根酶标记山羊抗兔IgG抗体(康为公司）；SREBP1兔多克隆 抗体(美国SantaCruz公司）；ACC1兔单克隆抗体(美国CellSignaling公司）；FAS兔单 克隆抗体(美国Epitomics公司）;高灵敏度化学发光检测试剂盒(北京康为世纪生物科技有 限公司） 1. 3造模与分组 36只SD大鼠标准饮食适应性喂养1周后，随机取6只作为正常对 照组接受标准饮食（热量比为：脂肪10. 3%，碳水化合物65. 5%，蛋白质24. 2%)。剩余30只 给予高脂饮食（热量比为：脂肪59. 8%，碳水化合物20. 1%，蛋白20. 1%) 6周用于诱导胰岛 素抵抗模型。钳夹实验证实造模成功后正常对照组继续给予标准饮食，胰岛素抵抗模型大 鼠随机分为5组：高脂喂养胰岛素抵抗组，本发明药物低、中、高剂量组与吡格列酮组，每组 6只。
[0020] 1. 4给药方法 正常对照组和高脂模型组给予溶剂0. 5%羧甲基纤维素钠，本发 明药物低中高剂量组分别给予0. 75、1. 5、3. 0g/kg的本发明药物溶于0. 5%羧甲基纤维素 钠，吡格列酮组给予50mg/kg的吡格列酮溶于0. 5%羧甲基纤维素钠，每天8至9点按10ml/ kg灌胃。每日给药1次，连续8周。
[0021] 1.5标本采集 1. 5. 1体重与日均食物摄入量：每周记录一次空腹体重与每个笼子的食物摄入量，并 计算出每只鼠的日均食物摄入量。
[0022] 1. 5. 2血清标本：大鼠禁食整夜，次晨空腹状态下，3%戊巴比妥（0. 2ml/kg)腹腔 注射麻醉，穿刺心脏收集血样，并经低温离心后得到血清_20°C保存，送检血生化、检测血 FINS、FBG、HbAlc与血游离脂肪酸。
[0023] 1. 5. 3肾组织标本：取血完毕后迅速取出双侧肾脏，去掉被膜，分离并切取部分肾 皮质（5mmX5mmX2mm)迅速置于4%多聚甲醛中固定留作苏木素-伊红（HE)染色；另切取部 分肾皮质迅速放于经0. 1%DEPC水处理过的无RNA酶污染的生理盐水中，漂洗去血渍，立即 放入液氮中冷冻，再分别转入无RNA酶的EP管中，-70°C保存，待将来用于脂质含量（FFA、 TG、TC)试剂盒、RT-PCR与Westernblot的检测。
[0024] 1.6血清指标测定 1.6. 1血生化指标测定：美国BeckmanX20全自动生化分析仪检测血总胆固醇（Total cholesterol，TC)、甘油三酯（Triglycerides，TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度 脂蛋白胆固醇（LDL-C)与极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C)浓度。
[0025] 1.6.2FINS(空腹血胰岛素)测定：由酶联免疫吸附测定试剂盒（Mercodia，USA) 测定。
[0026] 1. 6. 3FBG(血糖）测定：罗氏公司ACCUCHEK血糖仪。
[0027] 1.6.4HbAlc(糖化血红蛋白）测定：由酶联免疫吸附测定试剂盒（Mercodia, USA)测定。
[0028] 1. 6. 5血FFA测定：由酶联免疫吸附测定试剂盒（Mercodia,USA)测定。
[0029] 1.7正葡萄糖-高胰岛素钳夹实验 大鼠称重后以3%戊巴比妥0.2ml/kg腹腔 注射麻醉，固定于手术架上行右颈动静脉插管术，导管经皮下由耳后引出并固定，用1〇〇U/ml肝素封管，结扎固定于颈后皮肤。插管术后:T5d，待大鼠恢复体重，禁食整夜后，于次日 晨于特制的鼠笼中行清醒状态下高胰岛素正葡萄糖钳夹实验。测定空腹血糖作为基础血糖 值，以4mU/(kg?min)固定速率输注胰岛素注射液，使大鼠体内胰岛素水平迅速升高。然 后每10分钟测定一次静脉血糖，输注并调整30%葡萄糖溶液的输注率，当血糖连续3次以 上维持在（5 ±0. 5)mmol/L范围即表明达到稳态，取此稳态下5飞次葡萄糖输注率（glucose infusionrete，GIR)的平均值作为大鼠胰岛素敏感性的评价指标（GIR(mg/kg?min)=稳 态时葡萄糖平均输入速度（ml/h)X葡萄糖浓度（30%)X1000/体重（kg)/60)。
[0030] 1. 8肾组织光镜观察置于4%多聚甲醛中固定的肾脏组织，经常规脱水、包埋、切 片、染色，切片厚4um，HE染色观察肾脏的形态。（HE染色细胞核染成蓝色，细胞浆和红细 胞染成不同程度的红色） 1.9肾组织FFA、TG、TC含量的测定 分别按照相应试剂盒说明书进行检测。
