三酯，高LDL血症。在Babl/C或者C57/B6两个品系，我们发 现摄入一定量的维生素D3 (3-4IU/天），可以有效地缓减高脂肪饮食所致的高血脂肪症。
[0134] 对模型小鼠饲养3-4月后，测定血液总胆固醇（图3左图），以及低密度脂蛋白/ 胆固醇（图3右图）。
[0135] 结论：摄入VD3(3_5IU/天）可以抑制高脂饮食所致的高血脂，包括血浆的总胆固 醇含量，以及低密度胆固醇（LDL/C)。
[0136] (4)肠道菌群的失衡（dysbiosis)是代谢综合症的重要起闵，防御素的疗效体现 在平衡肠道菌群牛杰的能力。对动物肠道菌群异常进行检测，应用qPCR以及16SRNA基因 测序技术检测，除了传统的肠道菌群外，可以通过测定大便中肝脏螺旋杆菌（Helicobacter hepaticus)以及共生菌Akkermanisia muciniphila(AKK)占总菌群的含量丰度。结果 如图4所示，"高脂肪+缺乏维生素D"双重打击下的小鼠模型回肠肠道中，肝脏螺旋杆菌 (Helicobacter，hepaticus)在肠道中的丰度上升，同时促进共生菌AKK在肠道中的丰度降 低。另一方面，我们发现摄入一定量的维生素D3 (3-4IU/天），可以有效地缓减高脂肪饮食 所致的菌群失衡。我们发现VD3可以有效地阻止肠道中H.H.上升以及AKK下降。作为一 种新的评估检查方法，我们也可以通过测定（HH/AKK)的比值来确定对代谢综合症的治疗 效果。
[0137] 对模型小鼠饲养3-4月后，测定小肠末端（回肠）中肝脏螺旋杆菌（Helicobacter hepaticus),以及 Akkermanisia 的丰度。
[0138] 结论：摄入VD3 (3-5IU/天）可有效抑制肠道中条件致病菌，例如肝脏螺旋杆菌，而 同时增加共生菌（AKK)的含量；反之，维生素D缺乏可以加重肠道菌群的失调。
[0139] 实施例2: 口服alpha防御素5以治疗代谢综合症。
[0140] 为证明防御素5对代谢综合症的疗效，我们首先建立"高脂肪+缺乏维生素D"动 物模型，然后给予小鼠口服灌胃DEFA5处理治理。其剂量在5-10微克/次（n = 6)，每周 两次，共四次。作为对照，同等体积的水给予代谢综合症小鼠。在试验中我们也应用了一 种 alpha 防御素的突变体，其一级结构为 mut-Defa5:ATSYARTGESATAESLSGVAEISGSLYSLSAE (该突变体不含防御素5结构关键的二硫键以及关键的精氨酸残基）。
[0141] 在治疗过程中，监测体重，血糖，以及大便中菌群生态的平衡。经过治疗后，小鼠体 重降低，恢复正常。在治疗后10天，将小鼠处死后测定一下指标。
[0142] (1)口服aloha防御素5可以有效地缓减脂肪肝。Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD 缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予治疗（n = 6)，口服灌胃，剂量在5-10微克 /次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对照。治疗10天后，处死小鼠，进行分析。通 过H&E染色，结果显示口服防御素5可以有效地缓减脂肪肝（图5)，肝细胞中大泡油滴消 失，脂肪肝消融，而作为对照，同等体积的水或者位点突变不含二硫键的DEFA5没有明显的 效果。由此我们得出结论：口服alpha防御素5可以有效地缓减脂肪肝
[0143] (2)口服aloha防御素5降低血糖，甘油三脂，及低密度脂蛋白阳固醇。
[0144] Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予 治疗（n = 6)，口服灌胃，剂量在5-10微克/次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对 照。治疗10天后，处死小鼠，进行分析。血液检查表明，alpha防御素可明显改善代谢综合 症小鼠的空腹血糖，血甘油三酯，以及低密度脂蛋白/胆固醇。
[0145] 对治疗后动物的血液参数进行检测，结果显示（图6)，小鼠空腹血糖降低，血浆甘 油三脂降低，低密度脂蛋白胆固醇降低。作为对照，同等体积的水（mock)没有作用。由此 我们得出结论：口服alpha防御素5降低血糖，甘油三脂，及低密度脂蛋白胆固醇。
[0146] (3)口服aloha防御素5可以有效地抑制肠道致病菌，提升肠道益牛菌。
[0147] Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予 治疗（n = 6)，口服灌胃，剂量在5-10微克/次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对 照。在治疗过程中监测大便的菌群改变。
