一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法，属于生物制药领 域。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素-12(IL-12)是人体内重要的细胞因子，可提高辅助性T细胞数量和活 性W增强整体的免疫功能，通过调节NK细胞和巨隧细胞介导的非特异性的免疫和化1、CTL 介导的特异性免疫作用，产生一系列的生物效应。国外重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的 临床试验方案已达30多项，设及多种传染病(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病），多种肿瘤(如 黑色素瘤、肾癌、直肠癌、前列腺癌、宫颈癌等），自身免疫性疾病和哮喘等，但至今仍未批准 上市，将rhIL-12制备成使用方便，易于人体吸收、代谢的剂型，显的尤为重要。
[0003] 注射剂作用迅速可靠，不受抑、酶、食物等影响，无首过效应，可发挥全身或局部定 位作用，适用于不宜口服药物和不能口服的病人。低剂量的rhIL-12对治疗急性放射病有很 好的效果，对于核事故等紧急情况下，需要作用迅速和使用方便的剂型因此将rhIL-12制成 注射剂是本领域技术人员的研究方向之一。
[0004] 目前国内外市场尚未有白介素-12注射剂剂型被批准，无论是水针剂（即液体注射 剂)还是粉针剂。运是因为rhIL-12溶液在存放过程中稳定性较差，不溶性微粒逐渐增高，很 快超过允许限度，溶液出现絮状凝集物或细小蛋白颗粒。因此现有的研究倾向于将rhIL-12 制成冻干粉针剂。中国专利申请CN102178931A公开了一种运样的制剂，其通过将包含rhlL- 12、甘露醇、人血白蛋白、憐酸氨二钢、憐酸二氨钢和氯化钢的溶液冻干而获得，W避免降低 生产的rhIL-12的蛋白含量和生物活性，并保持其稳定性。
[000引粉针剂虽然稳定性较好，但是制备方法复杂，成本高，使用时需要加入注射用水， 给临床使用带来不便。尤其是，发生核事故时，需要及时给病人注射rhIL-12,紧急情况下， 在事发地进行紧急救治，粉针剂就有些不太方便。因此研制开发rhIL-12水针剂型具有重要 的意义。
[0006] 水针剂型取代冻干剂型是生物制品的发展趋势，许多医药公司都积极将细胞因子 类蛋白质药物制成水针剂型，如干扰素、白介素2、G-CSF、EP0等。与冻干剂型相比，水针剂型 具有明显优势，水针无需溶解，直接注射，给药方便，制造成本明显降低，易于被医生和患者 接受，质量风险较小等。
[0007] 但是，鉴于白介素-12注射剂的长期稳定性，包括抑，活性等，还有保持良好的药效 等上述技术难题，目前尚未开发出令人满意的rhIL-12液体注射剂。
【发明内容】
[0008] 本申请发明人针对运个课题，展开了一系列的研究，对处方进行了优化，最终研制 成功了稳定的rhIL-12的溶液配方，该配方可开发成直接注射给药的液体注射剂，其稳定性 甚至优于一般的粉针剂。
[0009]具体而言，本发明提供一种重组人白细胞介素-12的溶液剂，其包含重组人白细胞 介素-12、憐酸盐缓冲液PB、化C1和泊洛沙姆188，其中憐酸盐缓冲液PB将所述溶液剂的抑保 持为6.0~7.2。
[0010] 在一个实施方式中，所述重组人白细胞介素-12的浓度为3~50yg/mL，优选5~20μ g/mL，优选10~15yg/mL。重组人白细胞介素-12是本发明溶液剂的活性成分，从保持稳定 性，防止出现不溶性微粒的角度出发，将其浓度设为上述范围。另外，发现在pH为6.0~7.2 时，作为活性成分的重组人白细胞介素-12,稳定性较好。
[0011] 在一个实施方式中，所述化C1的浓度为使得溶液剂的渗透压为260~320m0sm/kg， 优选为60~200mM，优选为100~150mM，最优选为150mM。化Cl的作用是作为渗透压调节剂来 调节溶液剂的渗透压。与常用的海藻糖相比，对本发明而言，NaCl能够更好地发挥调节渗透 压的作用。
[001引在一个实施方式中，所述泊洛沙姆188的0.05~0.2w/v，优选为0.1 %w/v。泊洛沙 姆188是聚氧乙締聚氧丙締酸嵌段共聚物，可通过商购获得，通常市售平均分子量为约 7680-9510)。在本发明中，泊洛沙姆188起表面活性剂(增溶剂)的作用。其能够促进rhIL-12 的溶解，防止聚合，同时防止吸附作用。此外申请人令人惊奇地发现，与其他常规表面活性 剂药用辅料，例如吐溫-20相比，泊洛沙姆188有利于长期胆存后rhIL-12的比活性的保持 (参见表9)。
