黄芩苷在制备具有治疗感染h9n2亚型禽流感病毒的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黄芩苷的新用途，特别涉及黄芩苷在制备具有治疗感染H9N2亚型禽 流感病毒的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 90年代开始我国南部就出现H9N2亚型禽流感病毒的流行趋势，并且呈广泛流行 的趋势，这种流行趋势是不能疏忽的，人们必须重视起来，H9N2亚型禽流感病毒第一次出现 在我国的广东省，那一年是1994年。往后的几年里，随着病原体的扩散，在香港的活禽市场 里也发现了H9N2亚型禽流感病毒，这也进一步说明了H9N2亚型禽流感病毒是有逐渐蔓延 的趋势，在我国可能已经广泛存在，所以也给各地区的养禽业造成巨大的威胁。
[0003] 目前，人们预防病毒一般都是利用疫苗，但是这种方法并不是最为有效的方法，而 且也不经济。病毒在侵入机体后进入细胞内繁殖，所以疫苗是无法针对那些已经进入到细 胞内的病毒进行清除，病毒在这种感染过程中很有可能发生基因重组，最终导致"超级病 毒"的诞生。化学性药物治疗病毒病效果甚微，这是因为一方面药物进入机体通过各种屏障 作用和酶系作用，使得浓度降低很多；另一方面病毒呈严格的细胞内寄生，抗病毒药物在破 坏或抑制细胞内病毒的同时，也对未感染的细胞产生了不必要损伤。此类做法存在耐药性、 残留性、毒副作用大、抗病毒谱较窄等缺点，因而临床应用有限。因此，需要不断研发新的抗 病毒的药物去对抗H9N2亚型禽流感病毒来减轻大量疫苗不被利用的情况。
[0004] 中医认为黄芩有清热解毒的作用，但对于黄芩苷抗H9N2亚型禽流感病毒毒株作 用的研究还属于空白。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于公开黄芩苷在制备具有治疗感染H9N2亚型禽流感病毒的药物中 的应用。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] 黄芩苷在制备具有治疗感染H9N2亚型禽流感病毒的药物中的应用。
[0008] 本发明所述的应用是在制备对肺组织具有保护作用的药物中的应用。
[0009] 本发明所述的应用是在制备有利于抗病毒的细胞因子水平并且能抑制促进炎症 反应的细胞因子的分泌的药物中的应用。
[0010] 本发明所述的应用是在制备抗病毒蛋白的表达，能有效地提高机体的免疫能力的 药物中的应用。
[0011] 本发明所述的应用是在制备对于病毒抑制机体的CD4+/CD8+比值有极显著地恢 复作用的药物中的应用。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] 本发明开辟了黄芩苷的新用途，为感染H9N2亚型禽流感病毒的治疗提供了新的 药物。
【附图说明】
[0014] 图1:黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠肺组织病理切片（HE10X)A:正 常组；B:病毒模型组；C:阳性对照组；
[0015] D:黄芩苷低剂量组；E:黄芩苷中剂量组；F:黄芩苷高剂量组；
[0016] 图2 :黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠血清中IL-2的影响，与空白组比 较：##p< 〇· 〇1 ;与病毒组比较：*p< 〇· 〇5#P< 〇· 01 ;
[0017] 图3:黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒的小鼠血清中TNF-α的影响，与对照组 比较：##Ρ< 0. 01 ;与病毒组比较：*Ρ< 0. 05#Ρ< 0. 01 ;
[0018] 图4 :黄芩苷对感染Η9Ν2亚型禽流感病毒小鼠肺组织PKR的表达情况，Normal为 空白组；Model为病毒组；Positivecontrol为阳性组；lowdose、medialdose、highdose 分别代表低、中、高剂量黄芩苷组；
[0019] 图5:黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织PKR蛋白表达量，与空白组 相比较：##P< 0. 01 ;与病毒模型组相比较：*P< 0. 05#P< 0. 01 ;
[0020] 图6 :黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织Mxl的表达情况，Normal为 空白组；Model为病毒组；Positivecontrol为阳性组；lowdose、medialdose、highdose 分别代表低、中、高剂量黄芩苷组；
