TBST:225mlddH20 与 25ml10XTBST混合；5 % 脱脂奶粉的 1XTNST:lg的脱脂奶粉与20ml1XTBST混合
[0108] (1)取出膜后，先用丽春红染色后剪膜，放入自封袋中
[0109] (2)用含有5%脱脂奶粉的IXTBST进行封闭，在摇床上封闭1小时
[0110] 6. 5 -抗孵育
[0111] 用含有5%的脱脂奶粉的TBST稀释一抗，室温孵育lOmin，放4°C过夜。
[0112]
[0113] 6. 6洗膜
[0114] 第二天将膜取出后放在摇床上进行孵育。洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。
[0115]6. 7二抗孵育
[0116] 用1XTBST稀释二抗，二抗孵育仍然在摇床上进行，稀释比例为山羊抗兔 IgG(H+L)
[0117]HRP，1:20000,牛抗羊IgG(H+L)HRP，1:5000,室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗膜 5 次，每次3min。
[0118] 6. 8凝胶图象分析
[0119]ECL加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min，显影2min，定影。
[0120] 7、实验结果
[0121] 黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织PKR的表达情况见图4。
[0122] WesternBlotting的结果显示，图4显示的是抗病毒蛋白PKR所表达出的特异性 蛋白条带（68kDa)，从图像中可以清晰的看出在经过黄芩苷的治疗后，小鼠肺组织中的抗病 毒蛋白PKR的表达量是有所提高的；图6显示的是另一种抗病毒蛋白Mxl表达的特异性蛋 白（72kDa)，Mxl蛋白是一种核蛋白，在图像中显示了经过黄芩苷的治疗，Mxl蛋白的表达量 明显增多。具体的WesternBlotting的灰度值分析显示如图5和图7。
[0123] 对Westernblot结果进行了灰度值分析，（如图5、图7所示），给感染了H9N2亚 型禽流感病毒的小鼠灌胃给药后，第6天时采取其肺组织进行免疫印迹实验，病毒模型组 的小鼠肺组织PKR蛋白相对表达量与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01);经过黄芩 苷的灌胃给药后，黄芩苷中、高剂量组PKR蛋白相对表达量与病毒模型组相比，均差异极显 著（P< 0.01)，黄芩苷低剂量组与病毒模型组相比PKR蛋白表达量，差异显著（P< 0.05); 图7显示小鼠肺组织Mxl蛋白的表达量，图中数据表明病毒模型组的小鼠肺组织Mxl蛋白 相对表达量与空白对照组相比，差异极显著（P< 0.01);经过黄芩苷的灌胃给药后，黄芩苷 低、中、高剂量组Mxl蛋白相对表达量与病毒模型组相比，均差异极显著（P< 0. 01)。综合 上述数据显示，PKR和Mxl的相对表达量均随着黄芩苷浓度的增加而增加。
[0124] 实施例4黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感小鼠的T淋巴细胞亚群的影响
[0125] 1、实验材料
[0126] 1. 1主要仪器：流式细胞仪
[0127] 1.2主要试剂
[0128] (1)病毒株：为H9N2亚型禽流感病毒毒株。
[0129] (2)黄芩苷，购于上海同田生物技术有限公司（批号：E-00200)。
[0130] (3)利巴韦林片，购于中国药品检察所（批号：140629)
[0131] (4)红细胞裂解液，购于北京赛驰生物有限公司（批号：110002-100)
[0132] 1.3实验动物
[0133] 6~8周昆明种小白鼠60只，体重15 - 18g，雌雄各半。
[0134] 2、实验方法
[0135]2. 1实验动物分组与造模
[0136] 将小鼠称体重后按照每组10只小鼠进行分组（雌雄各半），一共分为6组，防止 交叉感染，造模后的小鼠随机分为5组，即黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂 量组、利巴韦林组（西药阳性对照组）以及病毒模型组。以H9N2亚型禽流感病毒稀释液 0.lml滴鼻，空白对照组按同样方法以生理盐水0.lml滴鼻。
[0137] 2. 2给药方法
[0138] 病毒模型组、空白组：生理盐水0.4ml/只·(!灌胃，分两次进行灌胃；治疗组分别 配置：黄芩苷低剂量组按80mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0. 4ml/只·d分两次灌胃；黄 芩苷中剂量组按160mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0. 4ml/只·d分两次灌胃；黄芩苷高 剂量组按320mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0. 4ml/只·d分两次灌胃；利巴韦林组：利 巴韦林阳性组按l〇mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0. 4ml/只·d分两次灌胃。攻毒后24 小时开始给药，给药3天后取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，剩余的小鼠继续给药，给药后第6 天取小鼠脾脏制成脾细胞悬液。
