一种二甲双胍与熊果酸及其衍生物的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用
【专利摘要】本发明提供一种具有协同抗肿瘤转移或抗肿瘤作用的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物的应用，该药物组合物的特征在于包含如式I所示的化合物和二甲双胍I；其中式I中的R为羟基或者乙酰氧基；其中式I所示的化合物与二甲双胍的物质的量比为10-20:500-20000。该药物组合物，即含有熊果酸及其衍生物和二甲双胍的联合使用对癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。
【专利说明】
一种二甲双胍与熊果酸及其衍生物的药物组合物及其在制备 抗肿瘤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种二甲双胍与熊果酸及其衍生物的组合物及其在制备抗肿瘤药物 中的应用，属于抗肿瘤药物组合物领域。
【背景技术】
[0002] 癌症(恶性肿瘤)是指由于调控细胞增殖机制的失常而引发的疾病。癌症严重威胁 人类健康，是当今人类中最严重的疾病之一。癌症的患病风险逐年增加，在中国每年超过 160万人被诊断为癌症，120万人死于癌症。癌症已成为我国居民健康的主要慢性病之一，列 城市死因的第一位，农村死因的第二位。
[0003] 联合用药(Drug combination)是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上 药物同时或先后应用。联合用药往往会发生体内或体外药物的相互影响。对于某些药物组 合，联合治疗还允许产生最佳组合剂量来使副作用最小化;两种化合物的联合治疗可揭示 未预料到的协同作用和引发非由单一化合物诱导的效应。
[0004] 熊果酸即3β_羟基-熊果-12-稀_28_酸（30-hydroxy-urs-12-en-28-〇ic acid，简 称UA)，又名乌索酸、属于a-香树脂醇(a-amyrin)型五环三萜类化合物，结构如式II所示，其 相对分子量为456.68，分子式为C3〇H48〇3，是自然界中分布较广的天然活性化合物，主要以游 离或糖苷的形式存在其广泛分布于枇杷叶、熊果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中，也 是许多传统中药的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、 抗氧化等其中以抗癌活性最为显著，不仅对多种致癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞 在体内、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。近年来国内 外对UA的抗肿瘤研究日趋深入，并发现其在肿瘤预防、治疗以及防止晚期复发转移等方面 有着独特的优势及潜在的应用前景。熊果酸及其衍生物的抗癌谱广，专利N201510466210.4 首次公开了熊果酸衍生物ASP-UA对乳腺癌细胞的粘附、迀移、侵袭等具有显著的抑制作用。 专利N201410189256.1首次公开了熊果酸衍生物US597能有效减少小鼠B16-F10黑色素瘤 的实验性肺转移，但目前将抗熊果酸及其衍生物和二甲双胍联合给药用于抗癌转移尚未见 报道。
[0005] UAl，结构如式m所示，该化合物可明显改善UA的溶解度，理化性质更加稳定;此外 跟UA对比，其对不同种类肿瘤细胞均具有更显著的增殖抑制作用，且对正常细胞毒性较低， 提示其具有安全、高效和低毒的特点，可望将其应用于肿瘤的早期预防和治疗中。
[0006] 二甲双胍(Metformin，简称Met)，其相对分子量为129.10，分子式为C4HnN5，被认 为是胰岛素增敏剂之一，结果如式IV所示。二甲双胍作为治疗2型糖尿病经典而有效的药 物，已有近50年的临床应用历史，还用于治疗多囊卵巢综合症、假性黑棘病等。二甲双胍为 强水溶性性药物，口服后主要在小肠吸收，生物利用度为50-60%左右。目前二甲双胍在各国 的糖尿病治疗指南中均被推荐为首选用药，且无禁忌症，它的作用机理不同于其他类型的 口服抗血糖药，它可减少肝糖的产生，降低小肠对糖的吸收，并且还可增加外周糖的摄取和 利用，从而提高胰岛素的敏感性，它在糖尿病治疗中的威望也与日倶增，成为全球抗击糖尿 病的核心药物。专利N201310069025.2首先公开了一种二甲双胍的新用途，证明了二甲双胍 能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖。专利N201080048060.0也公开了二甲双胍在癌症治疗和 预防中的用途。
[0007]
