明显:
[0033]图1为靶向纳米共振对比剂的两步法构建及作用原理示意图；
[0034]图2为靶向纳米共振对比剂的表征图；
[0035]其中，A为电镜图；B为粒径分布图；
[0036]图3为靶向纳米共振对比剂的磁敏感特征表征图；
[0037]其中，A为纳米粒磁滞回线；B为不同浓度下纳米粒MRI T2信号强度；
[0038]图4为建立体外RBCECs模型，比较对照组及谷氨酸诱导组RBCECs的P-糖蛋白表达结果图；
[0039]其中，A为免疫荧光共聚焦定性分析图，谷氨酸诱导下(右)RBCECs的P-糖蛋白表达明显高于正常对照组(左)；B为流式细胞仪FITC荧光定量分析，谷氨酸诱导(右)RBCECs的P-糖蛋白增高2.5倍；
[0040]图5为建立体外RBCECs模型，分析靶向纳米粒对P-糖蛋白的特异性结合的结果不意图；
[0041 ] 其中，A为流式细胞仪FITC荧光定量分析结果图，P-糖蛋白高表达时，靶向纳米粒结合力最高为谷氨酸诱导组，免疫荧光共聚焦定性显示靶向纳米粒在RBCECs的分布明显高于单纯纳米粒；
[0042]图6为建立癫痫动物模型，比较癫痫组与假手术组海马区P-糖蛋白表达的结果示意图；
[0043]其中，A、B为Western Blot定量分析结果图；C为免疫荧光共聚焦定性分析结果不意图，療痛组P-糖蛋白明显增闻；
[0044]图7为建立癫痫动物模型，分析靶向纳米粒对P-糖蛋白的特异性结合的结果示意图；
[0045]其中，A为MRI直观显示靶向纳米粒(右)在癫痫灶的分布明显高于单纯纳米粒(左)；B为脑组织冰冻切片普鲁士蓝染色示癫痫灶内靶向纳米粒高聚集。
【具体实施方式】
[0046]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0047]实施例1
[0048]本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体如下所示:
[0049]PEG-USP10 纳米粒的制备:准确称量 1mg 脂质 USP1，50mg DSPE-PEG-MAL,5mgDSPE-PEG-FITC，溶于2ml 二氯甲烷后，冰水浴下超声10min，37°C旋蒸15min去除二氯甲烧,2500rpm4°C离心1min后弃上清,0.5mL去离子水分散沉淀获得纳米粒。
[0050]胃酶抑素A-PEG-USP10纳米粒的制备:在制备所得的去离子水分散的纳米粒2ml (5mg/mL USP10)加入巯基活化试剂胃酶抑素A2mg/ml0.5ml后低速电动搅拌4h，2500rpm4°C离心1min后弃上清，0.5mL0.0lM PBS (pH7.4)分散沉淀获得我们所需要的带有革巴向功能分子的纳米粒。
[0051]采用粒径分析仪测定纳米粒的粒径及Zeta电位,经过I % (w/v, pH7.0)磷鹤酸负染色后，透射电镜观察粒子形态，结果如如图2:胃酶抑素A-PEG-USP10形状规则圆整，直径约为40nm ;同时采用MRI分析靶向纳米粒的磁敏感特征及T2信号强度，结果如图3:纳米粒磁敏感稳定，具备极好的T2WI信号对比度。
[0052]实施例2
[0053]将BCEC细胞(大鼠脑毛细血管内皮细胞)以5X 15细胞每孔的浓度接种于六孔板中进行实验；1?3孔为空白对照组；4?6孔为实验组，每孔加入100uM(l.5g/100ml)谷氨酸，于37°C孵育30min后，PBS (磷酸缓冲液)清洗两遍，加入完全培养液常规培养；24h后每组分别加入PBS、PEG-USP10、胃酶抑素A-PEG_USP10(USP10浓度为50 μ g/ml)，于30min后取样行免疫荧光共聚焦定性分析、流式细胞仪FITC荧光定量分析，结果如图4、图5所示:图4所示谷氨酸可诱导BCEC细胞高P-糖蛋白，图5所示靶向功能分子胃酶抑素A可占据了 P-糖蛋白的结合位点，有助于纳米粒转运与显影。
[0054]实施例3
[0055]立体定位SD大鼠左侧海马CA3区，微针注射3 μ L红藻氨酸(ΚΑ，0.5mg/mL)，建立癫痫动物模型；注射3yL PBS(磷酸缓冲液)为假手术对照组；4%多聚甲醛心脏灌流，取脑，通过免疫荧光共聚焦成像及Western Blot分析观察癫痫组、假手术组海马区P-糖蛋白的表达，结果如图6所示:图6显示癫痫组海马区P-糖蛋白表达明显高于假手术组，提示癫痫发作与P-糖蛋白表达增高关系密切。
[0056]实施例4
[0057]建立SD大鼠癫痫动物模型，按PEG-USP10、胃酶抑素A-PEG-USP1分为两组，以10mg/kg剂量，鼠尾静脉给药0.3ml，4h后行3.0T MRI颅脑T2WI扫描，如图7A结果所示，短肽胃酶抑素A修饰的USP1纳米粒在脑癫痫部位的分布明显多于未修饰的纳米粒，其T2信号强度明显减低。
[0058]生理盐水及4%多聚甲醛心脏灌流，取脑后行冰冻切片，普鲁士兰溶液染色，观察USP1在癫痫灶内及癫痫灶周围组织中的分布，如图7B结果所示，短肽胃酶抑素A修饰的纳米粒在脑海马区的分布呈明显铁染色，在动物水平证实了 Pepstatin A可与P-糖蛋白的特异性结合，靶向功能分子短肽胃酶抑素A的修饰有助于USP1纳米粒分布到癫痫部位。
