富含异构体的共轭亚油酸组合物的制备方法

专利名称：：富含异构体的共轭亚油酸组合物的制备方法富含异构体的共轭亚油酸组合物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种组合物的生产方法。尤其是，本发明涉及包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体，并且一种异构体比另一种异构体含量丰富的组合物的生产方法。人们对于食品中的共轭长链多不饱和脂肪酸，如CLA，对于动物和人类的有益作用的认识由来已久。CLA是含18个碳原子的共轭二烯脂肪酸。由于CLA中有两个双键，因此可能存在几何异构现象并且CLA分子或半族可存在许多异构体形式。CLA中顺9，反11("c9tll")和反10，顺12("tl0cl2")异构体通常最丰富，并且己经鉴定出这两种异构体每一种均具有有益的药理作用。由于顺9，反11和反10，顺12异构体在化学合成的CLA混合物中的含量通常是大约等摩尔数的，因此，人们需要可将这两种异构体纯化或使混合物富含其中一种异构体的方法。特别是由于一种异构体的药理作用可会与另一种异构体明显不同，富含其中一种异构体的CLA混合物可有有利的药理作用。专利WO97/18320描述了高含量长链多不饱和脂肪酸物质的制备方法。该方法包括使用能够辨别不同几何异构体的酶。Nagao等人的文章(JAOCS，volume79,no3，(2002)，pages303to308)描述了通过皱褶念珠菌脂酶的选择性酯化作用分馏和富集CLA异构体。使用月桂醇以形成酯类。Haas等人的文章(Lipids,Volume34，no9，(1999)，pages979to987)描述了共轭亚油酸异构体的脂酶催化分馏。该方法是小规模进行的并且该文献得出的结论是酶催化的酯化作用比水解作用更切合实际。专利US20010025113描述了富含异构体的CLA组合物。在其中一个例子中，富含异构体的混合物可通过使来自共轭后产生的1:1异构体混合物的乙酯混合物结晶而获得。该方法需要在低于-57。C的非常低的温度下进行。专利US6420577公开了商业上制备CLA的方法。用结晶纯化CLA但不分离不同异构体。Berdeaux等人(JAOCS，Volume75，no12(1998)，pages1749-1755)和Kim等人(J.FoodSci.Nutr，Volume5，no2(2000)，pages86-92)的文章公开了包括碱-异构化亚油酸甲酯的甲基脂类的分离和纯化的亚油酸共轭异构体的制备方法。Kim等人(J.FoodSci.Nutr，Volume5，no1(2000)，pages10—14)公开了从红花油(SSO)中化学合成高纯度CLA的制备方法。专利WO2005/087017公开了富含CLA的顺10，反12异构体的组合物和富含CLA的反9,顺11异构体的组合物的合成方法。尽管CLA异构体混合物的生产方法是已知的，但使一种异构体的量增加至相对高的水平仍存在困难。例如，依赖于与另一种异构体相比，对一种异构体具有选择性的脂酶的方法需要使反应不完全进行，因此，这是产量和异构体富集程度的折衷。人们仍然需要富含一种异构体的CLA异构体混合物的制备方法，这种方法使一种异构体的产量和/或含量相对于另一种异构体的相对较高并且这种方法能以相对大的规模相对经济的条件下进行，例如，不需要非常低的温度(如低于-57°C)。CLA异构体的分离通常是以酯类形式的CLA异构体进行。这样做的理由被认为是由于酯类与游离酸的熔点差别较大。熔点上的较大差别使得酯类比游离酸易于通过结晶分离。事实上，文献中将相应游离酸的异构体的分离描述成几乎是不可能的(见，例如，专利US2001/0018453)。此外，Jain等人(J.Agric，FoodChem，Volume54(2006)，pages5590-55%)认为正是这些异构体的不可分离性限制了其商业应用。然而，分离酯类可需要额外的自游离酸形成酯类的歩骤，这一步骤可能是昂贵和费时的。因此，仍然特别需要富含一种异构体的CLA异构体混合物的能够克服上述问题的制备方法。本发明提供了包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物的制备方法，该方法包括-产生包含共轭亚油酸(CLA)的顺9,反11和反10，顺12异构体的混合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第一重量比X至少是1.3:1;和-使该混合物结晶以形成包含顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第二重量比是Y，其中Y大于X。已发现，本发明的方法使包含相对大量的顺9，反11或反10，顺12异构体，优选顺9，反ll异构体的组合物具有良好产率。