[0148] 在口服灌胃处理过程中，通过qPCR分析，对治疗后动物的回肠肠道菌群进行检 测，结果显示（图7)，小鼠大便中益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)逐步增加。在治 理结束后，在回肠区段的菌群中，AKK也是逐步上升，而致病菌肝脏螺旋杆菌（Helicobacter hepaticus)下降。
[0149] 同时，体外实验结果显示，随着防御素5给药剂量的增加，小鼠回肠中的致病菌肝 脏螺旋杆菌（Helicobacter hepaticus)的生长受到相同趋势的抑制。
[0150] 标准菌株肝脏螺旋杆菌（H. H. )ATCC 51449用于体外抗菌测定。以brain-heart infusion培养基在微量好氧培养（microaerophilically culture) 5天。在细菌计数后，加 入防御素5或防御素6。浓度如图中所示，培养处理24h，然后再对细菌计数。重复3次， 以计算抗菌抑制率。结果如图8所示，防御素5、6都有很好的抑菌活性。
[0151] 实施例3:以口服防御素5或者防御素6,或者维生素D作为治疗代谢综合症药物 的应用。
[0152] 防御素是人源通过肠道潘氏细胞外分泌型抗菌肽，包括DEFA5及DEFA6。本申请的 核心之一是通过口服alpha防御素5/6来平衡肠道菌群，从而改善/治疗代谢综合症，2型 糖尿病及其并发症。
[0153] 通过动物试验我们的工作表明，口服人源DEFA5可以重新平衡肠道菌群，降低内 毒素入血，降低系统炎症，改善膜岛素耐受，从而治疗代谢综合症。在小鼠模型中我们发现 给予5-10微克（5-10 y g) /次的人源DEFA5可以有明显的效果，包括平衡肠道菌群，改善血 糖等。
[0154] 因此，对人的剂量可以低至10毫克（IOmg)。而其上限的剂量需要通过临床试验来 确定。其应用的范围可以在10毫克/次至500毫克/次。临床给药的剂量，频率，疗程的 长短，需要通过进一步试验来确定。
[0155] 同时，在本发明的动物模型诱导工作中，我们的发现，维生素D可以调节肠道潘氏 细胞产生抗菌肽，而后者可以平衡肠道菌群，降低内毒素入血，降低炎症及膜岛素抵抗。如 图1 一 3所示，在饲料中添加一定剂量的维生素D3(VD3,2-3IU/天）可以抵御高脂肪饮食 导致的脂肪肝，高血糖，高低密度胆固醇，以及其他代谢综合症的指标。
[0156] 以该剂量来推测对人的治疗剂量因该为4, 000-10, 000IU VD3/天。根据美国国 家医学学会（Institute of Medicine)的推荐，的对成人每天的饮食摄入剂量（Dietary Reference Intake)为600-800IU。同时IOM公告书说摄入的安全的上限（tolerable upper intake levels)为4000IU/天，或者O.lmg/天。因此，作为应用，我们提出对代谢综合症病 人的用维生素〇3作为治疗，其剂量可以在1，OOOIU/天至20, OOOIU/天。给药的剂量也依赖 于病人维生素D缺乏的程度以及其他因素有关，包括肥胖的程度，日照的程度，含维生素D 饮食（深海渔油，奶制品）的摄入量。因此维生素D给药剂量可以据此来给予调整。作为选 项，骨化三醇（Calcitriol)也可以同样或者更好的结果。作为口服，骨化三醇0. 25-2. 5微 克/次，每天1-2次，疗程2-24月。作为治疗应用，维生素D3，每天500-20000IU，口服，2-10 个月。应用效果可根据以下检测指标及相关检查结果进行评判。检测指标包括血液检查生 化指标、谷丙转氨酶（AST)、谷草转氨酶（AST)、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、血糖等。肝 脏影像学检查包括B超、CT和MRI等。血液维生素D的水平（通常为25-OH VD3)也可作 为效果的评判指标之一。
[0157] 实施例4:合成alpha防御素5/6 (DEFA5/6)的方法
[0158] 作为合成的方法步骤如下，
[0159] 第一阶段，应用固相合成树脂将Fmoc (9-fluorenylmethyloxy-carbonyl)保护的 氨基酸通过C末端进行连接，
[0160] (1)掺入氨基酸残基的序列依照人源序列设计，
[0161] DEFA5的序列为：ATCYCRHGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR;
[0162] DEFA6 的序列为：AFTCHCRRSCYS TEYSYGTCTV MGINHRFCCL。
[0163] (2)侧链残基（side chains)的保护方法：
[0164] 对于谷氨酸，苏氨酸和酪氨酸，色氨酸，应用o-tbutyl，tBoc(叔丁氧羰基）；
