组织血管，标号3的区域为正常肝组织细胞。其中空白对照组，中间标号2的深色部分为浸润的炎症细胞，主要以淋巴细胞和中性粒细胞为主，局部肝组织窦隙可见少量散在淋巴细胞浸润。丙酮酸钠组未观察到明显的炎性细胞浸润。表明将丙酮酸钠在储存过程中处理过的红细胞回输至小鼠体内后，能够有效降低肝组织炎性反应，减轻病理损伤。
[0086]SP组1#、2#和4#与5?组3#结果无异，不再赘述，SP组5#和6#的病理切片中，出现浸润的炎症细胞，肝组织窦隙可见少量散在淋巴细胞浸润，其组织损伤程度明显大于3#的损伤程度。
[0087]实施例11、储存红细胞回输体内后溶血率的测定
[0088]使用游离血红蛋白测定试剂盒中说明书方法(试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，货号A071)测定实施例1得到的储存14天后的七组储存红细胞血浆中游离血红蛋白浓度。以SP组3#为例，将实施例1得到的储存14天后的SP组3#和空白对照组中储存红细胞分别回输至小鼠体内后，用全自动血细胞计数仪(血常规)，吸取约50yL小鼠全血测定血液总血红蛋白浓度和红细胞压积(Hct)。
[0089]根据公式:溶血率=(游离血红蛋白浓度X (1-Hct))/总血红蛋白浓度X 100%，得到SP组3#和空白对照组的溶血率，结果如图10所示。
[0090]图1O结果显示，空白对照组储存红细胞溶血率为0.79 ± 0.03 %，SP组3#储存红细胞溶血率为0.77 ±0.04%。与空白对照组比较，SP组3#储存红细胞的溶血率有降低趋势，但是两组无显著性差异(*表示p>0.05)。说明丙酮酸钠可降低储存红细胞的溶血率，但与对照组比较未见显著性差异。符合美国食品与药品管理局(FDA)的规定:人类红细胞储存上限为42天，并且用于回输的储存红细胞满足溶血率<1%。
[0091]美国FDA对储存红细胞的输注标准为:经过体外储存后溶血率小于I%，输注24h后红细胞的存活率(即存在于受者的循环系统中)要不低于75%，只有达到以上标准的红细胞才能用于回输。
[0092]SP组1#_6#与5?组3#结果无异，不再赘述。
[0093]实施例12、储存红细胞回输体内后，测定不同终浓度的丙酮酸钠对24小时回输存活率的影响
[0094]使用异硫氰酸荧光素(FITC)(购自美国Sigma公司，货号F-7250)荧光标记的方法，测定实施例1得到的储存14天后的SP组1#、3#、5#、6#和空白对照组中储存红细胞回输到健康小鼠体内24h后，储存红细胞在体循环中的存活率，结果如图11所示。
[0095]异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的方法具体为:
[0096]①避光条件下，准确称取10mg FITC，溶解于1mL的PBS(pH = 7.4)，得到浓度为10mg/mL 的 FITC 溶液。
[0097]②标记储存红细胞:将储存红细胞小心摇匀，取红细胞I管(约600yL)红细胞到5mL离心管，加2.4mL的PBS，轻轻混匀。然后向其中加入步骤①配好的FITC溶液20yL，混匀，37 V避光孵育20min。
[0098]③离心、洗涤:在400g下离心5min，弃上清;再加2.4mL的I3BS洗涤、离心；重复3次，洗去溶液中多余的FITC。
[0099]④离心后，取管底标记的红细胞S卩FITC-红细胞，通过尾静脉注射，将300yL FITC-红细胞输注到小鼠体内，并计时。分别在10min，24h，经眶后静脉丛取血，每次取5yL，将其加到肝素化的小离心管中。
[0100]⑤用流式细胞仪计数5万个细胞，区分荧光标记细胞，使用CellQuestPro分析荧光标记细胞比例。使用前，用SpheroTM彩虹荧光颗粒对流式细胞仪进行校准，保证每次实验的设定一致。以1min的数值作为基点，后面时间点的被标记率与1min标记率的比值作为此时间点的红细胞存活率值，绘制存活率与时间折线图(具体方法参见Hod，E.A.,Zhang,N.，Sokol,S.A.,WojczykjB.S.,Francis,R.0.,Ansaldi，D.,Francis,K.P.,Della-LattajP.,Whittier ,S.,Sheth,S.，Hendrickson，J.E.,Zimring,J.C.，Brittenham，G.M.&Spitalnik,S.L.(2010)Transfus1n of red blood cells after prolonged storageproduces harmful effects that are mediated by iron and inflammat1n.Blood,115,4284-4292.)o