[0139]2. 3小鼠脾细胞悬液的制作过程
[0140](1)脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡3分钟小鼠表面，剖腹取小鼠脾脏，浸泡于PBS 中；
[0141] (2)在有PBS的平皿上放置一个200目筛网，将脾脏用手术剪刀剪碎放在筛网上， 用注射器塞轻轻按压研磨；
[0142] (3)充分研磨后，将滤过的细胞悬液转移至15ml离心管中，300g离心5分钟，弃上 清；
[0143] (4)加入红细胞裂解液5ml混匀，裂解5分钟后，300g离心5分钟，弃上清；
[0144] (5)加入PBS5ml混匀，300g离心5分钟，弃上清；
[0145] (6)加入PBS5ml混匀，计数细胞。
[0146] 2. 4样本染色处理
[0147] 取100μ1调节好浓度的脾细胞悬液加入流式管中；
[0148] 加入适量⑶4、⑶8、⑶3、⑶49b荧光标记抗体，充分混合均匀，室温避光反应20分 钟；
[0149] 同时做好空白对照管，以及单色的荧光补偿管，用以调节仪器电压、补偿等；
[0150] 每管中加入2mlPBS重悬细胞后，350g离心5分钟，离心后弃上清；
[0151] 每管中加入0. 5mlPBS重悬细胞后，室温避光放置待上机获取数据；
[0152] 2. 5实验数据处理
[0153] 在流式细胞仪上圈门淋巴细胞，获取20000个细胞。最终⑶4+/⑶8+比值以均数 土标准差（X土S)表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用完全随机设计多样本比较的 秩和检验，数据使用SPSS17. 0统计软件进行处理。
[0154] 3、实验结果，见表3
[0155] 表3黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠脾脏T细胞亚群的影响（X土s，η= 6)
[0156]
[0157]与对照组比较：#Ρ< 0. 05##Ρ< 0. 01 ;与病毒组比较：*Ρ< 0. 05#Ρ< 0. 01
[0158] 感染Η9Ν2亚型禽流感流感病毒后小鼠的脾脏逐渐萎缩，体内⑶4+Τ细胞数量下 降，⑶4+/⑶8+均比对照组降低。从表4-1的数据可以表明，感染病毒后第3天，病毒组小鼠 脾脏⑶4+/⑶8+均比空白对照组降低（Ρ< 0. 05)，感染后第6天差异更显著（Ρ< 0. 01)， 黄芩苷能够抑制病毒感染导致的小鼠脾脏萎缩及CD4+T细胞数下降。感染病毒后第3天， 黄芩苷能够提升小鼠⑶4+/⑶8+(Ρ< 0. 05)，给药3天后只有黄芩苷高剂量组能够显著提升 小鼠的⑶4+/⑶8+的比值（Ρ< 0. 01);然而在给药后第6天，黄芩苷各个剂量组均能够极 显著提升小鼠的⑶4+/⑶8+(Ρ< 0. 01)。正常小鼠第6天的脾脏⑶4+/⑶8+明显大于第3 天，表明在生长期小鼠免疫细胞快速增长。而黄芩苷对正常小鼠的免疫细胞没有明显影响。
【主权项】
1. 黄芩苷在制备具有治疗感染H9N2亚型禽流感病毒的药物 中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在制 备对肺组织具有保护作用的药物中的应用。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在制备有利于抗病毒的细胞 因子水平并且能抑制促进炎症反应的细胞因子的分泌的药物中的应用。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在制备抗病毒蛋白的表达，能 有效地提高机体的免疫能力的药物中的应用。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用是在制备对于病毒抑制机体的 ⑶4+/⑶8+比值有极显著地恢复作用的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了黄芩苷在制备具有治疗感染H9N2亚型禽流感病毒的药物中的应用，本发明开辟了黄芩苷的新用途，为感染H9N2亚型禽流感病毒的治疗提供了新的药物。
【IPC分类】A61P31/16, A61K31/7048
【公开号】CN105250322
【申请号】CN201510732097
【发明人】胡格, 董虹, 穆祥, 袁欣
【申请人】北京农学院, 北京金宸新宇科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月2日