[0059]实施例5
[0060]本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体方案与实施例1相同，不同之处仅在于:
[0061]超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)的重量比为1:8:1。
[0062]实施例6
[0063]本实施例提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备，具体方案与实施例1相同，不同之处仅在于:
[0064]超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)的重量比为3:12:1。
[0065]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述纳米磁共振对比剂包括超小型超顺磁性氧化铁粒子、胃酶抑素A、免疫荧光标记物和聚乙二醇。2.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的表面活性基团包括羧基、马亚酰亚胺基、巯基、胺基、生物素或亲和素。3.根据权利要求1或2所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的直径在50nm以下。4.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述免疫荧光标记物包括异硫氰酸荧光素。5.根据权利要求1所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000?20000。6.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，其特征在于，所述制备的具体包括如下步骤: 步骤一、将超小型超顺磁性氧化铁粒子、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记按重量比为(I?3): (8?12):1混合，溶于二氯甲烷，冰水浴超声1min ;37°C旋蒸去除二氯甲烷；4°C下2500rpm离心后弃上清，水分散沉淀，获得水分散纳米粒； 步骤二、向水分散纳米粒加入巯基活化的胃酶抑素A，搅拌；2500rpm4°C离心，弃上清；用缓冲液分散沉淀，得靶向纳米磁共振对比剂。7.根据权利要求6所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，其特征在于，步骤二中，所述缓冲液包括磷酸缓冲液。8.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂在制备特异性显示高表达P-糖蛋白癫痫灶的临床诊断试剂中的应用。9.一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，其特征在于，所述递药系统的靶向功能分子为线性短肽胃酶抑素A，荧光标记物为异硫氰酸荧光素，纳米载体为表面聚乙二醇修饰的超小型超顺磁性氧化铁粒子；抗脑癫痫药物以包裹或共价连接的方式与纳米载体结合，线性短肽通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连。10.根据权利要求9所述的针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，其特征在于，所述递药系统的粒径为30?50nm。
【专利摘要】本发明公开了一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用，所述磁共振对比剂包括靶向功能分子，荧光标记物和纳米载体；所述的靶向功能分子为针对癫痫灶区高表达的P-糖蛋白具有高亲和力的短肽；所述荧光标记物以共价连接的方式包载在纳米载体内，短肽通过共价连接的方式与纳米粒表面的聚乙二醇相连。该对比剂可通过静脉注射，使得短肽与癫痫灶区高表达的P-糖蛋白结合，促进纳米载体在癫痫灶聚集，MRI？T2加权显像病灶区呈显著低信号，从而能够准确、直观显示特发性/隐源性癫痫灶，有助于临床提高治疗的精确性和安全性，评价抗癫痫治疗方式的疗效、评估癫痫患者的预后。
【IPC分类】A61K47/48, A61K49/18, A61K47/42, A61K47/04, A61P25/08, A61K49/12, A61K49/00, A61K49/14, A61K9/51
【公开号】CN105497922
【申请号】CN201410499261
【发明人】王剑虹, 张军, 于向荣, 耿道颖, 庞志清, 潘嘉炜
【申请人】复旦大学附属华山医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月25日