本发明以SCL-l、MCF-7、HepG2及A549细胞作为研究对象，通过熊果酸及其衍生物和二 甲双胍进行联合用药，对SCL-I、MCF-7、HepG2及A549细胞进行体外抗癌活性测试，结果表 明，熊果酸及其衍生物和二甲双胍的联合使用对癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是提供一种二甲双胍与熊果酸及其衍生物的组合物及其在制备 抗肿瘤药物中的应用，通过将具有强水溶性的二甲双胍与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果 酸及其衍生物进行联合用药，考察其联合增效作用，可望获得较为安全可靠新型防治癌症 的候选药物。
[0009] -种具有抗肿瘤作用的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于 包含如式I所示的化合物和二甲双胍
其中式I中的R为羟基或者乙酰氧基； 其中式I所示的化合物与二甲双胍的物质的量比为10-20:500-20000。
【附图说明】
[001 0]图1.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对SCL-I细胞增殖的抑制结果； 图2.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用48 h后对SCL-I细胞增殖的抑制结果； 图3.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用72 h后对SCL-I细胞增殖的抑制结果； 图4.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对MCF-7细胞增殖的抑制结果； 图5.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用48 h后对MCF-7细胞增殖的抑制结果； 图6.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用72 h后对MCF-7细胞增殖的抑制结果； 图7.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对HepG2细胞增殖的抑制结果； 图8.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用48 h后对HepG2细胞增殖的抑制结果； 图9.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用72 h后对HepG2细胞增殖的抑制结果； 图10.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对A549细胞增殖的抑制结果； 图11.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用48 h后对A549细胞增殖的抑制结果； 图12.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用72 h后对A549细胞增殖的抑制结果； 图13.UAl和Met单独使用及联合使用24 h后对SCL-I细胞增殖的抑制结果； 图14.UAl和Met单独使用及联合使用24 h后对MCF-7细胞增殖的抑制结果； 图15.UAl和Met单独使用及联合使用24 h后对HepG2细胞增殖的抑制结果； 图16. UAl和Met单独使用及联合使用24 h后对A549细胞增殖的抑制结果。
【具体实施方式】
[0011]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0012] 实施例1 UAl的合成 ① 250 mL圆底烧瓶，加入二氯甲烷20 ml，吡啶20 ml，熊果酸I g，醋酸酐3.5 mL。加少 量DMP，室温磁力搅拌过夜； ② 向①瓶中补充加入100 ml二氯甲烷，分别用100 mL I N HCl溶液萃取②得到的有 机层2次，收集有机层； ③ 与②步骤相同，分别用饱和NaHCO3溶液萃取②得到的有机层2次，每次用量100 mL， 最后分出有机层； ④ 向③中得到的有机层中加入无水硫酸钠充分搅拌干燥(约4勺），过滤； ⑤ 旋转蒸发仪蒸除溶剂，得粗品； ⑥ 柱层析纯化得纯白色UAl; 实施例2 熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对SCL-1细胞增殖抑制作用：采用标准MTT 比色法测定了熊果酸和二甲双胍不同联合比例对SCL-I细胞株的增殖抑制活性。
