【具体实施方式】
[0008] 下面结合附图和实施例，进一步详细说明本发明的内容。
[0009] 实施例1样品处理。
[0010] 首先对样品进行处理，选取雄性清洁剂C57/6J小鼠（体重，22~25克)雄性，体重20 ± 2g，随机分为6组，即假手术组1组，给药组5组，给药组包括MCAO模型组、羟基红花黄色素 A (HSYA )1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg三组以及阳性对照组尼莫地平(NIM0,2 mg/kg)。
[0011] 其中假手术组仅暴露而不凝闭大脑中动脉，假手术组以4 mL/kg的药物量尾静脉 注射同等体积的生理盐水;给药组使用线栓法小鼠 MCAO脑缺血再灌注模型进行处理，在缺 血1小时后尾静脉注射4 mL/kg各组药物进行再灌注操作，再灌注操作结束24 h后再进行下 述对比实验;其中MCAO模型组在缺血1小时后不再注射药物。
[0012]线栓法小鼠 MCAO脑缺血再灌注模型：对C57BL/6J小鼠腹腔注射4 %水合氯醛10 m L / k g麻醉后，仰卧位固定，颈部中线切口分离并暴露右侧的颈总动脉（C C A )、颈外动脉 (ECA)及颈内动脉（ICA);采用微动脉夹同时夹闭近心端颈总动脉及远端颈内动脉，于颈外 动脉远心端用显微剪刀剪一小口，通过颈总动脉分叉，插入制备好的6-0尼龙单丝血管栓塞 丝线进入颈内动脉，深度以过颈总动脉分叉8-10 _为宜。插线结束后，紧紧系牢ECA近心端 的细线，缺血操作结束I h后，松开固定线，电凝颈外动脉，并松开颈总动脉结扎线，从而进 行再灌注操作;所述缺血操作过程为在小鼠左心室处剪开一小口，以0.9 %生理盐水从小口 处进行灌注，直至灌注到流出液体为淡红色或透明色为止;整个手术过程中动物肛温保持 在37.5±0.5 °C。运用激光多普勒血流仪检测缺血侧脑血流，选用缺血侧脑血流降至基准 血流20 %以下的小鼠进行进一步的实验研究。弃去手术超过15 min或手术中有出血，麻醉 过深的动物及血流未降至基准血流20 %以下的小鼠。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养 盒中，自由饮水、进食。
[0013] 实施例2以系列亲和色谱法证明羟基红花黄色素 A对To 11样受体4的识别作用。
[0014] 将上述经过实施例1处理后的假手术组和给药组使用10 %水合氯醛深麻醉下处 死。取小鼠左侧缺血脑组织剪碎成1-2 _见方小块，置冰浴匀浆器中研磨至单细胞悬液，匀 衆液分装至1.5 mL离心管中，9500 rpm离心10 min，4 °C，上清液再以12000 rpm离心30 min，4 °C。上清液500 yL分装，标记，-70 °C保存。参考文献方法(Yamamoto K，Yamazaki A， Takeuchi M，et al. A versatile method of identifying specific binding proteins on affinity resins Anal Biochem，2006;352:15-23)(原理参见图I)，取脑组织蛋白0.5-I mL (约含总蛋白5 mg)，用Bead buffer稀释至I mL，加入EAS6B-羟基红花黄色素 A 60 μ L，4 °C缓慢搅动4 h，瞬时离心，将上清液转移至另一离心管，再另加入EAS6B-羟基红花黄 色素 A 60 yL，同上操作。将两次孵育的EAS6B-羟基红花黄色素 A用Bead buffer洗涤两次， 并加入6XLoading Buffer，沸水中煮7 min，8000 rpm瞬时离心，分别得到上清液A，B用于 10 % SDS-PAGE电泳。电泳结果用硝酸银染色显示(见图2)。
[0015] 实施例3以羟基红花黄色素 A对大脑中动脉栓塞小鼠 MCAO小鼠的影响，评价羟基红 花黄色素 A对To 11样受体4的抑制作用。
[0016] 脑梗死体积测定：将上述经过实施例1处理后的假手术组和给药组小鼠使用10 % 水合氯醛深麻醉下处死。所有小鼠脑迅速处理干净，并切片厚度为2_ /块。新鲜切片在质 量分数为2 %的2,3,5-triphenyl-tetrazolium溶液磷酸盐缓冲盐水(PBS)37 °C下孵育20 min。大脑正常区域可以染色上TTC红色溶液，而梗死区域无法进行染色。染色切片用佳能 SX20高分辨率数码相机拍摄，利用计算机图像分析系统(Motic Med 6系统)计算梗死体积。
[0017] 神经行为学评分打分:参照18分神经行为学评分标准进行评分，对上述经过实施 例1处理后的假手术组和给药组小鼠进行神经行为学评分。评分为各动物六项测试之和。最 低神经病学评分为3,最大值为18,分数越低，表明动物的行为缺陷越严重。