[0101]比较储存红细胞24h后的回输存活率，测定结果如图11所示。
[0102]图11结果显示，空白对照组储存红细胞的回输存活率为75.63±1.8%，lmM SP组储存红细胞回输存活率为75.74 ± 5.4%，2mM SP组储存红细胞回输存活率为77.86 土
0.4%,,5mM SP组储存红细胞回输存活率为73.41 ±1.5%，1mM SP组储存红细胞回输存活率为71.23±2.0%，两两比较，2mM SP组储存红细胞的回输存活率为储存红细胞的最优浓度。浓度大于5mM时，随浓度的升高，丙酮酸钠对储存红细胞的保护作用反而降低，并且在实验中，观察到采用1mM丙酮酸钠储存的红细胞进行回输，动物精神状态差，活跃度降低，并且动物死亡率为50%，说明储存液中丙酮酸钠浓度过高会引起明显的副作用。
[0103]以上实验证明丙酮酸钠具有双重功能，既为红细胞在储存过程中提供能量代谢底物，又起到了抗氧化的作用，同时添加丙酮酸钠的储存红细胞回输机体后可减轻储存红细胞回输造成的组织损伤，本实验通过与不加丙酮酸钠对照，得出加入丙酮酸钠可以改善储存红细胞质量并减轻回输后的组织损伤。
[0104]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.丙酮酸钠在制备改善储存红细胞质量和/或改善输注后组织损伤的储存液中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丙酮酸钠为医药级丙酮酸钠。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述储存液的活性成分为丙酮酸钠。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，丙酮酸钠在储存红细胞中的终浓度为1-1OmM,优选的终浓度为 1-2.49mM、l-2mM、2-2.49mM、1-1.5mM、1.5_2mM或1.5-2.49mM。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述储存液的活性成分为丙酮酸钠溶液，该溶液是由丙酮酸钠和生理盐水配制而成，或由丙酮酸钠和血液保存液配制而成;所述血液保存液可以选自CPDA-1溶液、SAGM溶液等中的一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，丙酮酸钠在所述溶液中的质量百分含量为3.575-35.75% ,优选3.575-8.90%。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述CPDA-1溶液包含枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖、腺嘌呤，每100mLCPDA-1溶液中含有26.3g枸橼酸钠、3.27g枸橼酸、31.9g葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2.22g磷酸二氢钠和其余的灭菌水。8.根据权利要求3至8任一所述的应用，其特征在于，所述储存液与红细胞混合后再储存。9.一种红细胞储存液，该红细胞储存液与红细胞混合后再储存，其特征在于，包含丙酮酸钠和血液保存液，丙酮酸钠在红细胞储存过程中的终浓度为Ι-lOmM，优选的终浓度为1-2.49mM、l-2mM、2-2.49mM、1-1.5mM、I.5_2mM或1.5-2.49mM;所述血液保存液优选CPDA-1溶液、SAGM溶液等中的一种。10.根据权利要求9所述的红细胞储存液，其特征在于，其中丙酮酸钠为溶液，该溶液是由丙酮酸钠和生理盐水配制而成，或由丙酮酸钠和血液保存液配制而成。
【专利摘要】本发明公开了丙酮酸钠的一种新用途，即在制备改善储存红细胞质量和/或输注后组织损伤的储存液中的应用。将丙酮酸钠作为活性成分制备成改善储存红细胞质量和/或输注后组织损伤的储存液，可缓解改善储存红细胞质量和/或输注后组织损伤，疗效显著，而且没有副作用，安全性好，在研究和开发此类储存液中发挥重要作用，应用前景广阔，社会意义巨大。
【IPC分类】A61K35/18, A61P7/08, A61K47/12
【公开号】CN105664169
【申请号】CN201610032429
【发明人】周虹, 赵莲, 陈赣, 王瑛, 尹玉静, 夏厦
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月18日