脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。
[0047] 4. 6肺指数的计算
[0048] 小鼠造模后进行灌胃给药，给药4天后第6天取样，颈总动脉放血处死，开胸迅速 完整取出肺脏，并于气管分叉处剪断，予4°C生理盐水漂洗去除表面血污后，再用滤纸吸干， 电子天平称重，计算肺指数=肺脏质量（mg)/小鼠体质量（g)。
[0049] 4· 7肺脏病理观察及结果判断
[0050] 随机选取做好的肺组织切片在10倍镜下进行观察，空白对照组小鼠的肺脏无病 变，其他组的小鼠肺组织病理现象的观察应按照以下的标准进行判断：（1)部分肺泡内会 有渗出物，少量的炎性细胞侵润会出现在细支气管周围，间质毛细胞血管扩张充血，出现这 种病理状态一般属于轻度病变；（2)中度肺组织病变：部分肺组织发生实变，细支气管周围 会有大量的炎性侵润，严重时会在肺泡中出现渗出物；(3)若肺组织大面积的实变，并且肺 组织有大量单个核细胞浸润，可以见到支气管被炎性渗出物阻塞肺泡、肺泡管以及以一些 细支气管，则属于重度肺组织病变。
[0051] 4. 8实验数据的处理
[0052] 肺指数以均数土标准差（X土S)表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用两两 对比的比较检验进行结果分析，数据使用SPSS17. 0统计软件进行处理。
[0053] 5、实验结果
[0054] 5. 1黄芩苷对感染Η9Ν2亚型禽流感小鼠病理症状的改善作用
[0055] 空白对照组的小鼠正常生长发育，被毛光泽，行动敏捷，体重也在逐渐增加，没有 其他异常表现。相对应的病毒模型组小鼠在滴鼻造模后的第2天开始出现各种不同的临床 症状，首先明显的症状是流鼻涕，鼻尖湿润，随着病情日益加深，小鼠开始食欲不振，精神萎 靡，到了大概造模后第6天小鼠出现呼吸困难的症状，呼吸急促伴有腹式呼吸，毛色暗哑， 体型消瘦，行动缓慢，两眼无光。到了第8天，小鼠体温下降3- 4度，开始出现死亡。利巴 韦林、黄芩苷给药组小鼠上述流感症状均有不同程度的减轻，剖检观察小鼠肺部炎症较轻 或无明显炎症。
[0056] 5. 2肺指数及肺指数抑制率检测结果：见表1
[0057] 表1黄芩苷对Η9Ν2亚型禽流感病毒感染小鼠的肺指数、肺指数抑制率的影响 (X土S，η= 10)
[0058]
[0059] 注：与对照组比较：##Ρ< 0· 01 ;与病毒组比较：*Ρ< 0· 05#Ρ< 0· 01
[0060] 小鼠感染Η9Ν2亚型禽流感病毒后引发肺部炎症，肺质量增加，病毒模型组与空白 对照组相比有显著差异（Ρ< 0. 01)，提示造模成功。肺指数相应增加黄芩苷对感染Η9Ν2病 毒的小鼠均有一定的抑制作用，其中剂量为160mg/kg以及320mg/kg的黄芩苷对感染小鼠 均有显著的抑制效果（P<0. 01)，肺指数抑制率分别为59. 14%、63.07%。
[0061] 5. 3肺脏病理切片光镜观察结果见图1。
[0062] 正常的外周未见炎性细胞浸润。
[0063] 病毒模型组小鼠的肺组织的病变属于重度肺组织病变。
[0064] 阳性对照组属于轻度肺组织病变。
[0065] 黄芩苷低剂量组（80mg/kg)肺组织切片属于中度肺组织病变。
[0066] 黄苳苷中剂量组（160mg/kg)以及黄苳苷高剂量组（320mg/kg)属于轻度肺组织病 变。
[0067] 实施例2黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠肺部炎症相关细胞因子的影 响
[0068] 1实验分组
[0069] 将10只小鼠作为空白对照组进行饲养，避免实验室交叉感染，其余50只小鼠， 造模后，随机分为5组，即黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组、利巴韦林组 (阳性对照组）以及病毒模型组。
[0070] 1.1样品的准备
[0071] 小鼠用眼科弯镊迅速夹去眼球，，用1.5ml的离心管接住流出的血液，统一存放于 4°C环境中冷藏。以2000r/min的速度，离心20min。以微量进样器吸出上层血清，置于另一 离心管中，标记好后，一 20°C保存。
[0072] 1. 2实验数据处理
[0073] IL-2、TNF-α的含量以均数土标准差（X土S)表示，多组间比较采用单因素方差 分析；数据使用SPSS17. 0统计软件进行处理。
[0074] 2实验结果
[0075] 黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠血清中IL-2的影响见图2。