令人吃惊的是，已经发现，尽管顺9，反11和反10，顺12异构体的熔点非常相近，包含CLA的顺9，反11和反10、顺12异构体的游离酸的混合物也可通过使混合物经过根据本发明的结晶步骤而分离。此外，人们吃惊地发现，通过调整结晶前这两种异构体的比例，可能可以在高于例如使相应酯类结晶的所需温度的温度上如分离游离酸一样通过结晶分离不同的异构体。优选地，结晶在溶剂存在条件下进行。适合的溶剂包括极性有机化合物。更优选的溶剂包含C3至C6酮、C1至C6醇、水或它们的混合物。最优选的溶剂是丙酮，可将丙酮单独使用或与一种或多种其他溶剂混合使用，比如与水混合使用，但在该混合物中丙酮是溶剂的主要组分(即其中丙酮的量按重量计是至少55%，更优选是至少70%，甚至更优选是至少90%)。结晶优选在实质上没有或完全没有尿素的条件下进行。例如，尿素的量优选低于溶剂重量的5%，按重量计更优选低于3%，如按重量计低于1%，如按重量计低于0.5%，按重量计低于0.1%甚至按重量计0%。构成本发明的方法的部分的结晶步骤在使用适量的溶剂下进行以影响选择性结晶。已经发现尤其优选使用溶剂与顺9，反11和反10，顺12异构体总量的重量比的范围从约20:1至约1:1，如从约10:1至约1:1，更优选从约9:1至约2:1，甚至更优选从约8:1至约2:1，如从约6:1至约5:2或从约5:1至约3:1。尤其优选使用约4:1的比例。这些水平的溶剂的作用使最有效的选择性结晶得以在约-15。C至约-35"C的温度范围内进行。当溶剂与顺9，反11和反10，顺12异构体总量的比例低于约1.5:1时，可以发现该方法的选择性大大下降。选择结晶步骤的条件以使顺9，反11和反10，顺12异构体得以有效地和选择性地分离。进行结晶的优选温度是低于O"C的温度，更优选是在-10至-4(TC的温度范围内，如-15至-35°C，例如-18至-30。C。在本发明的一个具体实施方式中，结晶步骤在不进行机械搅拌的条件下进行。结晶可基本上静止进行，即在混合物中只有对流的电流产生运动。可通过通常在室温下开始的控制冷却或突然("紧急")冷却影响结晶。控制冷却可长达72小时并可包括时长超过2至24小时的速度是每小时约1至5t:的冷却过程。紧急冷却可能在不到5个小时之内发生，更优选不到2小时或不到1小时，甚至更优选不到30分钟，如不到15分钟或不到5分钟。用这两种冷却方式冷却之后可将冷却的混合物和溶剂在低温下保存48小时以上，例如保存60小时以上。本发明包含其中的顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第一重量比X至少是1.3:1(虽然也可能是其他比例，如1.1:1、1.15:1禾n1.2:1)的混合物的产生步骤。已经发现，确保两种异构体不等量的第一步使更有效的和/或更具选择性的结晶得以进行。可以许多不同方式产生混合物。通常，通过处理包含大致等摩尔数的量的顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物而形成混合物。但是，混合物也可通过其他方式产生。优选地，混合物可通过包含用对于一种异构体比对于另一种异构体表现出更大的选择性的酶来处理包含顺9,反11和反10，顺12异构体的组合物的步骤的方法而产生。通常，酶是脂酶。在一个具体实施方式中，混合物通过以下产生用对于顺9，反11异构体比对于反10，顺12异构体更具有选择性的酶使包含共轭亚油酸的组合物至少部分酯化形成顺9，反11异构体含量比反10，顺12异构体含量更丰富的酯类组分并将这些酯类组分水解以形成游离酸。在另一具体实施方式中，混合物可通过以下产生将包含共轭亚油酸的组合物与具有1至5个碳原子的至少一种一元醇至少部分酯化以获得相应的共轭亚油酸酯并用酶选择性水解至少部分酯类以产生醇、富含c9tl1异构体的游离脂肪酸和富含tl0cl2异构体的CLA酯，同时至少部分去除形成的醇。产生混合物的起始组合物优选是包含大致等摩尔数的量的顺9，反11和反10，顺12异构体的CLA组合物，如可以通过CLA的化学合成获得的，如通过亚油酸的共轭作用获得，见文献如专利EP-A-0卯2082所述。优选地，一种、一种以上或所有的酯化和水解步骤使用脂酶进行。最优选的脂酶是那些对于顺9，反11异构体或对于反10，顺12异构体比对另一种异构体更具有选择性的脂酶。适合的脂酶的例子是那些来自于皱褶念珠菌或念珠地丝菌的脂酶。然而，仅仅必要的是酯化或水解步骤中的一个步骤表现出对于一种异构体的选择性，并且其他的酯化或水解步骤可是非选择性的并可包含非选择性化学反应或酶反应。优选地，第一比例X是至少约1.3:1，如至少约1.4:1或至少约1.5:1。因为实用的原因，优选第一比例X不超过约4:1和更优选低于约3:1或低于约2:1，如低于1.8:1。进行结晶步骤以增加异构体中一种异构体对另一种异构体的相对比例。结晶步骤后两种异构体的重量比是第二比例Y。