[0021] 图7 :黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织Mxl蛋白表达量，与空白组 相比较：##P< 0. 01 ;与病毒模型组相比较：*P< 0. 05#P< 0. 01 ;
【具体实施方式】
[0022] 下述实施例用于进一步说明，但不限于本发明。
[0023] 实施例1 :黄芩苷对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠肺组织的保护作用
[0024] 1、主要试剂
[0025] 病毒株：为H9N2亚型禽流感病毒毒株，由中国农业大学实验室提供。病毒用9日 龄鸡胚进行繁殖培养传代，提取出来的尿囊液用血凝抑制试验进行效价的测定，血凝效价 为2 7以上的尿囊液供试验用。（鸡胚购于北京梅里亚生物有限公司）
[0026] 2、实验动物
[0027] 6~8周昆明种小白鼠60只，体重15- 18g，雌雄各半。
[0028] 3、实验药品
[0029] 黄芩苷，购于上海同田生物技术有限公司（批号：E-00200)。实验设低、中、高三个 剂量，三种剂量是成倍增长的，低、高剂量分别为80mg/kg·d、160mg/kg·d、320mg/kg·d。
[0030] 利巴韦林片（中国药品检察所批号：140629)25mg/支，剂量为lOmg/kg·d。
[0031] 实验时，各药均以DMEM溶液作溶剂配制灌胃。
[0032] 4、实验方法
[0033] 4. 1病毒空斑实验
[0034] 用常规培养好的MDCK接种100倍成倍稀释的病毒液，接种后病毒要吸附lh，之 后加入含有琼脂糖的病毒培养液，先放在超净工作台，待琼脂糖凝固后，放置37°C、5%C02 条件下培养3d，出现白色点就以福尔马林缓冲结晶紫溶液固定和染色，计算空斑形成单位 (PFU/ml)〇
[0035] 营养物配方：总量为2〇!111包括01^]\1(2\)1〇1111、加入6 4 1了?0((111^/1111)终浓度 为0.2μg/ml、琼脂糖10ml ;DMEM(2X):总量500ml称取9.4g DMEM粉末溶解于无菌纯水 462ml过滤除菌，另补加终浓度0.6mg/ml谷氨酰胺，100U/L青霉素，100μg/L链霉素，7 % NaHC03,0 . 02mol/L HEPES，0. 4% BSA。通过公式计算空斑形成单位：
[0036] 空斑数量（PFU/ml)=[平均每孔的空斑数/每孔病毒接种量（ml) ]X病毒稀释 度。
[0037] 本试验最终检测出病毒的空斑形成单位为2X107PFU/ml。
[0038] 4. 2实验分组
[0039] 将小鼠进行称体重后，按照每组10只小鼠进行分组（雌雄各半），一共分为6组， 置于动物房中隔离饲养，为了防止实验小鼠之间的交叉感染，所以将造模后的小鼠与空白 组小鼠分开饲养，造模后的小鼠共分为5组，即黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷 高剂量组、利巴韦林组（西药对照组）以及病毒模型组。把空白对照组与其它组饲养于不 同的动物房，要确保两个动物房的外界条件一样。
[0040] 4. 3动物造模
[0041 ] 以滴鼻方式建立禽流感病毒感染小鼠模型。
[0042] 造模后48h小鼠会出现相应的临床症状，比如精神沉郁、耸毛、卷缩、毛发无光泽、 眼球浑浊，行动迟缓无力、消瘦、畏寒怕冷、到后期会有呼吸急促的表现，小鼠的临床症状会 在第3- 8天出现典型症状，如果出现上述的临床症状之后，就要进一步进行病理的剖检， 将小鼠处死后打开小鼠的胸腔，观察肺脏组织的病理变化，若肺脏体积增大，有明显的出 血、淤血、水肿，肺表面出现大片的片状暗红色肺实变区，或是涉及部分或整个肺叶。就要将 小鼠的肺组织做病理组织切片，用HE染色后在光镜下观察肺部病理切片，肺泡间隔明显增 宽，肺间质内大量炎细胞浸润，间质毛细血管扩张、充血，炎症区肺泡结构消失，且肺指数与 正常对照组相比显著增加。
[0043] 4. 4给药方法
[0044] 用稀释过后的病毒液给小鼠滴鼻。病毒模型组、空白组：生理盐水0.4ml/只·(！ 灌胃，分两次进行灌胃；治疗组分别配置：黄芩苷低剂量组按80mg/kg·d剂量，以DMEM溶 液配成0. 4ml/只·d分两次灌胃；黄芩苷中剂量组按160mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成 0. 4ml/只·d分两次灌胃；黄芩苷高剂量组按320mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成0. 4ml/ 只·d分两次灌胃；利巴韦林组：利巴韦林阳性组按10mg/kg·d剂量，以DMEM溶液配成 0. 4ml/只·d分两次灌胃。在造模后24小时以后对小鼠进行给药，每天两次灌药，每次的 剂量为0. 2ml，一共给药4天，停药后第2天采取肺脏组织，进行各项指标检测。
[0045] 4. 5组织取材与处理
[0046] 肺组织块固定，