抗侵袭效果。流式细胞仪用于证实细胞周期分析中S期的细胞阻滞。还进行了蛋白印迹分析以表明PJ诱导的细胞凋亡与存活素和Bcl-XL基因的表达下调以及活化型半胱天冬酶-3、半胱天冬酶9和PARP基因的表达上调有关。这些结果证实PJ在胰腺癌中的抗肿瘤活性，为其潜在的治疗用途提供最初证据。
[0029]本发明的最佳实施方式
[0030]通过以下实验实例进一步说明本发明的制备方法和用途。应当理解，这些实验实例尽管示出了本发明的优选实施例，但是仅仅是为了更好地说明才给出的。本领域的技术人员可以确认本发明的必要特征和实施例，因此可以提供各种变化以适应各种用途和情形。
[0031]材料和方法
[0032]细胞培养、试剂和抗体:
[0033]在5%的⑶冲用10%的胎牛血清(FBS)和I %的青霉素和链霉素增补的达尔伯克氏改良Eagle培养基(MDEM)中生长包括PANC-1和BxPC-3的人体PaCa细胞系。用1500mg/ml GE (没食子酸等同物)的原液浓度制备从油棕提取的棕汁(PJ)。从可商购来源获得蛋白酶抑制剂混合物、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的一次抗体、(5-肌动蛋白和细胞裂解液(20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaClUmM Na2EDTAUmM EGTAU % Triton X_100、2.5mM焦磷酸钠、ΙπιΜβ -磷酸甘油、ImM Na3VO4iI μ g/ml亮抑酶肽)、活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9的一次抗体、存活素、Bcl-XjP二次抗体。
[0034]通讨MTS分析法研究细朐活件
[0035]在96孔培养板中种下并通宵培养PANC-1和BxPC_3细胞(5 X 13)。去除培养基并且更换成包含每毫升细胞20、30、40或5(^1 PJ(1500mg/mL GE)的新的培养基，随后孵育72小时。此后，在每个孔中加入20 μ I的MTS分析试剂，并且在37°C潮湿的5% CO2气氛中孵育2小时。然后使用培养皿观看盘在490nm的吸光度中记录读数。用二甲基亚砜(DMSO)代替PJ重复该分析法作为空白载体对照。实验的每个变量进行一式三份。
[0036]组蛋白/DNA ELISA的细朐凋亡检测
[0037]细胞死亡检测酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒用于检测PaCa细胞的细胞凋亡。在六孔板中种下并通宵孵育一百万个细胞，随后用PJ或对照处理72小时。然后使细胞裂解，并且提取细胞质组蛋白/DNA片段，并且在涂有抗组蛋白抗体的微滴板模块中孵育。使用过氧化物酶缀合的抗DNA抗体来检测固定化组蛋白/DNA片段，随后对过氧化物酶用2，2’ -联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)基底进行彩色显影。通过使用405nm波长的培养皿观看板来测定样品的分光光度吸光度。
[0038]集落形成试验
[0039]在10mm培养皿中种下并通宵孵育一百万个细胞。用20、30、40或50 μ I的PJ或对照培养细胞72小时，随后进行活细胞统计并且每个板接种约5000个细胞。然后在37°C、5% CO2的培养箱中孵育细胞21天。所有菌落在4%的多聚甲醛中固定并且用2%的结晶紫着色。
[0040]流式细胞仪和细胞周期分析
[0041]在10mm培养皿中种下并通宵孵育细胞，随后所有细胞饥饿24小时。将细胞释放到对照或包含培养基的PJ中孵育72小时。随后，收集细胞并用冰冷的70% (体积比)乙醇固定24小时。在细胞以3000Xg离心5分钟之后，用PBS (pH 7.4)清洗细胞沉淀，并且在包含碘化丙啶(50yg/mL)和无DNase酶水RNase (I μ g/mL)的PBS中再悬浮。然后在室温下孵育样品2小时，并且使用流式细胞仪测定DNA的含量。