[0018] 结果由表1可见，羟基红花黄色素 A 1、2、4 mg/kg能抑制MCAO小鼠脑缺血再灌注损 伤。与MCAO模型组相比，在再灌注结束24小时后，进行神经行为学评分，假手术组小鼠无明 显的神经行为学变化，而MCAO模型组小鼠出现严重神经行为学缺陷，表现为单侧肌力欠缺， 行动障碍等特征(表1)。在分别给予羟基红花黄色素 A 1、2、4 mg/kg作用后，可改善缺血再 灌注小鼠的神经行为学评分。羟基红花黄色素 A 1、2、4 mg/kg作用存在显著或极显著性差 异，高剂量组作用存在剂量依赖关系。各组小鼠于线栓法小鼠 MCAO脑缺血再灌注模型的再 灌注操作结束24 h后断头取缺血脑组织，进行TTC染色，测量脑梗死体积。基红花黄色素 A可 显著改善脑缺血再灌注损伤小鼠的脑梗死体积，I、2、4 mg/kg羟基红花黄色素 A相能明显改 善脑组织中脑梗死体积(表1)。 勤对玆写澴汪小1奸1 为荦谇^黠療哭.沐毅纪_竣（ ... ^ .;:?:?? s：
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[0020] 脑皮层血流量测定:采用多普勒激光血流检测仪测定小鼠脑血流量，血流由激光 多普勒血流仪监测，MCAO模型造模成功后显示血流检测降低到20 %以下。小鼠俯卧，插入线 栓后将头皮消毒后，直接暴露皮质，将激光多普勒血流仪扫描头定位于皮质上20 cm处。颜 色标记的不同图像代表了血流的程度，在缺血1小时再灌注24小时时间点出监测血流量。
[0021] 由多普勒血流仪监测的血流量表明脑缺血1小时后脑皮层血流量降至15 %以下 (脑皮层血流量:99.52 ± 0.66，占基础血流量百分比：14.51 ± 0.47 %)，线栓法小鼠 MCAO脑 缺血再灌注模型的再灌注操作结束24 h后脑皮层血流值达到假手术组的80 %左右（图3及 表2)。当给予1、2、4 mg/kg羟基红花黄色素 A后，脑皮层血流值分别上升至84 %以上（图3及 表2)，其中2 mg/kg组增加脑皮层血流量作用最为明显。 表s对锫狭窈注1、紱結痠麗逸流1的彩竣办外）、.
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[0023] 蛋白印迹表达(Western blot):切取皮层边缘组织，提取总蛋白，BCA定量蛋白浓 度为40 yg上样。采用12 %的SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，孵育抗体anti-cleaved-caspase-3， anti-p65，anti-p-p65( 1:1000稀释比例）4 °C过夜，然后用辣根过氧化物酶抗体孵育50 min。并使用生物图像分析系统捕获(Bio-Rad公司）。
[0024] Western blot结果如表3所示，MCAO造模后，小鼠脑组织中cleaved-caspase-3、 NF-κΒ p65磷酸化的表达明显升高，表明MCAO造模后可促进细胞凋亡及NF-κΒ信号通路的活 化。各给药组与模型组相比均可显著降低〇163￥6(1-〇38。386-3、即-1<：13口65磷酸化的表达。其 中人参阜苷Rbl相比于其他给药组改善脑组织中细胞凋亡蛋白cleaved-caspase-3最为明 显，羟基红花黄色素 A对NF-κΒ信号通路的活化抑制最为明显。
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[0026] 炎症因子和一氧化氮含量测定:ELISA方法测定TNF-a、IL_li3和NO水平，采用化学 比色法检测N0。
[0027] 各组小鼠于缺血I h再灌注24 h后断头处死取脑，检测各组小鼠的脑组织中，IL-I 0，丁陬-€[，一氧化氮从)含量(？<〇.〇1，表4)。 ·~P5RmNOtt^fi^ ;^ν^> η-6) -^〇.〇?. ^(6.05,
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【主权项】
1. 一种Tol 1样受体4抑制剂，其特征在于，为羟基红花黄色素 A。2. 如权利要求1所述Tol 1样受体4抑制剂，其特征在于，所述羟基红花黄色素 A使用量为 每千克体重使用l_4mg。3. 如权利要求1所述Tol 1样受体4抑制剂，其特征在于，所述羟基红花黄色素 A使用量为 每千克体重使用2mg。
【专利摘要】本发明公开了一种Toll样受体4抑制剂，为羟基红花黄色素A。本发明利用系列亲和色谱法发现了羟基红花黄色素A在小鼠脑缺血脑组织中的特异性结合的蛋白。并通过质谱鉴定和蛋白免疫印迹技术鉴定该蛋白为TLR4。在此基础上采用大脑中动脉栓塞模型middle？cerebral？artery？occlusion，MCAO模型实验，考察了羟基红花黄色素A的抑制脑缺血再灌注作用。实验结果表明，羟基红花黄色素A具有降低脑梗死体积、改善神经行为学评分、抑制炎症信号通路的作用。
【IPC分类】A61K31/351, A61P9/10, A61P29/00, A61P25/00
【公开号】CN105520929
【申请号】CN201510988357
【发明人】吕燕妮, 张洁, 付龙生, 欧阳爱军, 魏筱华, 温金华
【申请人】南昌大学第一附属医院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月25日