部位数来获得。CpG数 显示为0的话CMES值为0。为了此研究引物转录起始部位定位为基准W从-1000到+600bp 或者-1000到+1的bp部分定义。
[0040]连施例10 :撒据蒋合
[0041]Solexa序列数据和微阵列数据是利用statisticalprogrammingenvironment R(version2. 11.0)^annotatedmRNAaccessionidentifiers为基础导出。对重要调查 列表京都基因及基因组百科辞典化yoto化巧clopediaofGenesandGenomes;KEGG)路 径分析是利用DAVIDF^mctionalAnnotationtool值ennis,etal., 2003)来执行。
[0042]连施例11 :3次元细胸培养
[0043] 3次元胶原I凝胶是为了取得凝胶浓度3. 8mg/mlW相同量的lOX重组缓 冲液（262mM重碳酸钢，20mM肥PES，抑7. 6)和充分的培养基相加从大白鼠尾己胶原 (Coll油orativeBiomedicalProducts,Be壯ord,MA)中制造。MDCK细胞W2. 5X105至 3X106cells/ml浓度立即加入到溶液中。溶液是35-mm盘移开后上升到37°C。24小时后 形成凝胶时加入含有1% (v/v)牛胎血清的DMEM/F12(Welgene)。为了用siRNA转染细胞 或者促进囊肿形成直接在腺巧酸环化酶活性剂的毛喉素5mM存在下W同样的方式培养3D。
[0044] 连施俩I12:巧得仿巧差图像
[0045] 胶原凝胶内MDCK囊肿构造的位相差图像是利用具备10X及40X物镜的Olympus 1X70显微镜进行摄影培养后1，4, 6, 8及第10日。个别囊肿的大小W现有研究记载来评价 (Park,etal. , 2009) 〇
[0046]连施俩I13 :染传质免巧沉淀化hIP)
[0047] 染色质免疫沉淀是按照现有技术稍微应变执行（Thomson,etal.，2010)。细 胞在碟中培养，用1%的多聚甲醒固定后保存在-80 °C。收集的细胞是用3RIPA缓 冲液（20mMTris-HCl[pH7. 5],ISOmMNaCl,ImM胞2邸TA,ImMEGTA, 1 %NP-40, 1 % 脱 氧的胆酸钢，2. 5mM焦憐酸钢，ImM崎￥〇4,蛋白质抑制剂混合物）每10分钟激烈的 揽拌且满旋30分钟。核分划是用13000Xg来离屯、过滤30分钟取得。此分划利用 为MspI分解酵素为甲基化岛（Me-CGIs)制造，接下来未甲基化的CGIs是W化nP1 分解孝素取得。染色质是根据在先论文制造灯homson，etal.，2010)DMBD2独特抗 体（SantaCruzBiotechnology,SC-9397),MECP2 独特抗体（Abeam,油2828),册K4me3 独特抗体扣pstate, 17-614)，册K9me3独特抗体（Abeam,油8898)，册K27me3独特抗 体（Abeam,mAbcam6002),册K36me3 独特抗体（Abeam,油9050)与册KAc独特抗体 (Upstate, 06-599)均为购买。
[0048]连施例14 :紀织学的分析
[0049] 用福尔马林固定的人类肾脏组织植入到链烧控W 5 ym厚度截断。截面为了组织 学的分析根据标准的方法再水化后H&E(苏木精和伊红，hemato巧linandeosin)染色。
[0050]连施例15 :人类腎细胸痛细胸株
[0051] 786-0及ACHN人类肾细胞癌细胞株是淑明女子大学的任钟暂教授提供。细胞10% (v/v)牛胎血清及含有青霉素、链霉素RPMI1640(Welgene，Korea)培养基中在37°C，5% C〇2及95 %空气的条件下培养。
[oow]连施例16:3次元细胸培养基药物化理
[005引3次元胶原I凝胶是为了取得最终凝胶浓度3. 8mg/mlW相同量的10X重组 缓冲液（262mM重碳酸钢，20mM肥PES，抑7. 6)和充分的培养基相加从大白鼠尾己胶原 (Coll油orativeBiomedicalProducts,Be壯ord,MA)中制造。MDCK细胞W2. 5X105至 3X106cells/ml浓度立即加入到溶液中。溶液用35-mm盘移开后上升到37°C。24小时后形 成凝胶时将加入含有1% (v/v)牛胎血清的DMEM/F12(Welgene)。每天换培养基。5日后新 鲜的5-aza-dC巧-aza-2'-deoxycytidine;Sigma-Al化ich,StLouis,M0,USA)2~4liM或 者折布拉林（zebularine)(zebularine;Ca化iochem,SanDiego,California,USA) 100yM 相加在3D胶原内的MDCK细胞中14日。胶原凝胶内MDCK囊肿构造的位相差图像是利用具 备10X及40X物镜的Olympus1X70显微镜进行培养后3, 5, 8, 10及第12日的拍摄。个 别囊肿的大小W在先研究记载来评价（Park,etal.，2009)。
