°C，加入葛根素和吗啡，搅拌使其完全溶解，加注射用水至全量，用lmol/L的盐酸调节pH 值至6. 4~7. 0,加入活性炭，60~70°C搅拌30min，冷却至室温，用0. 45ym、0. 22ym微孔 滤膜依次过滤，灌装轧盖，121°C灭菌15min。
[0066] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 葛根素在制备镇痛药物中的应用。2. 如权利要1所述的应用，其特征在于所述镇痛药物为阿片类药物。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的葛根素用于制备增强阿片类药物镇痛 效应的药物中。4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的葛根素用于延缓或减轻阿片类药物的 阿片耐受现象的药物中。5. 如权利要求3或4所述的应用，其特征在于以葛根素为活性成分制成制剂配合阿片 类药物使用或与阿片类药物制成复方剂使用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的制剂、复方制剂分别选自注射液、皮下 埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。7. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的阿片类药物包括：吗啡、可待因、双氢 可待因、氢吗啡酮、羟考酮、.美沙酮、芬太尼、哌替啶或曲马多及其制剂。8. -种制剂，其特征在于以葛根素为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成 分制备而成的制剂。9. 一种复方制剂，其特征在于以葛根素、阿片类药物为活性成分，加上药学上可接受的 辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
【专利摘要】本发明公开了葛根素在镇痛药物领域的新用途，具体公开葛根素在制备增强阿片类药物镇痛效应、延缓或减轻阿片耐受的药物中的用途。所述葛根素配合阿片类药物使用，或是与阿片类药物制成复方制剂使用，可以延长其镇痛时间，增强其镇痛效能，还可以延缓或减轻慢性阿片类药物治疗过程中出现的阿片耐受现象。这种作用具体是通过葛根素抑制阿片类药物诱导脊髓胶质细胞过度活化实现的。
【IPC分类】A61K45/00, A61K31/485, A61K31/352, A61K9/08, A61K9/00, A61P25/04
【公开号】CN104940190
【申请号】CN201510408316
【发明人】季浩, 刘文涛, 阚建伟, 窦长清, 刘佳
【申请人】江苏天晟药业有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月13日