86(s), 25. 61(s), 25. 33(s), 24. 19(s), 22. 44(s), 21-.18 (s), 20. 70 (s), 20. 13 (s), 18. 81 (s), 18. 25 (s), 15. 20 (s).
[0028] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcdforC42H69N206： 697. 5156 ；found:697. 5151 〇
[0029]
[0030]实施例4SchiglautoneA的0-(哌嗪基）乙基衍生物（IV)的合成 [0031] 将化合物II(358mg，0·5mmol)溶于30mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾 (1380mg，10.Ommol)，鹏化钾（336mg，2.Ommol)和无水哌嗪（3446mg，40mmol)，混合物加热 回流6h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有机相。依次用 水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产 物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化（流动相为：石油醚/丙酮=100:0. 5,v/v)，收集淡 棕色集中洗脱带即得到化合物IV的淡棕色固体（261. 4mg，72% )。
[0032]NMR(500MHz,DMS〇-d6)δ13. 14(s, 1Η),6. 14(s,lH),5.57(d,J= 21. 3Hz, 2H),3. 59 (s, 2H),3. 52 (s, 2H),3. 01 (s, 1H),2. 68 (s, 8H),2. 57 (d,J= 3. 3Hz, 4H),2. 39 (s, 2H),2. 34 (d,J= 4. 3Hz, 8H),2. 33 (s, 1H),2. 22 (s, 1H),L88 (d,J= 11. 7Hz, 4H), 1. 79 (s, 1H), 1. 73 (s, 1H), 1. 66 (s, 1H), 1. 60 - 1. 53 (m, 3H), 1. 50 (s, 1H), 1. 37 (s, 1H),1. 28 (dd,J= 21. 3, 8. 7Hz, 4H),1. 07 (d,J= 6. 6Hz, 2H),1. 06 (s, 1H),0. 99 (t,J= 12. 0Hz, 3H), 0. 96 (t,J= 12. 5Hz, 6H), 0. 94 (t,J= 12. 5Hz, 3H), 0. 88 (d,J= 20. 0Hz, 6H).
[0033]13CNMR(125MHz，DMS0-d6)δ211. 55(s), 209. 25(s), 170. 19(s), 161. 22(s), 143. 6 2 (s),132. 14 (s),127. 86 (s),86. 08 (s),82. 53 (s),67. 07 (s),66. 22 (s),57. 27 (s),54. 54(s ),54. 24 (s),52. 84 (s),52. 00 (s),45. 88 (s),45. 35 (s),40. 76 (s),38. 67 (s),38. 45 (s),35. 12 (s),33. 65 (s),29. 96 (s),29. 07 (s),26. 83 (s),25. 61 (s),24. 15 (s),22. 43 (s),21. 16 (s) ,20. 68 (s),20. 11 (s),18. 76 (s),18. 23 (s),15. 18 (s).
[0034]HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcdforC42H71N406:727. 5374 ;found:727. 5379。
[0035]
[0036] 实施例5组合物抗肝纤维化活性
[0037] 由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是 TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞 上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
[0038] 组合物77092202050623的制备：将研磨之后过200目网的60mg化合物III的粉 末和研磨之后过200目网的40mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混 合即得到100mg组合物77092202050623,使用时用水溶解这100mg的组合物即得到组合物 77092202050623 的溶液。
[0039] 实验例1 :组合物对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用
[0040] 一、实验方法：
[0041]NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)的中科院上 海细胞所细胞库。
[0042] 将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25%胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM 培养液（含10%FCS)制成IX104cell/ml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴定存活率大于95%， 按每孔l〇〇ul加入96孔板中，在37°C、5%C02培养24h同步处理后，弃上清，加入含有药物 的DMEM培养液（含10 %FCS) 200ul，培养48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加 入150ulDMS0,振荡10分钟，使结晶溶解，酶标仪490nm处读取0D值，结果以0D49。表示。
[0043] 二、实验结果：
[0044] 1、形态学观察
[0045]NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖的速度 快；而加组合物24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短，细胞排列混乱， 细胞内代谢产物增多。化合物III和化合物IV无此作用。
[0046] MTT法检测组合物对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用。
[0047] 表1 :MTT法检测组合物对NIH/3T3增殖的抑制作用
[0048]
[0049] 注：*，与细胞阴性对照Ρ〈0· 05
[0050] 结果：组合物在20ug/ml对成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3的细胞增殖有显著的抑制作用。 表明组合物体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。化合物III和化合物IV无此作用。
[0051] 实验例2:组合物对转化生长因子-βi(TGF- β》诱导的成纤维细胞增殖的抑制作 用
[0052]TGF-βi是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β JOng/ ml刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β 1诱导的细胞增殖的抑制作用，以分析判断组合物 的作用机理。
[0053] 表2 :MTT法检测组合物对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
[0054]
[0056]注：*，与细胞+TGF对照Ρ〈0· 05
[0057]结果：组合物在20ug/ml对成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF- βi的诱导下的细胞增殖 有显著的抑制作用，化合物III和化合物IV无此作用。表明组合物体外对纤维细胞增殖的 抑制作用可能是通过干预TGF信号通路实现的。
[0058] 结论：组合物对成纤维细胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖有显 著的抑制作用；组合物对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-βi的诱导下的细胞增殖有显著的抑 制作用。组合物可以用来制备抗肝纤维化药物。化合物III和化合物IV对成纤维细胞 NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖无显著的抑制作用，对成纤维细胞NIH/3T3 在TGF-βi的诱导下的细胞增殖无显著的抑制作用，不可以用来制备抗肝纤维化药物。
[0059] 实施例6本发明所涉及组合物77092202050623片剂的制备
[0060] 取2克组合物77092202050623,加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机 制成100片。
[0061] 实施例7本发明所涉及组合物77092202050623胶囊的制备
[0062] 取2克组合物77092202050623,加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装 胶囊制成100粒。
【主权项】
1. 一种组合物77092202050623,其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该 组合物中化合物III和化合物IV的质暈百分数分别为60%和40%，2. 如权利要求1所述的组合物77092202050623的制备方法，其特征为：将化合物III的粉末和化合物IV的粉末按照质量百分数分别为60 %和40 %充分混合。3. -种如权利要求1所述的组合物77092202050623在治疗肝纤维化药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物77092202050623在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征 为所述组合物抑制成纤维细胞增殖。5. 如权利要求3所述的组合物77092202050623在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征 为所述组合物抑制生长因子诱导的成纤维细胞增殖。
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物77092202050623、制备方法及其在制备抗肝纤维化药物上的用途。本发明公开了一种组合物77092202050623及其制备方法。药理学实验表明，本发明的组合物77092202050623具有抗肝纤维化的作用，具有开发抗肝纤维化药物的价值。
【IPC分类】A61K31/496, A61P1/16, A61K31/4025
【公开号】CN105250301
【申请号】CN201510661137
【发明人】华子春, 吴俊华, 黄蓉, 王慧
【申请人】常州南京大学高新技术研究院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月14日