Sfrp2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞技术领域，具体涉及WNT信号调节因子SFRP2促进牙源性间充质 干细胞成骨/成牙定向分化中的应用。
【背景技术】
[0002] 牙齿缺失修复和牙周组织再生一直是口腔科学的研究重点之一。间充质干细胞在 牙齿发育及组织再生过程中起着重要的作用，牙齿发育异常包括数目、形态、结构异常，这 些都与牙齿发育过程中的基因表达及功能异常相关，从而引起发育过程中细胞特别是干细 胞增殖分化的功能变化导致疾病的发生。近年来，间充质干细胞和组织工程技术的研究进 展给牙齿或牙周组织再生带来了希望。间充质干细胞，具有多向分化潜能和自由更新的能 力，可以分化成相应的组织。尽管间充质干细胞介导的牙及支持组织再生取得了一些研究 成果，但目前还存在一些关键问题亟待解决，其中之一是再生的种子细胞-牙源性干细胞来 源有限，牙源性干细胞定向分化及增殖的分子调控机制仍未完全明确。干细胞可以进行异 体移植用于治疗，但由于供者年龄和其他一些因素的影响，有些干细胞过于衰老，治疗效果 欠佳，并且由于成人干细胞生命周期短暂导致其长期治疗效果较差。如果对干细胞进行遗 传改建，使其重编程，激活或抑制调节衰老过程的基因，使干细胞重新年轻，从而给与他们 新的生命;或者提高干细胞的定性分化能力及延长其生命周期后再用于治疗，从而提高干 细胞的治疗效果。尽管很多研究表明间充质干细胞异体移植后具有免疫抑制作用，但都缺 乏长期的追踪报道。长期的异体移植有可能存在的排异反应、伦理及其他一些因素的影响， 使病人难以接受。用病人自己的干细胞在体外进行培养的过程中，进行遗传改建，使其干细 胞恢复正常的功能，特别是对于某些遗传病的病人，揭示其疾病的致病机理，一方面有助于 疾病的早期诊断、预防及治疗；另一方面可以针对性地对他们的干细胞采取激活异常沉寂 的基因或者沉寂异常激活的基因，从而使改建以后的，具有多潜能的干细胞用于自体移植 具有广阔的临床应用价值。
[0003] SFRP2是一个可溶性的WNT信号调节因子SFRPs基因家族的一员。SFRPs基因家族定 位于染色体8p 12~11.1，包括5个成员：SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4和SFRP5，属于分泌型 frizzled相关蛋白，作为可溶性的Wnt信号调节因子，通过与Wnt信号通路同源的受体竞争 结合而抑制Wnt信号通路，从而在生物发育、细胞转运、肿瘤形成及细胞凋亡等生命过程中 发挥重要的作用。此外SFRP2还可以抑制RANKL的活性从而抑制破骨细胞活性，并与Tolloid 金属蛋白酶结合来调节胶原形成，或者与integrin和fibronectin复合体相互作用调控细 胞凋亡。目前研究表明SFRP2是间充质干细胞本身分泌的一个重要因子，在间充质干细胞的 自我更新过程中起着重要调节作用，并且可以增强骨髓间充质干细胞心肌修复效果。但 SFRP2对间充质干细胞定向分化的影响及机制尚不清楚，需要进行深入研究。
[0004] 通过SFRP2对间充质干细胞功能影响的研究，可以为研究间充质干细胞的程序性 再激活及功能改建进行理论准备，在此基础上希望能发现相应的药物或生物制剂控制干 细胞的状态来达到临床应用和治疗的目的，解决患者的痛苦，恢复患者的身心健康，并将产 生较好的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种WNT信号调节因子SFRP2调控间充 质干细胞定向分化的应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。
[0006] 本发明提供了 SFRP2在促进牙源性间充质干细胞成骨/成牙分化中的应用。
[0007] 本发明还提供了 SFRP2作为制备促进牙源性间充质干细胞介导组织再生药物的应 用。
[0008] 本发明所述的药物按照加工需要可以制备成任何医药上可接受的剂型，其配置通 常由本领域技术人员公知的加工方法制备，即将活性组分与液体溶剂或者固体载体混合， 在添加至少一种表面活性剂制备而成，其中较优选为片剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊 剂。
[0009] 本发明所述的药物在使用前可由使用者经稀释或直接使用。
[0010] 本发明的有益效果为通过对WNT信号调节因子SFRP2调控间充质干细胞定向分化 的机制进行的研究，发现其有促进干细胞牙向-骨向分化的左右，并对其可能的机制进行阐 述，从而为研究牙齿和骨骼生长发育时空特异性的分子调控机制及生物性全牙再生的种子 细胞的改建提供重要线索。
【附图说明】
[0011] 图1是早期成骨分化碱性磷酸酶指标;a为碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指 标-碱性磷酸酶;b为测茜素红染色检测晚期成骨指标-细胞矿化能力；c为测定钙离子浓度 来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力;d~i为0(1、3(1、7(1、10(1、14(1周的不同时间点收获细胞；
[0012] 图2是过表达SFRP2促进SCAPs成骨/成牙本质分化能力；
[0013] 图3是基因敲除SFRP2抑制SCAPs成骨/成牙本质分化能力；
[0014] 图4是SFRP2敲除的根尖牙乳头干细胞变化；