Y大于X并通常大于约1.5:1，更优选大于约1.7:1，如大于约2:1，例如至少约3:1或至少约4:1或至少约5:1或甚至至少约10:1。Y通常不超过约20:1，更优选不超过约50:1或不超过约100:1。本发明的方法可包含进一步步骤。例如，该方法优选包含在结晶步骤后组合物的分离步骤，可选择地包含冲洗组合物和可选择地使组合物干燥的步骤。然而，优选不冲洗组合物。同样优选的是不经任何常压或减压下的外部加热过程使溶剂移除至空气中而使组合物干燥。组合物通常形成晶体产物并通过例如过滤或离心的方式从液体(即结晶后液态残留物)中分离。为进一步增加Y值，可将组合物进行一次或多次进一步结晶，如此处所述。该方法可包含从组合物形成酯类的歩骤。适合的酯类包括来自具有1至6个碳原子的醇的烃基酯类。尤其优选甘油酯(包括单甘油酯、双甘油酯、甘油三脂和它们的混合物)。这些酯类可通过酯化作用形成(例如使用酶；选择性酶可进一歩增加异构体的比例Y)并可选择地通过例如蒸馏的方法纯化。进行本发明的方法可使最终组合物中顺9，反11异构体或反10，顺12异构体的含量增加。优选地，组合物中包含的顺9，反ll异构体的含量大于反10，顺12异构体的含量。在另一具体实施方式中，组合物中包含的反10，顺12异构体的数量大于顺9，反11异构体的数量。以组合物中C18:2脂肪酸复合物的总量计，本发明方法生产的组合物优选包含至少60重量％的含有顺9，反ll异构体的复合物，更优选至少70重量％的含有所述异构体的复合物。另外，以组合物中C18:2脂肪酸复合物的总量计，组合物包含至少60重量％的含有反10，顺12异构体的复合物，更优选包含至少70重量％的含有所述异构体的复合物。本发明方法生产的组合物可用于食品、食物补充剂或药品。所以，本发明也适用于包含本发明的组合物的食品、食物补充剂或药品。食物补充剂或药品可以是适合肠内或肠外应用的胶囊形式或其他形式，并包含本发明的组合物。尤其优选食物补充剂(该术语包括营养补充剂)。食物补充剂的例子包括包含选自明胶、淀粉、改性淀粉或淀粉衍生物如葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖的包入胶囊的物料的软胶囊和硬胶囊形式的产品。包入胶囊的物料可选择地含有交联剂或聚合剂、稳定剂、抗氧化剂、保护光敏感的填充过程的光吸收剂、防腐剂等。优选食物补充剂中共轭脂肪酸的单位剂量是从lmg至1000mg(更优选是从100mg至750mg)。食品可选择地包含与互补性脂肪的共混物的组合物。共混物可包含0.3-95重量％,，优选是2-80重量％，最优选5_40重量％的本发明的产品和99.7-5重量％，优选是98-20重量％，最优选95-60重量％的选自可可脂、可可油等价物、棕榈油或部分棕榈油、棕榈仁油或部分棕榈仁油或所述脂肪或其脂肪组分酯交换作用的混合物的互补性脂肪，或选自葵花子油、高油酸葵花籽油、大豆油、菜籽油、棉籽油、鱼油、红花油、高油酸红花油、玉米油或MCT-油的液态油。食品(该术语包括动物饲料)可含有脂肪相，其中脂肪相包含本发明的产品。适合的食品的例子包括那些选自人造黄油、脂肪连续相或水连续相或双连续相软质奶酪、低脂软质奶酪、糕饼产品如巧克力或巧克力涂层或巧克力馅的食品或焙烤食品馅的食品、冰淇淋、冰淇淋涂层、包含冰淇淋的食品、调味品、酱汁、奶酪、奶油、奶油替代品、干汤料、酱油、饮料、谷物棒、酱油、棒状小食品、乳制品、面包产品、临床营养品和婴儿食品或婴JL配方食品的食品。药品包括以下形式的药品组合物，如片剂、丸剂、胶囊剂、小胶囊剂、包括颗粒剂、微珠、糖丸和微囊颗粒的复合剂型；粉末剂、酏剂、糖浆剂、混悬液剂和溶液剂。药品组合物将包含药学上可接受的稀释剂或载体。药品组合物优选适合肠外给药(如口服)。口服给药的组合物可以固态或液态形式并可采用片剂、粉末剂、混悬液剂和糖浆剂的形式。可选择地，该组合物包含一种或多种调味剂和/或着色剂。适合用于这种组合物的药学上可接受的载体在药学领域众所周知。本发明的组合物可含有O.l-99重量％的共轭脂肪酸。组合物通常制成单位剂量形式。共轭脂肪酸的单位剂量优选是从lmg至1000mg(更优选是从100mg至750mg)。在制备这些组合物的过程中使用的赋形剂可包括本领域已知赋形剂。用以下非限制实施例解释本发明。在实施例中和整个说明书中，除非另有说明，否则所有百分数均为重量百分数。实施例实施例1制备用以分馏的比例是X的起始物料根据专利US6160140的实施例1和2中描述的方法制备具有等摩尔比的两个异构体顺9，反11(c9，tll)和反10，顺12(tl0，cl2)的共轭亚油酸(CLA)混合物。将从该方法中获得的游离脂肪酸用醇酯化。酯化反应被脂酶催化。在该实施例中，将甘油用作醇并且该反应用脂肪酶LipozymeRMIM催化。此后，将获得的甘油酯部分水解并将酸性组分通过蒸馏的方式从甘油酯组分中分离。将约400kg充分精制的甘油酯产品部分水解。该反应是由来自铍褶念珠菌的脂酶催化。