2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，琼脂 15g，蒸馏水 1L，调pH至7. 0，115°C灭菌15分钟。
[0029] 本发明的丁酸梭菌（Clostridium butyricum)WZMC1016具有下述微生物学特征：
[0030] (1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1~3mm，表面略有光泽，液 体培养基中有气泡产生。
[0031] (2)个体形态：为G+芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0· 6~L 2X3. 0~7. 0 μ m，端 圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。
[0032] (3)生理生化特征：麦芽糖（+);甘露醇（+);棉子糖（+);乳糖（+);核糖（+);淀粉
[0033] 培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35~40°C;最 低生长温度25~28°C ;最高43~45°C ;生长最适pH 6. 5~L 0 ;pH 4. 5~5. 0或8. 0~ 8. 5不生长。
[0034] 本发明的丁酸梭菌（Clostridium butyricum) WZMC1016,已于 2014 年 10 月 22 日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌 属，保藏编号为CGMCC No. 9831。
[0035] 实施例2 丁酸梭菌（Clostridium butyricum)WZMC1016益生菌制剂组合物的制备
[0036] L种子液制备：挑取丁酸梭菌（Clostridium butyricum)WZMC1016单菌落，接种 于50mL改良MRS液体培养基中，pH为7. 0 ± 0. 5，37 °C，厌氧培养24h，即为种子液；
[0037] 改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，K 2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，蒸馏水 1L，调 pH 至 7· 0,115°C灭菌 15min。
[0038] 2.发酵培养：取步骤I的种子液，以I %接种量接种至新的改良MRS培养基中， 37°C，厌氧培养24h，结束培养；
[0039] 3.收集菌体：取步骤2发酵液，以12, OOOrpm，IOmin条件，去除发酵上清液，离心 分离出菌体；
[0040] 4.菌粉制备：取步骤3收集的菌体加入含有重量5%的谷氨酸钠和5 %多脂奶粉 冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到丁酸梭菌菌粉。
[0041] 5.成品制备：取步骤4所得干燥菌粉，依据丁酸梭菌的活菌数，按比例与药用载体 (低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等）混合，制备丁酸梭菌制剂组合物成品，成品的活菌数不低于 I X IO7CFlVg 或 I X IO7CFlVmL。
[0042] 实施例3血管性痴呆的治疗动物实验
[0043] 目的：观察本发明丁酸梭菌制剂对血管性痴呆小鼠的学习记忆、脑内氧化指标和 神经细胞形态学改变的影响。
[0044] 一、材料与方法：
[0045] 1.药物：丁 酸梭菌（Clostridium butyricum)WZMC1016 菌粉，含活菌数为 I X 10sCFU/g，具体制备方法，详见实施例2。
[0046] 2.实验动物：ICR小鼠雄性，体重18-22克。
[0047] 3.血管性痴呆（VaD)小鼠模型制备及动物分组：采用永久性右单侧颈总动脉闭 塞（rUCCAO)，小鼠麻醉后，固定于手术台上，分离和缝合用永久性的小丝线进行右侧颈总 动脉，小鼠的体温保持在37°C恒温。血管性痴呆模型成功的小鼠分为模型组和丁酸梭菌 WZMC1016治疗组。只开皮，不接扎列为假手术对照组，
[0048] rUCCAO后开始给酪酸梭菌WZMClO 16治疗，按浓度I X IO9CFUAiL剂量0. 2mL灌胃， 每日一次，连续4周给药，阴性对照组及血管性痴呆模型组小鼠灌胃等量的生理盐水。全部 小鼠均给予标准鼠饲料常规喂养。实验结束前一周对全部小鼠进行水迷宫神经行为学测 试，神经行为学测试结束后，小鼠脑组织进行灌注固定，HE染色、TUNEL染色的病理学检测， 电镜超微结构观察。
[0049] 4.学习记忆能力测试
[0050] 旷场实验和Morris水迷宫进行学习记忆能力测试，包括定向航行和空间探索实 验。实验设备由视频采集系统、数据分析系统和四个象线的环形水池构成，检测实验动物的 空间学习能力和空间记忆能力。
[0051] A)定向航行实验：将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录小鼠找到平 台所需时间，即逃避潜伏期（escape latency)，连续测试5天。
[0052] B)空间探索实验：第6天撤除平台，测量小鼠在目标象线停留时间。
[0053] 5.病理组织学观察：用4%的多聚甲醛进行心脏灌流固定，取脑，石蜡包埋，切片。
[0054] 5. I HE染色：将石蜡切片进行常规HE染色，石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待 染；切片置苏木素染色5min，自来水洗去多余的染料；切片入盐酸酒精中分化数秒；自来水 充分水洗切片；1%伊红水溶液中5分钟，洗去多余的伊红；梯度酒精脱水、封片。
[0055] 5. 2 TUNEL染色：TUNEL染色操作按说明书进行，TUNEL阳性细胞核染成棕黄色。