[0013]具体步骤为:将对数期的SCL-I细胞，用胰酶消化后，细胞计数，配成8X104/ml的 细胞浓度，将制得的细胞悬液，每孔100 μL接种到96孔板，放于37°C、5% CO2培养箱中培养 24 h，弃掉旧的培养基，加入配制好的含不同药物浓度的培养基继续培养24、48、和72 h，吸 弃含药培养基，于每孔中加入100 μL稀释好的MTT溶液(0.5 mg/ml MTT的母液:无血清无酚 红培养基=1:9)，继续孵育4 h后，终止培养;小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100 yL DSMO，振荡10 min，于570 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(0D值），计算细胞成活 率(％)=(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值）X 100%。用GraphPad Prism软件进行数据 处理，结果见下图1-3。
[0014] 如图1所示，当药物作用24 h之后，熊果酸10 μΜ抑制SCL-I细胞增殖的效果不明 显;二甲双胍在20 mM的条件下细胞存活率大约在80%;两者联合给药作用24 h当Met彡5 mM 时就能表现出很明显的抑制SCL-I细胞的增殖，此时可以起到协同抗肿瘤的作用；如图2所 示，当药物作用48 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下能够明显的抑制SCL-I细胞的增殖;二甲 双胍在多20 mM的时候，才能抑制SCL-I细胞的增殖;两者联合给药作用48 h当Met多I mM的 条件下就能够明显的抑制细胞的增殖;如图3所示，当药物作用72 h之后，熊果酸在10 μΜ的 条件下细胞死伤达一半;二甲双胍在低浓度的条件下禮，还是不能明显的抑制SCL-I细 胞的增长;两者联合给药作用72 h之后二甲双胍在0.5 mM的条件下就能够明显的抑制细胞 的增殖，且随着浓度的增大，抑制细胞的增殖越明显。综上结果可以发现，两者联合给药能 够明显降低Met的给药剂量，可以协同增效的抑制SCL-I细胞的增殖，且呈浓度依赖性和时 间依赖性。
[0015] 实施例3 采用金氏修正式计算熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h 对SCL-I细胞的协同作用，筛选出最佳的药物配比，结果如表1-3所示。计算出UA=IO μΜ的条 件下对SCL-I细胞的抑制率为ΕΑ，计算出不同二甲双胍浓度对SCL-I细胞的抑制率为EBl、 ΕΒ2、ΕΒ3等，再计算出两者联合给药在不同配比下对SCL-I细胞的抑制率分别为ECl、EC2、 EC3等，通过以下公式计算联合用药指数q值，q=EC/(EB+EA_EB*EA)，当q值>1.15为协同效 应，0.85〈q〈l. 15为相加效应，q〈0.85为诘抗效应。通过上述联合用药指数的计算进一步判 断两种药物联合用药的最终药效。
[0016] 如表1-3所示，熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h对 SCL-I细胞，当二甲双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应;当二甲双胍在高浓 度的条件下两者联药效基本为协同效应，可以协同的抑制SCL-I细胞的增殖，药物浓度越 大，抑制越明显。
[0017] 实施例4 熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对MCF-7细胞增殖抑制作用，方法如实施例 2,结果如图4-6所示。
[0018] 如图4所示，当药物作用24 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下，它抑制MCF-7细胞增 殖的效果不明显；二甲双胍多20 mM的条件下，才能有效的抑制MCF-7细胞的增殖;两者联合 给药作用24 h当Met多5 mM时就能表现出明显的抑制MCF-7细胞的增殖，此时可以起到协同 抗肿瘤的作用;如图5所示，当药物作用48 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下能明显的抑制细 胞的增殖;单用二甲双胍在多10 mM的条件下能有抑制MCF-7细胞的增殖，当熊果酸和二甲 双胍联合给药，二甲双胍多I mM的条件下就能有效的抑制细胞的增殖;如图6所示，当药物 作用72 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件SCL-I细胞死伤达一半;两者联合给药作用72 h之后 二甲双胍的浓度多0.5 mM的条件就能够明显的抑制细胞的增殖。综上结果可以发现，两者 联合给药能够明显降低Met的给药剂量，两者联合用药能够明显的起到协调抗肿瘤的作用， 随着Met浓度的增大，抑制MCF-7细胞的增殖越明显。
[0019] 实施例5 采用金氏修正式计算熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h 对MCF-7细胞的协同作用，方法同实施例3，结果如表4-6所示。