[0013]在一个实施方式中，将所述溶液剂用作注射液。
[0014]在本发明的一个优选实施方式中，所述溶液剂包含lOyg/mL的重组人白细胞介素-12、将所述溶液剂的pH保持为6.0的憐酸盐缓冲液PB、150mM的NaCl和0.1 %的泊洛沙姆188。 [001引此外，本发明还提供上述重组人白细胞介素-12的溶液剂的制备方法，所述方法包 括：
[0016] 。称量一 溝酸二氨钢和无水憐酸氨二钢，力脏射用水溶解，配制PB缓冲液；
[0017] 2)向上述溶液中加入作为渗透压调节剂的NaCl，揽拌溶解；
[0018] 3)向上述溶液中加入作为增溶剂的泊洛沙姆188，揽拌至完全溶解；
[0019] 4)调节抑至6.0~7.2，用NaOH或出P〇4调节抑，所述NaOH或出P〇4的优选浓度为1M;
[0020] 5)加入重组人白细胞介素-12蛋白原液，W使重组人白细胞介素-12终浓度为3~ 50yg/mL，优选5~20yg/mL，优选10~15yg/mL的方式的方式定容至终体积。
[0021] 与现有技术相比，本发明重组人白细胞介素-12的溶液剂及其制备方法，所得的产 品外观良好，不会降低生产的rhIL-12的蛋白含量和生物活性，稳定性好，制备方法简单。
[0022] 此外，本发明解决了冻干粉针剂型外观不佳、不溶性微粒偏高，可见异物超标等问 题;提供的溶液剂具有很好的稳定性，外观澄清、无不溶物、不含防腐剂、不含血液成分，所 含的活性多肤的体外活性比较稳定;在规定条件下，可稳定保存至少11个月，优选1年W上， 更优选2年W上，且产品质量比粉针剂型有明显提高。
【附图说明】
[0023]图1是说明不同抑的剂型4的含量检测的图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] 按pH=6加入憐酸盐缓冲液PB，加适量水溶解后，再加化Cl，使其终浓度为150mM， 溶解后，加入终浓度为0.1 %的泊洛沙姆188，完全溶解后，用1M化OH调节pH为6.0，并加入 终浓度为l〇yg/ml的重组人白细胞介素-12,从而制得本发明的溶液剂。其在下述制剂剂型 筛选实验中作为剂型4给出。
[0026] W下通过制剂剂型筛选实验来说明本发明溶液剂的具体配制、组分和优点。
[0027] 实施例2
[002引 1.剂型初步筛选
[0029] 1.1剂型设计
[0030] 表1剂型设计方案
[0031]
[0032] 剂型设计同时考虑了冻干粉剂和溶液剂两种剂型，冻干粉制剂容易保存，运输方 便，但是冻干工艺较为复杂，因此，两种类型的制剂均在考察范围内。
[0033] 最初实验设计了 3个冻干粉剂和2个溶液剂剂型，共5个剂型。从外观、含量、活性等 几个方面进行检测分析，比较各种剂型在一定条件下（25°C)的稳定性，筛选较为优良的剂 型。
[0034] 1.2剂型筛选实验 [003引 1.2.1外观检查
[0036 ]剂型1、2、3为冻干粉剂，其外观状况如下：
[0037] 1号剂型:多数粉饼完整，无散块、粉末，少数含有散块、散粉，且粘壁；
[003引2号剂型:粉饼体积基本为1ml，有散块、粘壁现象；
[0039] 3号剂型:粉饼体积极小，为不定形白色块状，无粘壁现象。
[0040] W上冻干粉剂中，1号最好，偶有粘壁和散块现象。2号次之，粉饼体积略少，有散 块。3号最差，絮状，无定形，体积极小。各冻干粉剂均易复溶，且复溶后，溶液透明，无不溶 物，无混浊现象。
[0041 ] 溶液型剂型4、5，溶液澄清，无不溶物。
[0042] 1.2.2渗透压
[0043] 表2制剂的渗透压测定
[0044]
[004引检测W上5个剂型的渗透压，剂型1、2、4的渗透压为300mmol/kg左右，符合注射剂 型的标准要求范围260-340mmol/kg;而剂型3、5的渗透压值偏低，不符合渗透压标准。
[0046] 1.2.3含量分析
[0047] 表3制剂的Elisa含量测定
[004引
[0049]检测时间为配制后第14天，每种剂型的样品随机各取2份，原液样品1份，用Elisa 法检测样品11-12蛋白含量。
[0050]剂型1、2、3为冻干粉剂，剂型4、5为溶液剂，从上表的含量数据看来:溶液型的5号 制剂含量最高，最为接近原液蛋白含量;剂型1最为差一些，其他3个剂型相差不大。
[0051]同时，制剂1和制剂4的区别仅在于，剂型1为冻干型，剂4为溶液型，制剂3和制剂5 的区别仅在于，剂型3为冻干型，剂5为溶液型。对比冻干粉剂型和溶液剂型，溶液型制剂似 乎比冻干粉剂型的蛋白含量高，更为接近原液蛋白含量。而关于冻干粉制剂蛋白含量较低 的原因，可能是赋形剂、冻干保护