[0165]对于精氨酸，应用 n_2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6-sulphonyl;
[0166] 对于N和C端的半胱氨酸，应用三苯甲基；
[0167]对于 cys_3和 cys-20,我们应用 s-tbutyl;
[0168] 对于cys-10和cys-30,我们应用乙酰氨基（ACM)。
[0169] (3)受保护的肽基树脂，经过90% TFA含有二氯甲烷（5% )，硫醚（2. 5% )和二硫 化物（2. 5% )处理。
[0170] (4)按照防御素5/6的序列依次连接当氨基酸，并将合成完毕的肽段从树脂上裂 解，获得线性肽粗品（93 - 95% )。经过TFA处理，N-和C-末端的半胱氨酸残基的S-三苯甲 基保护组保护在同时被剪除，而肽链从树脂上裂解下来。而ACM和s-tbutyl保护的cys-3、 cys-20、cys-10及cys-30组分别是完整的。
[0171] (5)用反相高效液相色谱法，经过C18拄对初线性肽进行分离。用含TFA的乙腈水 进行线性梯度洗脱。将高峰汇集，冻干并进行氨基酸序列分析，确定合成完毕的肽序列。
[0172] 第二阶段，形成三个特异的二硫键。
[0173] (1)形成Cys3或Cys4与Cys31半胱氨酸残基之间的二硫键：
[0174] 上述含游离巯基的Cys3和Cys31的线性DEFA5悬浮于在水中，至肽的浓度为 0. 05mM；
[0175] 加入0.1 M乙酸铵溶液调整pH至6. 8,滴加铁氰化钾甲0. 2M的溶液，直至黄色；
[0176] 然后加入过量的铁氰化钾（K3 [Fe (CN)6])以确保氧化，将溶液的pH通过0.2M的乙 酸铵和25%乙酸保持在6. 8-7. 0 ;
[0177] 将溶液浓缩至小体积，然后用活化的硫醇_琼脂糖4B树脂柱除去含有游离硫醇基 的肽段；
[0178] 用0.1 M乙酸铵缓冲液（pH6. 8)对柱中的肽进行洗脱，将肽水溶液合并，冻干。
[0179] 将干燥的物质应用半制备性C18柱通过反相HPLC纯化。将主峰合并，冷冻干燥， 进行氨基酸和序列分析，通过测序，质谱分析证实正确的序列。
[0180](2)形成Cys-5或Cys-6与Cys-20半胱氨酸残基之间的二硫键：
[0181] 将上述纯化的线性DEFA5溶于三氟乙醇（trifluoroethanol)，通过还原反应，以 三丁基膦（tri-butylphosphine)脱去S-叔丁基团上Cys3以及Cys20残基上的保护基团 (方案如图9);
[0182] 反应混合物浓缩至小体积，通过加入乙醚使产物沉淀；
[0183] 将分离的固体过滤并用乙醚洗涤，并干燥；
[0184] 将干燥的制备物悬浮于水中，然后使用铁氰化钾，在pH6. 8进行氧化反应，经过分 离，干燥后，对所得的材料以反相HPLC进行分离。
[0185] 对主要峰的级分合并，分析氨基酸的组成及序列，用质谱分析鉴定。
[0186] (3)形成CyslO与Cys30半胱氨酸残基之间的二硫键：
[0187] 以上述肽溶于水/甲醇的混合物（5:1)中，然后滴加碘/甲醇中的溶液，至红色溶 液产生，并冷却至〇°C;
[0188] 用IM硫代硫酸钠进行氧化处理，直到红色消失，将甲醇通过旋转蒸发除去，然后 将获得的材料冻干；
[0189] 将粗物质溶解在水中，并通过硫醇_琼脂糖柱进行分离：将柱用0.IM乙酸铵缓冲 液，PH6. 5洗涤，将水溶液冷冻干燥，将干燥的物质用反相HPLC纯化，所有馏分被汇集，并冻 干。
[0190] 通过测定序列，光谱和氨基酸分析。合成肽的质量可以通过比较其HPLC保留时 间，CD谱和质谱进行评估。
[0191] 其口服制剂，除了活性成分防御素以外，也包括常用的辅料组成，包括稀释剂，粘 合剂，稳定剂，抗氧化剂等。
[0192] 同时，防御素也包括DEFA5/6的衍生物。所描述的衍生物包括但不限于由DEFA5/6 一级结构上的氨基酸取代或者修饰的肤链。我们发现DEAFA5与DEAF6具有类似的抑制细 菌的能力。
[0193] 实施例5:测定，评估用于抗代谢综合症的先导药物的方法。
[0194] 作为具体实施方案，我们通过测定以下指标来评估新药的疗效及潜在副作用。
[0195] (a)喂养期间体重的变化；腹围的变化。
[0196] (b)喂养期间空腹血糖，血脂的变化。；
[0197] (C)喂养期间胰岛素耐受的形成，喂养期间血糖不耐受的程度形成，包括 Homeostaticmodelassessment(HOMA-IR)；
[0198] (d)喂养期间大便菌群的变化；应用qPCR以及16SRNA基因测序技术。除了传 统的肠道菌群外。我们可以通过测定大便中Helicobacter hepaticus以及Akkermansia muciniphila的含量。通过（HH/AKK)的比值，我们可以判定肠道菌群的失衡，以及药物对肠 道菌群恢复的疗效。
[0199] (e)试验终点（4-6个月喂养）后肝脏