在170至19(TC蒸馏后，获得两个异构体c9，tll禾口t10，cl2的比例X^—2.9的馏出物组分。实施例2经湿法分馏富集C9,tll异构体一般方法将两种异构体c9，tll和t10，cl2的比例是X的CLA游离脂肪酸(CLA-FFA)在500ml玻璃容器中溶于溶剂。所得溶液放入-3(TC冰箱并静止冷却48小时。之后，形成的晶体用布氏漏斗在减压条件下过滤。所得硬脂(固态、晶体)组分融化至周围环境中并且残留溶剂通过旋转蒸发的方法蒸发。根据下列公式计算产量产〗刷匕(g)c9，起始物料(g)硬脂(固态)和油精(液态:结晶后的液体)组分中的两个异构体tll禾nt10，c12的比例通过根据标准FAMEGLC方法测定的脂肪酸构成而计算。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>静止湿法分馏用不同比例的油与溶剂进行一系列的4个实验。起始物料中两种异构体c9，tll和t10，cl2的比例(X)是2.6，而所用溶剂是丙酮。所研究的油与溶剂的比例是l丄5、1:2.3、1:4和1:9。所得结果如表1所示。表1.-3(TC下湿法分馏后获得的硬脂组分的脂肪酸构成和产量。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3控制冷却对湿法分馏富集的c9，tllCLA异构体的影响一般方法两种异构体c9，tll禾Pt10，c12的比例是X的CLA-FFA在小规模结晶器中溶于溶剂。结晶器由有外壳的底部带有过滤单元的1L玻璃容器构成。为了能够使用温度控制的冷却程序，将容器与温度控制单元相连。所得溶液静止冷却48小时。所得硬脂组分融化至周围环境中并且残留溶剂通过旋转蒸发的方法蒸发。两种异构体c9，tll和t10，c12的产量和比例根据上文提到的公式计算。控制冷却分馏进行两个实验。在一个实验中，油/溶剂混合物根据温度冷却程序冷却，而在第二个实验中使用紧急冷却。两种异构体c9，tll和t10，c12的在起始物料中的比例(X)是7.6。所用的油对溶剂的比例是1:4。研究了以下温度冷却程序-在2小时之内从2(TC降至-l(TC;-在1小时之内从-l(TC降至-15°C;-在2小时之内从-15。C降至-25°C。将该混合物在-25'C存放24小时；在此温度之后将温度进一步降至-27°C。48小时后过滤该混合物。根据实施例2进行紧急冷却实验。所得结果如表2所示。表2.湿法分馏48小时后获得的硬脂组分的脂肪酸构成和产量。油:溶剂比例1:41:4产量(％)20.873.01起始物料控制冷却紧急冷却说明C16:04,47.4C18:00.71.40.9CLATT0.60.80.4C18:2c9，tll0.30.30.2C18:2tl0，c120.20.10.1C18:211，133.01.90.9C18:lC13.412.811.8CLAOX0.20.20.2C18:2T0.50.30.2C18:2C1.71.20.7TTnc—-0.40.2C20:0—一0.1——C18:2C9，Tll65.868.076.6C18:2T10，C128.75.12.4总CLA异构体78,876.480.7未鉴定部分0.2——一—比例X7.6一—一—比例Y——13.131.3实施例4起始物料中比例X对富集(相当于使X大于1)的影响根据实施例1中描述的过程进行一个实验。研究了含有两种不同比例的(X=l和X4.5)的两种异构体的起始物料。油对溶剂的比例是1.-4，并且将该混合物在-28'C结晶24和48小吋。所得结果如表3所表3.将X=l和X=1.5的物料经湿法分馏后获得的硬脂组分的脂<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例5纯化的c9，tll禾口t10，cl2共轭亚油酸(CLAFFA)和c9，tll和t10，cl2共轭亚油酸甲酯(CLAME)的物理或化学特征如下CLA异构体熔点，°ca)沸点，"c(760托)b)蒸汽压强，托Wc9，tllFFA10.1381.67.01<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>"在PerkinElmerPyrisIDSC上测定，用液氮冷却。异构体的纯度是c9，tllCLA异构体98。/。，t10，cl2CLA异构体97%。W使用用于Solaris,SciFinder的先进化学研究软件实验室(ACD/Labs)V8.14i十算。权利要求1、包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物的制备方法，该方法包括-产生包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体的混合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第一重量比X至少是1.3:1；和-使该混合物经过结晶步骤以形成包含顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第二重量比是Y，其中Y大于X。