[0054] 连施俩I17 :定量连时RT-PCR
[00巧]3D培养的MDCK细胞中mRNA的表现是用定量实时的RT-PCR来确认。3D培养2周后 3D胶原凝胶内的MDCK细胞为了得到MDCK囊肿细胞W胶原酶（最终浓度2mg/ml)处理后在 37°C的5 %C02与95 %空气潮湿的环境下培养2小时。总RNA是W胶原酶处理的MDCK细胞 中利用伽(316〇沒如]1嚴1?酷1(^(魁(：肥1?6￥-酷661^，66脚曰117)按照制造者的指示进行分离。 利用M-MLV逆转录酶（Promega),lOOnMoligo-dT,ImMdNTP混合物及RNase抑制剂逆转总 RNA5yg。利用Rotor-Gene获[)0巧饭（CorbettRobotics,SanRrancisco,CA)至real-time SensiMixPlusSYBRkit试剂盒（如antance)按照制造者的指示执行实时PCR。使用犬的 P-肌动蛋白（正 5' -GAGCGAGCATCCCCCAAAG-3'，负 5' -GCAAGGGACTTCCTGTAAC-3'）作为良 性对照群。非多囊肾组织及肾细胞癌细胞株之间6个肿瘤抑制基因的mRNA标准确认为上述 定量实时RT-PCR。使用的引物序列显示在表4。PCR条件如下：W95°C15分钟；W95°C10 秒，W60°C15秒及W72°C20秒40频率。
[0056]结果1 :腎肿奪肿的基闲紀仓部DNA甲基化状杰
[0057] 从3个多囊肾患者中取得的囊肿肾脏皮质样本及3人的非多囊肾，利用对从透明 肾细胞癌患者中取得的非多囊肾肾脏皮质组织（表1)的MIRA-seq分析，分析了基因组 全部的DNA甲基化变化。非多囊肾肾脏组织是从肾细胞癌患者中取得的正常肾脏的一部 分。虽然在非多囊肾肾脏组织中未发现囊肿形成，但是多囊肾肾脏组织中发现了很多囊肿 (图5)。不仅如此，肾细胞癌细胞株786-0及ACHN作比较时非多囊肾肾脏样本的定量实时 RT-PCR分析未表现出明确的肿瘤关联基因表达征兆。非多囊肾肾脏样本中没有肿瘤细胞污 染的事实在透明肾细胞癌中W已知沉默的6个基因表达标准确认值algin，et曰1.，2008)。 全部肾细胞癌细胞株中与此基因强烈的沉默为相反的被本发明利用的透明肾细胞癌患者 由来非多囊肾肾脏组织中此基因显示出较高的表现标准（图6)，运是对照群样本中明确显 示无异常。从此结果来看本发明使用的从透明肾细胞癌患者中取得的非多囊肾肾脏组织是 可W利用为多囊肾样本的正常对应物。
[0058]结果2 :细胸分划及務庚关联路巧的转录沉默
[0059] 为了研究在多囊肾中不同甲基化的基因中的作用，本发明人执行了基因本体论分 析。我们为了巧信号转送、轴索突起诱导（axonguidance)、细胞结合、电离子输送、Notch 及GnRH信号转送关联的基因超甲基化存储的反面，少数的低甲基化的基因中发现不能明 确的W功能性来聚集（表3)。细胞输送关联的基因狂FAT,OS化Ipha，P2RX4,ATP4B，TRPVl及 化〔22418)，巧信号转送关联的基因化0(，(：皿酷10，化0脚，11?口〔3，化0化9及〔4〔酷1巧，细胞 形态形成关联的基因度化2,LIG1，SA化1，S0X10,F0XI1及T肥M17她)，细胞结合关联的基因 (SYMPK,SPG7,SEMA4D,LGALS4,DSG4及MUC5B)的表观遗传（epigenetic)突变在肾脏囊肿中 表现出主要功能的非正常化的反映。特别是，被清除时已知为常染色体显性多囊肾是主要 原因的基因PKD1是在多囊肾中发现多数为甲基化但运是指PKD1的表观遗传（epigenetic) 沉默在囊肿形成时会产生影响。干预细胞分划路径调整的基因（N0TCH1，N0TC肥，DTX1，CCD C88C,CSNK1G2,WNT4,WNT7,WNT9,WNT11及DVL)也被超甲基化（表2)。并且，干预染色质重 塑的几个基因化〇4化001'山厕扣3,6歷1'1，18031^及6歷12)也是在多囊肾囊肿肾脏中被 超甲基化。运些基因的超甲基化与发现向下调整的关系确认为实时qRT-PCR(图la,化）。 重要的是运个数据里暗示此基因的基因体超甲基化会对基因沉默设及影响。基因体超甲基 化对转录因子的功能设及影响，会诱发非正常的囊肿形成。综上所述，对正常肾脏的发育所 需要的基因的基因体甲基化是囊肿形成中起到重要作用。
[0060] 结果3 :P邸1基闲体部分的腊甲基化
[0061] 进一步，多囊肾中对于诱导囊肿形成的主要原因的基因PKD1本发明人分析了设 及囊肿发育的PKD1超甲基化的影响。本发明人对被基因组全体分析使用的2人样本外再 加5个人的多囊肾患者样本对于PKD1基因的引物和对3'位在末端两处被选择的部分（探 针1及探针2)W重亚硫酸盐处理的DNA的焦憐酸测序来执行（图2a)。...