[0015] 图5是碱性磷酸酶检测及茜素红染色的方法观察到SCAPs的成骨分化能力;a为碱 性磷酸酶检测;b为茜素红染色。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 以下实验方法在未进行特殊说明的情况下均为本领域常规技术手段。
[0017] 干细胞的分离、培养与鉴定：
[0018] 人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签 订知情同意书。获取了人恒牙牙周组织和恒牙炎性牙周组织，牙髓组织，或者正畸需要拔除 的年轻恒牙(正畸减数拔牙或年轻智齿)根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和 培养H)LSCs，DPSCs，SCAPs，简述如下:将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷roS的离心管， 移送进细胞室，在24h内分离培养牙周膜干细胞、牙髓细胞、根尖牙乳头细胞。轻轻剥离牙齿 周围的牙周组织，取中段的牙周组织，磨开牙髓腔、取出牙髓，或直接切取根尖牙乳头部位 组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含I型胶原酶(3g/L)和Dispa Se(4g/L)的消化液，37°C下消 化1小时，过70wii细胞筛收集细胞，lOOOrpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将 细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在a-MEM培养基（含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、 100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中37°C、5%C02培养，每2~3天换液1次。每天在倒置显 微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80 %汇合状态时，用0.25 %胰蛋白酶按1:2消化传 代。通过检测间充质干细胞的表面标志物⑶44、CD90、⑶146、STR0-1和干细胞的多向分化能 力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。
[0019] 构建病毒质粒:应用Whitehead研究所的程序设计SFRP2的SiRNA，插入慢病毒载体 上构建成SFRP2shRNA的质粒。
[0020] 病毒包装及收集:慢病毒质粒及相应的包装质粒(VSVG和dv-8.2)转染293T细胞， 转染后48小时，收取上清，进行病毒滴度鉴定，分装后保存。
[0021 ]稳定转染细胞系的建立：慢病毒转染S CAP s干细胞，转染后4 8小时，用药物 puromycin筛选3天，筛选得到Scramsh、SFRP2sh及SFRP2、SFRP2Vector的稳定转染细胞系。
[0022] 实施例1干细胞成骨/成牙分化生物学性能影响的体外研究
[0023] 通过检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶，晚期成骨指标-钙结节形成及在mRNA水 平检测分化指标(RUNX2、C0L1、OPN、BSP、0CN等)观察在干细胞在体外向成骨/成牙本质方向 分化的能力。
[0024]取过表达SFRP2的根尖牙乳头干细胞及对照组以2X103/cm2的浓度接种于6孔板 中，待细胞生长至80 %融合后，用成骨诱导培养液将脐带干细胞在体外向成骨/成牙本质方 向分化诱导，每2天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。
[0025] 如图1(a)所示，3天后测定碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸 酶，如图l(b、c)所示，2周、3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。如图l(d~i)并在诱导0(1、3(1、7(1、10(1、14(1周的不同时间点收获细胞，在1111^八 水平检测成骨/成牙分化指标:BSP、0PN、C0L1A2、DSPP、DMP1、0SX。
[0026] 结果表明过表达SFRP2促进根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化。
[0027]具体实验方法：
[0028] 1、碱性磷酸酶活性测定：
[0029]配制缓冲液:裂解液
[0031] Stock substrate Sol. 1 胶囊5ml纯水（4°C储存）。
[0032] 操作步骤：
[0033] 1)用标准品制作标准曲线；
[0034] 2)去培养基，PBS洗2次；
[0035] 3)加 300yl 裂解液，37°C摇床，15min;
[0036] 4)将细胞轻轻刮下，移至1.5ml EP管，4°C离心5min;
[0037] 5)取上清，移至另一 EP管；
[0038] 6)取胶囊，加入5ml纯水溶解（Stock substrate Sol ?);
[0039] 7)取50yl ALP缓冲液加入50yl Stock substrate Sol.，充分混匀；
[0040] 8)置于96孔板中，加入lOOyl⑵液，10yl上清液，37°C孵育15min;
[0041 ] 9)加入 110yl 0.5N NaOH终止反应；
[0042] 10)酶标仪上读取405n