如表5-6所示，熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h对MCF-7细 胞，当二甲双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应；当二甲双胍在高浓度的条 件下两者联药效基本为协同效应，可以协同的抑制MCF-7细胞的增殖，药物浓度越大，抑制 越明显。
[0021] 实施例6 熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对HepG2细胞增殖抑制作用，方法如实施例 2,结果如图7-9所示。
[0022]如图7所示，当药物作用24 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下，它抑制HepG2细胞增 殖的效果不明显；二甲双胍多20 mM的条件下，才能有效的抑制HepG2细胞的增殖;两者联合 给药作用24 h当Met多5 mM时就能表现出明显的抑制HepG2细胞的增殖，此时可以起到协同 抗肿瘤的作用;如图8所示，当药物作用48 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下能明显的抑制细 胞的增殖;熊果酸和二甲双胍联合给药，当二甲双胍在》ImM的时候，抑制HepG2细胞的增殖 比单用二甲双胍来的明显；如图9所示，当药物作用72 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件HepG2 细胞死伤达一半;两者联合给药作用72 h之后二甲双胍的浓度多0.5 mM的条件就能够明显 的抑制细胞的增殖。综上结果可以发现，两者联合给药能够明显降低Met的给药剂量，两者 联合用药能够明显的起到协调抗肿瘤的作用，随着Met浓度的增大，抑制HepG2细胞的增殖 越明显。
[0023] 实施例7 采用金氏修正式计算熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h 对!fepG2细胞的协同作用，方法同实施例3，结果如表7-9所示。
[0024] 如表7-9所示，熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h对 HepG2细胞当二甲双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应；当二甲双胍在高浓 度的条件下两者联药效基本为协同效应，可以协同的抑制HepG2细胞的增殖，药物浓度越 大，抑制越明显。
[0025] 实施例8 熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对A549细胞增殖抑制作用:采用标准MTT比 色法测定了熊果酸和二甲双胍不同联合比例对A549细胞株的增殖抑制活性。方法如实施例 2,结果如图10-12所示。
[0026] 如图10所示，当药物作用24 h之后，熊果酸10 μΜ抑制A549细胞增殖的效果不明 显;二甲双胍在20 mM的条件下细胞存活率大约在80%;两者联合给药作用24 h当Met彡5 mM 时就能表现出很明显的抑制A549细胞的增殖，此时可以起到协同抗肿瘤的作用；如图11所 示，当药物作用48 h之后，熊果酸在10 μΜ的条件下能够明显的抑制A549细胞的增殖;二甲 双胍在多20 mM的时候，才能抑制Α549细胞的增殖;两者联合给药作用48 h当Met多I mM的 条件下就能够明显的抑制细胞的增殖;如图12所示，当药物作用72 h之后，熊果酸在10 μΜ 的条件下细胞死伤达一半;二甲双胍在低浓度的条件下mM，还是不能明显的抑制SCL-I 细胞的增长;两者联合给药作用72 h之后二甲双胍在0.5 mM的条件下就能够明显的抑制细 胞的增殖，且随着浓度的增大，抑制细胞的增殖越明显。综上结果可以发现，两者联合给药 能够明显降低Met的给药剂量，可以协同增效的抑制A549细胞的增殖，且呈浓度依赖性和时 间依赖性。
[0027] 实施例9 采用金氏修正式计算熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h 的侦、同你田古、比同免偷仿1丨^姑里如丰1 阳士
[0028] 如表10-12所示，熊果酸和二甲双胍两者联合给药在不同配比下作用24、48、72 h 对A549细胞，当二甲双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应；当二甲双胍在高 浓度的条件下两者联药效基本为协同效应，可以协同的抑制A549细胞的增殖，药物浓度越 大，抑制越明显。
[0029] 实施例10 UAl和二甲双胍单独使用以及联合使用对SCL-1细胞的增殖抑制作用，，方法同实施例 2，结果如图13所不。
[0030] 如图13所示，UAl在10 μΜ的条件下抑制SCL-1细胞增殖的效果不明显;二甲双胍在 多20 mM的条件下，才能表现出抑制SCL-I细胞的增殖;两者联合给药作用24 h，当Met多5 mM时就能有效的抑制SCL-1细胞的增殖，且随着二甲双胍浓度的增大，抑制细胞的增殖越明 显。
