ACT GTG GAT GG-3’)。
[0052]通过虚拟PCR验证所有这些引物，引物浓度经过优化以避免形成引物二聚体。使用2x SYBR绿色PCR主要混合液进行实时PCR扩增。2微升RT反应用于25 μ I总体积的定量PCR反应。SYBR实时PCR热分布是95°C 10分钟，随后在95°C 15s和60°C I分钟循环50次。根据在各样品中规范化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)定量所确定的基因表达的相对倍数增加或减少对数据进行分析。
[0053]微孔比佴NF-K B试骀
[0054]为了评估NF- K B的结合活性，根据制造商的方案使用P65转录因子ELISA试剂盒。在10mm培养皿中种下并通宵孵育一百万个PANC-1和BxPC-3细胞，随后用PJ或对照处理72小时，并且对每份样品提取核酸蛋白。然后在涂有抗P6OTNA序列的微板中孵育2 μ g的每份样品。过氧化物酶缀合的抗DNA抗体用于检测p65-DNA结合复合物，随后对过氧化物酶用ABTS基底进行彩色显影。记录并分析样品的化学发光和体积。
[0055]数据分析
[0056]结果表示成平均值土平均数标准误差(SEM)，并且使用单因素方差分析在各组之间进行统计比较。P〈0.05值被认为统计意义上的显著性，并且在图中示出单独的P值。
[0057]
[0058]PJ对PaCa细胞的细胞生长/存活的影响
[0059]如图1所示，通过用不同浓度的PJ和培养基处理PANC-1和BxPC_3细胞，随后进行MTS和集落形成试验来评估PJ对胰腺癌的细胞毒素潜能。图1示出了 PJ对胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC-3存活和生长(A和B)及集落形成(C和D)的影响。
[0060]用增加浓度的PJ处理两种癌细胞系。结果表示成三次试验重复结果的平均值土SEM。参见图1，*表示P〈0.05，并且林表示P〈0.01，对应各自的DMSO处理对照。对照处理中统计的细胞数看成是100%，并且相对于此对照计算PJ处理的细胞中的细胞数。
[0061]在PANC-1细胞系中，用20、30、40和50 μ I/ml的PJ处理72小时，分别得到相对于对照的35 %、51 %、75 %和91 %的细胞生长抑制。类似地，用20、30、40和50 μ I/ml的PJ处理BxPC-3细胞系72小时，分别得到相对于对照的12 %、30 %、54%和75 %的细胞生长抑制。这些结果表明PJ作为胰腺癌细胞生长抑制剂的效率。
[0062]图1C和图1D所示的集落形成试验通过揭示用增加浓度的PJ (30和40 μ I/ml)处理PANC-1和BxPC-3得到集落形成数的更大减少(如减少的结晶紫着色所示)来确认PJ对细胞生长的效果。如图1所示，集落形成试验的结果与MTS数据一致，其中PJ明显抑制胰腺癌细胞的生长。总结两种试验发现，PJ抑制两种细胞系的细胞增殖和集落形成，其中对于所有测试浓度而言，PANC-1细胞比BxPC-3细胞对PJ的影响更敏感。
[0063]PJ诱导的细胞凋亡
[0064]图2示出了用组蛋白/DNA ELISA方法(A和B)以及流式细胞仪(C和D)分析PJ的细胞凋亡能力。在孵育72小时之前用增加浓度的PJ处理细胞或者用DMSO作为空白载体处理细胞作为对照。随后用膜联蛋白V和碘化丙啶对孵育进行着色，以供流式细胞仪分析。细胞的流式细胞仪细胞分布图示为虚线(图2C和图2D)。值代表一式三份样品的土SEM。*表示P〈0.05，并且#表示P〈0.01，对应DMSO处理的对照组。