[0056] 6.应用PCR-DGGE技术测定肠道菌群变化，计算物种丰度指数，Shannon-Wiener指 数，物种均匀度指数。行为测试后，将小鼠处死，迅速取出盲肠内容物。新鲜标本立即转移 到冰盒实验室和存储在_80°C，DNA抽提试剂盒的粪便样品中提取细菌的基因组DNA。16S rRNA V3区PCR扩增产物进行DGGE，软件分析DGGE指纹图谱，割胶回收条带并克隆测序，将 序列在GenBank数据库中进行同源性分析。
[0057] 7.统计学分析：实验数据以均数土标准差表示，采用SPSS 18. 0统计软件进行单 因素方差分析（One-Way AN0VA)统计学分析，组间差异采用q检验，p < 0. 05表示有统计 学差异。
[0058] 二、实验结果：
[0059] 1.水迷宫实验结果
[0060] 神经行为学结果显示：血管性痴呆模型小鼠出现明显的学习记忆能力及判断能 力的下降；酪酸梭菌治疗组明显改善血管性痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，定向航行成绩 (逃避潜伏期）明显缩短，与模型组比有显著性差异（P< 0.01)。以上结果表明本发明的 酪酸梭菌WZMC1016组效果最为明显，具有明显改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能。实验 结果见表1。
[0061] 表1对小鼠定向航行成绩（逃避潜伏期）的影响
[0062]
[0063] 2.旷场实验结果
[0064] 模型组血管性痴呆小鼠运动的总距离和自由活动时间明显比假手术组（P < 0. 05)少，而经过酪酸梭菌WZMC1016治疗的小鼠运动总距离和自由活动时间有明显上升 (P < 0. 05)，小鼠活动性明显转好。
[0065] 3.海马组织形态学改变
[0066] 3. 1超微结构观察
[0067] 假手术组海马组织神经元结构正常，椭圆形的核和清晰的染色体，线粒体结构正 常。相反，模型组小鼠海马组织神经元细胞核不规则，染色质不均匀切线粒体肿胀，神经元 明显受损。酪酸梭菌WZMC1016治疗组完整线粒体数目较多，神经元超微结构受损减轻。
[0068] 3. 2 HE 染色
[0069] 假手术组小鼠海马CAl区颗粒神经元排列整齐，可见圆形或椭圆形核和明显的核 仁。而Model组小鼠海马CAl区神经元变圆，胞质凝固，核固缩，核仁消失，病理改变明显。 酪酸梭菌WZMC1016治疗后，神经元损伤减轻。
[0070] 3. 3 TUNEL 染色
[0071] 模型组小鼠海马CAl区可见许多棕褐色细胞，代表细胞凋亡。经酪酸梭菌 WZMC1016治疗后，几乎不见标记的凋亡细胞，以上结果表明本发明的酪酸梭菌具有明显的 抗凋亡作用。。
[0072] 4.对血管性痴呆的肠道菌群影响
[0073] 酪酸梭菌WZMC1016治疗组在肠道菌群丰度指数、Shannon-Wiener指数（H'）和物 种均匀度指数上显著性优于血管性痴呆模型小鼠。
[0074] 结论：
[0075] 本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治血管性痴呆的新模式，研制出 了一种疗效好、无毒副作用的防治血管性痴呆的药物，经动物实验研究证明，明显改善血管 性痴呆小鼠的学习记忆能力，减轻细胞凋亡的病理改变。本发明选用丁酸梭菌WZMClO 16菌 株来防治血管性痴呆，疗效显著，且未发现任何毒副作用，可作为营养制剂和其他营养素一 起用于临床患者的辅助治疗。
【主权项】
1. 丁酸梭菌在制备防治血管性痴呆组合物中的应用，特征在于所述组合物包括药物、 保健品和口服液。2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于丁酸梭菌为丁酸梭菌WZMC1016菌株，该菌株 已于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号：CGMCC No. 9831。3. 根据权利要求1所述应用，其特征在于所述丁酸梭菌是活细胞形式。4. 根据权利要求1所述应用，其特征在于组合物是以丁酸梭菌作为活性成份制成的组 合物。5. 根据权利要求1所述应用，其特征在于所述组合物包含丁酸梭菌的活菌数不低于 IXlO7CFlVg06. 丁酸梭菌在防治血管性痴呆组合物的制备方法，包括如下步骤：将丁酸梭菌 WZMC1016菌株种子液按重量1 %接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1 %，牛肉霄1 %， 酵母膏 〇? 5 %，葡萄糖 2 %，K2HPO4 0? 2 %，MgSO4 ? 7H20 0? 05 %，MnSO4 ? 4H20 0? 02 %，低聚果 糖0. 3%，柠檬酸二铵0. 2%液体培养基中，经36°C~38°C厌氧发酵后，离心分离菌体，将菌 体加入含有重量5 %的谷氨酸钠和5 %多脂奶粉冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可得到 丁酸梭菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，与药用载体混合，即得到所述最终剂型益生菌组合物。
【专利摘要】本发明属于生命科学领域，涉及益生菌制剂在制备治疗与预防血管性痴呆中的应用，具体涉及丁酸梭菌防治血管性痴呆的药物新用途。血管性痴呆是多种脑血管疾病基础上出现的脑组织损害，进而以认知功能障碍为主要临床表现的综合征，本发明公开了一种具有防治血管性痴呆，益生菌制剂包含药品、保健品和饮品，且未发现任何毒副作用。本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治血管性痴呆的新模式，既减轻疾病症状又减缓神经细胞损伤，具有很好的社会经济效益，值得推广应用。CGMCC No.983120141022
【IPC分类】A61P25/28, A61K35/741, A23L1/29
【公开号】CN105012349
【申请号】CN201510489980
【发明人】刘佳明, 孙晶
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月6日