[0076] 黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠血清中TNF-a的影响见图3。
[0077] 被H9N2亚型禽流感病毒感染后小鼠血清IL-2含量显著降低，TNF-a含量明显升 高，与空白对照组比较有显著差异（P〈〇. 01)，病毒对照组中的IL-2明显低于空白对照组， 病毒对照组小鼠血清中的TNF-a表达量明显高于空白对照组；阳性对照组以及黄芩苷各 个剂量组均可使感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠血清中IL-2含量升高、TNF-a含量降低， 与病毒对照组比较，差异显著（P〈〇. 01，P〈〇. 01);与黄芩苷中、高剂量组相比，黄芩苷低剂 量组小鼠的血清中IL-2有所升高，但差异没有中、高剂量组明显（P〈0. 05);与阳性对照组 相比较，黄芩苷高剂量组IL-2的含量明显升高，TNF-a含量明显降低，两组差异有统计学 意义。
[0078] 实施例3黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织表达AVPs的影响
[0079] 1.实验分组
[0080] 将小鼠分为6组，每组10只（雌雄各半），避免实验室交叉感染，5组小鼠进行造 模，即黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组、利巴韦林组（阳性对照组）以及 病毒模型组。
[0081] 2.样品的准备
[0082]小鼠处死，开腹腔后充分暴露胸腔脏器后，用镊子夹住气管向上提起，剪断肺与胸 膜的连结韧带，然后将气管连同整个肺一并取出，在肺门处剪断气管，去掉其它组织。
[0083] 3.组织蛋白抽提
[0084] 冷却RIPA蛋白质提取试剂，然后添加蛋白酶抑制剂。蛋白质提取开始前加入0. 1M PMSF，PMSF最终浓度1禮。肺组织称重，根据肺重：裂解液体积=1:9的比例加入裂解液， 肺组织匀浆，每分钟15000转的速度要求，每10秒一次、间隔10秒再一次，三次匀浆。预冷 却EP管，将均浆液放入其中。在冰上孵育20分钟，进行4°C离心，13000rpm，20min后取上 清，分装保存，待测。
[0085] 4.BCA法蛋白定量
[0086] 制备BCA工作液，按照说明书上的A液与B液的比值进行配比，A液：B液=50:1， 样品蛋白要用PBS进行稀释，BSA工作液也要进行稀释，比例为1:8.混合均匀后在水浴37 度30分钟，用酶标仪检测0D值，波长在570nm处进行检测，做出标准蛋白的标准曲线，计算 出蛋白的浓度。
[0087] 5.蛋白浓度调整
[0088] 为了调整蛋白质浓度，用RIPA进行调整。添加5X还原样品缓冲后样品，其终浓 度：PKR胞浆蛋白浓度2毫克/毫升，Mxl核蛋白浓度1毫克/毫升。沸水浴进行5分钟。
[0089] 6.SDS-PAGE电泳
[0090] 6. 1灌胶与上样
[0091] 根据目的蛋白的分子量，配制12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%。
[0092] (1)玻璃板在使用之前要清洗干净，安装时所用的封底胶条也要清洗干净，将两块 玻璃板在安装加上紧密安装好；
[0093] (2)SDS-PAGE电泳用胶的制备：见表2
[0094] 表2SDS-PAGE电泳用胶的制备
[0095]
[0096] (3)将制备好的电泳用胶灌入两块玻璃板之间，一般分离胶灌入3. 5ml，浓缩胶灌 入2ml。灌胶时要沿着玻璃板往下流，最好不要起起泡，用水封胶。灌水时要让水流缓慢流 下要防止胶面变性。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固了，然后灌入浓缩胶，加 完浓缩胶要插好梳子，等待凝固；
[0097] (4)等待浓缩胶凝固后，就可以把胶放入电泳槽中，在加入电泳液之前要先检查电 泳槽是否漏液，确保无误后加入电泳液。
[0098] (5)将电泳液灌满整个电泳槽后，开始上样品，上样量要达到每个孔20μ1。
[0099] 6· 2电泳条件
[0100] 浓缩胶恒压120V，电泳时间为80-90分钟，溴酚蓝跑到电泳槽的底部停止电泳。
[0101] 6. 3转膜
[0102] (1)电转液制备：100ml10X转膜原液用甲醇和超纯水进行稀释，要加入200ml的 甲醇和700ml超纯水。
[0103] (2)NC膜要先用甲醇溶液浸泡，至少浸泡10分钟，剪取NC膜。
[0104] (3)电泳完毕后要立刻进行转膜，在玻璃板上切好胶，按照顺序放入电转槽中。
[0105] (4)将顺序正确的夹子放入电转槽中，电转时的电压为120V，时间为2小时。
[0106] 6. 4封闭
[0107]试剂制备：1X