[0031] 1. 10肾脏脂质合成关键酶及上游调控因子基因表达的测定 取-70°c冰冻的肾组织，按照Trizol-步法提取总RNA。反转录生成CDNA，反应条件为： 25°C10min，42°C30min，85°C5min。引物序列使用DNAMAN软件设计，由上海生物工程 有限公司合成。大鼠SREBP-1引物序列（152bp)，上游引物：AGGTCACCGTTTCTTCGTG，下游引 物：CGATACAGITCAATGCTCGC;FAS引物序列（167bp)，上游引物：TGACCAAGGTGCTGTTATCC，下 游引物：TCCGAAGCCAAACGAGTT;ACC引物序列（135bp)，上游引物：CGTGGTGATAATGAACGGC， 下游引物：AACTGCTGCCATCGTAGGAC;内参GAPDH引物序列（120bp)，上游引物：TGAACGGGAAGCTCACTGG，下游引物：GCTTCACCACCTTCTTGATGTC。扩增反应参数为：94°C预变 性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，进行30个循环，最后72°C延伸 10min。扩增完毕后进入ABI7300型荧光定量PCR仪的软件结果分析界面，设置GAPDH 为内参基因，得到各样本、各基因扩增的Ct值。按照RQ=2_AAet公式得到各目的基因在各 样本中表达水平的相对定量值（RQ值)，将RQ值用于统计分析。
[0032] 1. 11肾脏脂质合成关键酶及上游调控因子蛋白表达的测定 取-70°C冻存的肾皮质组织经PBS漂洗，用组织裂解液提取总蛋白；BCA法测定蛋 白含量后，取等量蛋白进行聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳（SDS-PAGE)，将蛋白质转移至硝酸 纤维素膜（PVDF)上；用含5%脱脂牛奶的TBST封闭2h后加入小鼠抗0 -actin抗体（1 : 5000)、兔抗SREBP1抗体（1:200)、兔抗ACC抗体（1:1000)、兔抗FAS抗体（1:1000)室温轻 摇30min，tC孵育过夜；TBST漂洗后分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或山羊抗 兔IgG(1:10000)，室温孵育2h;TBST漂洗后加入ECL试剂，在暗室内将PVDF膜放入暗盒 后进行压片、显影与定影；定影后的胶片用美国UVP凝胶成像系统照相，LabWorks4. 5图 像分析软件对条带进行定量分析，以目的条带和0-actin条带积分光密度值比值作为 目的蛋白表达的相对水平。
[0033] 1.12统计学分析 应用SPSS13. 0统计软件进行数据分析，计量资料以x土 s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P< 0. 05为差异有统计学意义。
[0034] 2 结果 2. 1本发明药物对体重与日均摄食量的影响与正常对照组相比，高脂模型组的体重 与日均摄食量出现了明显升高〇°< 0.05)。给予本发明药物及吡格列酮后体重明显减低0° <0.05)，与正常对照组相比，差异也有统计学意义0°< 0.05)，而日均摄食量虽稍减少但 差异无统计学意义〇°>〇.〇5)(表1)。
[0035] *p〈 0? 05versus高脂模型组，#p〈0. 05versus对照组? 2. 2本发明药物对血FINS、FBG与HbAlc的影响与正常对照组比较，高脂模型组的FINS明显增加（P< 0. 05)，给予本发明药物和吡格列酮后其水平显著下降（P< 0. 05)，与 正常对照组相比，差异无统计学意义（P> 0. 05)。高脂模型组的FBG与HbAlc明显高于正 常对照组（P< 0. 05)，给予本发明药物后FBG与HbAlc水平明显下降（P< 0. 05)，与正常 对照组比较，差异也有统计学意义（P< 0. 05)。给予吡格列酮均明显降低FBG与HbAlc(P < 0.05)，与正常对照组相比，差异无统计学意义（P> 0.05)(表1)。
[0036] 2. 3本发明药物对血脂质的影响本发明药物对血脂质的影响：与正常对照组比 较，高脂模型的TG与VLDL-C明显升高（P<0.05)，HDL-C明显下降（P<0.05)，而TC、LDL-C 未出现明显变化（P> 0. 05)。给予本发明药物和吡格列酮治疗后TG明显下降（P< 0. 05)， 与正常对照组相比，差异有统计学意义（P<