_2]用于细胞凋亡分析的膜联蛋白V-FITC方法
[0043]使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒来测量凋亡细胞。在存在或不存在PJ的情况下孵育PANC-1和BxPC-3细胞48小时，随后使细胞经过胰酶消化，用冰冷的PBS清洗，并且在总体积100 μ I中以每毫升15个细胞的浓度在IX结合缓冲液中再悬浮。然后在细胞中加入5 μ I膜联蛋白V-FITC和5 μ I ΡΙ(碘化丙啶)，并且在室温下在暗处保持20分钟。最后，各试管加入400 μ I IX结合缓冲液，并且使用流式细胞仪分析凋亡细胞的数量。
[0044]伤口愈合试骀
[0045]在六孔板中以每个孔4Χ 15个细胞的浓度种下并通宵孵育PANC-1和BxPC_3。在孵育之后，去除培养基，并且使用细尖端在每个孔中造成划伤。为了确保没有疏松保持的细胞附连在受伤区附近，用PBS清洗受伤区三次。随后，在存在或不存在PJ的情况下孵育细胞，并且拍摄受伤区的照片。20小时之后，在显微镜下拍摄伤口愈合图片。
[0046]细胞侵袭试验
[0047]使用b1coat基质胶侵袭试剂盒来根据制造商的方案评估肿瘤侵袭能力。在存在或不存在PJ的情况下，将大约5 X 14个PANC-1和BxPC-3细胞转移到每6孔的上室中，而具有10% FBS的3ml培养基加入到每个24孔板的下室中。在孵育20小时之后，使用棉签去除上室中的细胞。在37°C Hanks缓冲盐水中用4 μ g/mL Calcein AM对通过Matrigel基质膜侵袭的细胞着色I小时。各实验条件进行一式三份。随后，在530/590nm的刺激/发射波长下用微板读数器读取侵袭细胞的荧光。使用荧光显微镜来采集这些荧光标示的侵袭细胞。
[0048]蛋白提取和免疫印迹
[0049]使用或不使用PJ治疗PANC-1和BxPC_3细胞系72小时以评估治疗对PARP、活化型半胱天冬酶3、活化型半胱天冬酶9、存活素、Bcl-XjP β-肌动蛋白表达的影响。细胞在加冰块的冷裂解缓冲液中裂解30分钟，并且使用蛋白分析试剂盒测定蛋白的浓度。将样品加载到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并且经过电泳。在电泳之后，在转移装置中使用转移缓冲液(25mM Tris、190mM甘氨酸、20%甲醇)将凝胶电泳地转移到硝化纤维膜上。在含有0.1%聚山梨醇酯20(TBS-T)的Ix tris缓冲盐溶液(TBS)中用5%的脱脂奶粉在室温下孵育硝化纤维膜I小时，随后用一次抗体在4°C下通宵孵育。用TBS-T将膜清洗3次，并用包含2%牛血清白蛋白(BSA)的二次抗体在室温下孵育硝化纤维膜2小时，随后使用化学发光标记图像仪测量信号强度。
[0050]实时定暈PCR基因表达分析
[0051]根据试剂盒制造商的方案分离全部RNA。在20 μ I总体积中使用TaqMan逆转录试剂盒，从每份样品在总共2 μ gRNA上进行第一链cDNA合成。逆转录反应在25°C进行10分钟，随后在48°C进行30分钟，在95°C进行5分钟。进行实时PCR分析并且此分析所使用的引物集的顺序如下:MMP-9、正向引物(5’-CGG AGT GAG TTG AAC CAG-3’)和反向引物(5，-GTC CCA GTG GGG ATT TAC-3’)；VEGF、正向引物(5，-GCC TTG CCT TGC TGC TCT AC-3’)和反向引物(5，-TTC TGC CCTCCT CCT TCT GC-3，) ;GAPDH、正向引物(5’-CAG TGA GCT TCCCGT TCAG-3，)和反向引物(5，-ACC CAG AAG