[0065]图2A和图2B以剂量依赖方式示出了 PANC-1 (图2A)和BxPC-3 (图2B)细胞系中的细胞凋亡。图2C和图2D示出了在用20和30 μ Ι/ml的PJ处理之后通过膜联蛋白V着色所检测的凋亡细胞的定量结果，从而确定PJ在两种细胞系中的细胞凋亡诱导效果。结果表明，在两种胰腺癌细胞系中，在IC5tl剂量的PJ，PJ处理在凋亡细胞百分比中是统计意义上的显著(#P〈0.01)增加。
[0066]在用PJ处理之后分析细胞周期分布
[0067]分析用不同浓度的PJ处理PANC-1和BxPC_3细胞的细胞周期分布以确定细胞增殖抑制的可能潜在的机制，如图3A(PANC-1)和图3B(BxPC-3)所示。在72小时孵育之后，通过使用流式细胞仪来量化不同细胞周期阶段中的种群分布。
[0068]图3A和图3B以剂量依赖方式示出了 PJ使两种细胞系停滞在S期。对于PANC-1细胞(图3A)而言，在处理组(40 μ Ι/ml)中，约28%的细胞停滞在S期中，而在对照细胞中为25%。对BxPC-3细胞(图3B)进行类似观察，在处理组(50 μ Ι/ml)中，52%的细胞停滞在S期，而在对照细胞中为21 %。
[0069]连同细胞周期阶段GO-Gl、G2_M和S期的百分比示出了用增加浓度的PJ处理的癌细胞的细胞周期分布。这些发现反映了 PJ诱导两种癌细胞系的细胞周期停滞在S期。
[0070]PJ既上调促凋亡基因又下调抗细胞凋亡基因
[0071]免疫印迹代表在用增加的PJ浓度处理72小时之后PANC-1和BxPC_3癌细胞系中PARP裂解、半胱天冬酶、Bcl-xL和存活素的表示，以进一步详细说明胰腺癌细胞的PJ诱导细胞凋亡的分子机制。在此实验中，肌动蛋白用作蛋白负荷对照。
[0072]具体地讲，分析了活化型半胱天冬酶依赖型细胞凋亡(半胱天冬酶3，半胱天冬酶9)、抗细胞凋亡Bcl-2族((Bcl-xL)和抗细胞凋亡蛋白存活素诱导所涉及的蛋白表达。图4示出了 PJ在两种癌细胞系中增加了促凋亡蛋白、活化型半胱天冬酶3和9以及PARP的表达，而在两种PANC-1和BxPC-3细胞系中则减少了例如Bcl-xL和存活素的抗细胞凋亡蛋白的产生。
[0073]此分析证实，PJ通过双机制方法在两种癌细胞中诱导细胞凋亡:激活细胞凋亡诱导半胱天冬酶并且抑制细胞存活蛋白。
[0074]P T抑制NF-κ B的活件
[0075]进行微孔比色NF- K B试验以表征PJ对NF- κ B活性的影响。图5示出了 NF- κ B活性随着处理PANC-1和BxPC-3细胞所使用的PJ浓度的增大而下调。图5A和图5B示出了 PANC-1和BxPC-3中p65活性的分析。P65激活在两种细胞系中经过PJ处理之后以类似剂量依赖的方式减少。两种PANC-1和BxPC-3在处理中使用的高浓度PJ表现出显著降低的 NF-κ B (p65)活性。
[0076]图5C和图示出了 PJ相对于DMSO处理的对照对VEGF和MMP-9的影响。VEGF和MMP-9表达在用PJ处理中以剂量依赖的方式显著减小。从图5C和图可以看到，MMP-9的效果在两种癌细胞系中更明显。作为NF-kB下游基因的血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP9)负责癌细胞侵袭和迀移表达。在逆转录PCR之后通过实时PCR来测量VEGF和MMP9的表达。这些结果强烈表明PJ抑制NF_kB活性及其靶基因表达。
[0077]结果表示成三次重复试验的平均值土SEM，*表示P〈0.05，并且**表示P〈0.01，对应各自的DMSO处理对照。
[0078]PJ抑制细胞迁移和侵袭
[0079]细胞侵袭和伤口愈合试验用于分析PJ对胰腺癌细胞系的侵袭和迀移的影响。图6示出了 PJ以剂量依赖的方式抑制PA