[0031] 实施例11 采用金氏修正式计算UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对SCL-I细胞的协 同作用，方法同实施例3,结果如表13所示。
如表13所示，UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对SCL-I细胞当二甲双胍 在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应;当二甲双胍在高浓度的条件下两者联药效 基本为协同效应，可以协同的抑制SCL-I细胞的增殖，药物浓度越大，抑制越明显。
[0033] 实施例12 UAl和二甲双胍单独使用以及联合使用对MCF-7细胞的增殖抑制作用，方法同实施例2， 结果如图14所不。
[0034] 如图14所示，当药物作用24 h之后，UAl在10 μΜ的条件下抑制MCF-7细胞增殖的效 果不明显;二甲双胍在多20 mM的条件下，才能有效的抑制MCF-7细胞的增殖;两者联合给药 作用24 h当Met彡5 mM时就能有效的抑制MCF-7细胞的增殖。
[0035] 实施例13 采用金氏修正式计算UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对MCF-7细胞的协 同作用，筛选出最佳的药物配比，方法同实施例3,结果如表14所示。
[0036] 如表14所示，UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对MCF-7细胞当二甲 双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应；当二甲双胍在高浓度的条件下两者联 药效基本为协同效应，可以协同的抑制MCF-7细胞的增殖，药物浓度越大，抑制越明显。
[0037] 实施例14 UAl和二甲双胍单独使用以及联合使用对HepG2细胞的增殖抑制作用，方法同实施例2， 结果如图15所不。
[0038]如图15所示，当药物作用24 h之后，UAl在0 μΜ的条件下抑制HepG2细胞增殖的效 果不明显;二甲双胍在多20 mM的条件下，才能表现出明显的抑制HepG2细胞增殖;两者联合 给药作用24 h当Met彡5 mM时就能表现明显抑制H印G2细胞的增殖。
[0039] 实施例15 采用金氏修正式计算UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对HepG2细胞的协 同作用，筛选出最佳的药物配比，方法同实施例3,结果如表15所示。
[0040] 如表15所示，UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对HepG2细胞当二甲 双胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应；当二甲双胍在高浓度的条件下两者联 药效基本为协同效应，可以协同的抑制ifepG2细胞的增殖，药物浓度越大，抑制越明显。
[0041 ] 实施例16 UAl和二甲双胍单独使用以及联合使用对A549细胞的增殖抑制作用，，方法同实施例2， 结果如图16所示。
[0042] 如图16所示，UAl在10 μΜ的条件下抑制A549细胞增殖的效果不明显；二甲双胍在 ^20 mM的条件下，才能表现出抑制Α549细胞的增殖;两者联合给药作用24 h，当Met^：5 mM 时就能有效的抑制SCL-I细胞的增殖，且随着二甲双胍浓度的增大，抑制细胞的增殖越明 显。
[0043] 实施例17 采用金氏修正式计算UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对A549细胞的协 同作用，方法同实施例3,结果如表16所示。
[0044] 如表16所示，UAl和Met两者联合给药在不同配比下作用24 h对A549细胞当二甲双 胍在低浓度的条件下两者联药效基本为相加效应;当二甲双胍在高浓度的条件下两者联药 效基本为协同效应，可以协同的抑制A549细胞的增殖，药物浓度越大，抑制越明显。
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤作用的药物组合物，其特征在于包含如式I所示的化合物和二甲双 脈其中式I中的R为径基或者乙酷氧基； 其中式I所示的化合物与二甲双脈的物质的量比为10-20:500-20000。2. 如权利要求1所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K31/155GK105963304SQ201610518493
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】邵敬伟, 郑桂容, 江凯
【申请人】福州大学