2、根据权利要求1所述的方法，其中结晶是在溶剂存在下进行的。3、根据权利要求2所述的方法，其中溶剂包含极性有机化合物。4、根据权利要求2或3所述的方法，其中溶剂包含C3至C6酮、C1至C6醇、水或它们的混合物。5、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中结晶是在使用丙酮作为溶剂下进行的。6、根据权利要求5所述的方法，其中溶剂对顺9，反11和反10，顺12异构体总量的重量比的范围是从20:1至1:1。7、根据权利要求5所述的方法，其中溶剂对顺9，反11和反10，顺12异构体总量的重量比的范围是从9:1至2:1。8、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中结晶是在ox:以下的温度下进行的。9、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中结晶是在-10至-4(TC的温度下进行的。10、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中结晶是在不进行机械搅拌的条件下进行的。11、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中混合物是通过以下产生的用与反10，顺12异构体相比，对顺9，反11异构体有选择性的酶使包括共轭亚油酸的组合物至少部分酯化以形成顺9，反11异构体比反10，顺12异构体含量丰富的酯类组分和反10，顺12异构体比顺9，反11异构体含量丰富的游离酸组分，并且将该酯类组分和该游离脂肪酸组分分离。12、根据权利要求ll所述的方法，该方法进一步包含将酯类组分水解以形成顺9，反11异构体比反10，顺12异构体含量丰富的游离酸组合物。13、根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中混合物是通过以下产生的用至少一种含有1至5碳原子的一元醇将包含共轭亚油酸的组合物至少部分酯化以获得相应共轭亚油酸酯和用酶选择性水解至少部分酯类以产生醇、富含c9tl1异构体的游离脂肪酸和富含tl0c12异构体的CLA酯类，同时至少部分去除形成的醇，和将游离脂肪酸从CLA酯类中分离。14、根据权利要求11至13任一项所述的方法，其中酶是脂酶。15、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中第一比例X至少是1.5:1。16、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中第二比例Y至少是2.5:1。17、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中组合物包含含量大于反10，顺12异构体的量的顺9，反11异构体。18、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中以组合物中C18:2脂肪酸的总量计，该组合物包含至少60重量％的顺9，反11异构体。19、根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中该组合物包含含量大于顺9，反11异构体的量的反10，顺12异构体。20、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中以组合物中C18:2脂肪酸的总量计，该组合物包含至少60重量％的反10，顺12异构体。21、根据上述权利要求任一项所述的方法，该方法进一步包含从该组合物形成酯类。全文摘要本发明涉及一种包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物的制备方法，该方法包含产生包含共轭亚油酸(CLA)的顺9，反11和反10，顺12异构体的混合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第一重量比X至少是1.3∶1；和使该混合物结晶以形成包含顺9，反11和反10，顺12异构体的组合物，其中顺9，反11和反10，顺12异构体中的一种异构体相对于另一种异构体的第二重量比是Y，其中Y大于X。文档编号C11C1/04GK101443437SQ200780016965公开日2009年5月27日申请日期2007年4月4日优先权日2006年4月13日发明者J·蒙斯特,K·巴格干,V·塔兰申请人:脂质营养品有限公司