纺前染色蛋白纤维及其制造方法

纺前染色蛋白纤维及其制造方法
【专利摘要】本发明的纺前染色蛋白纤维为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋白为0～100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100～0质量％的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。该纤维是如下得到的：通过将纺前染色色素预先溶解或分散在纺丝液所用的溶剂中或者溶解或分散在二甲基亚砜中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所述溶剂中加入蛋白粉体并溶解，制成纺丝液(6)，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。由此，提供成本低、纺前染色色素均匀分散在纤维内且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。
【专利说明】纺前染色蛋白纤维及其制造方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及在纺丝工序之前添加了纺前染色色素的纺前染色蛋白纤维及其制造 方法。

【背景技术】
[0002] 蛋白纤维已知有属于再生蚕丝纤维（sUk fiber)的丝蛋白纤维、人工蛛丝纤维等。 关于该些纤维的纺前染色纤维也已提出了几种。例如专利文献1中提出了，在六氣异丙醇 化FI巧溶剂中加入蚕丝蛋白（sUk fibroin)和血红素、然后挤出到甲醇凝固液中进行纺 丝、冷拉伸。作为人工蛛丝纤维，例如专利文献2的实施例6中记载了将Sudan Red, Nile Red(均为颜料）添加到纺丝液中、实施例7中记载了将Green Fluorescent Protein(绿色 英光蛋白，GF巧添加到纺丝液中。
[0003] 但是，颜料在纺丝液中的分散性存在问题，GFP存在成本高的问题。当在纺丝液中 的分散性或溶解性差时，存在纺丝工序时不仅会发生断头、而且难W获得均匀组成的纺前 染色纤维的问题。此外，还存在难W表现出鲜艳的颜色的问题。
[0004] 现有技术文献 [000引专利文献
[0006] 专利文献1 ;W02008/004356号公报
[0007] 专利文献3 ;W02011/113592号公报


【发明内容】

[000引发明所要解决的课题
[0009] 本发明为了解决上述W往的问题，提供一种成本低、纺前染色色素均匀分散在纤 维内、且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤维及其制造方法。
[0010] 用于解决课题的手段
[0011] 本发明的纺前染色蛋白纤维的特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕 丝蛋白为0?100质量％、蛛丝蛋白来源的多肤为100?0质量％的纺前染色蛋白纤维，其 中，所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。
[0012] 本发明的纺前染色蛋白纤维的制造方法的特征在于，其为当将蛋白纤维记为100 质量％时蚕丝蛋白为0?100质量％、蛛丝蛋白来源的多肤为100?0质量％的纺前染色 蛋白纤维的制造方法，其中，将纺前染色色素预先溶解或分散到纺丝液所用的溶剂中或者 溶解或分散到二甲基亚讽中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所 述溶剂中加入蛋白粉体并溶解，制成纺丝液，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。
[001引发明效果
[0014] 本发明通过制成在纺丝液中添加纺前染色色素而得到的纺前染色蛋白纤维，能够 提供成本低、纺前染色色素均匀分散在纤维内且能够表现出鲜艳的色调的纺前染色蛋白纤 维及其制造方法。利用蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肤的混合比例，也能够制成甚至表现 出金属光泽的鲜艳的具有反射性的纤维。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1为表示本发明的一个实施例的制造工序的说明图。
[0016] 图2A-B为表示本发明的另一实施例的制造工序的说明图、图2A表示纺丝工序、图 2B表示拉伸工序。
[0017] 图3为表示本发明的另一实施例的制造工序的说明图。
[0018] 图4A为家蚕虽丝的示意截面图、图4B为表示家蚕虽丝的结构的示意说明图。

【具体实施方式】
[0019] (1)纺前染色色素
[0020] 本发明的纤维为将纺前染色色素（W下也称为着色剂）添加到纺丝液中进行纺丝 而得到的纺前染色蛋白纤维。着色剂优选选自染料和颜料中的至少一种。染料有表现出各 种色调的染料，易于溶解或分散于纺丝液。本发明的纺丝工序中，由于不会受到染料变质那 样的高热，因此很多染料均可使用。另外，颜料有耐候性高的优点。进一步优选的着色剂优 选选自纤维用酸性染料、纤维用碱性染料、纤维用英光染料、纤维用直接染料、纤维用分散 染料、植物色素、食品用天然色素和炭黑中的至少一种着色剂。该些着色剂在纺丝液中的分 散性良好并难W产生异物。其中，酸性染料和植物色素与单独的蚕丝蛋白、单独的蛛丝蛋白 来源的多肤、蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肤的混合组成的适应性均良好，表现出鲜亮的 色调。利用蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肤的混合比例，能够制成甚至表现出金属光泽该 样的鲜艳的具有反射性的纤维。英光染料对于单独的蛛丝蛋白来源的多肤的纺前染色纤维 是有用的，表现出强的英光色。着色剂的存在量相对于蛋白纤维100质量％优选为0. 1? 2质量％。当在上述范围内时，均匀分散性高。本发明的着色剂不包括血红素 、Sudan Ret Nile Red(均为颜料）、Green Fluorescent Protein(GFP,绿色英光蛋白）。颜料在纺丝液 中的分散性方面存在问题，GFP存在成本高的问题。
[0021] (la)酸性染料：酸性染料是用于对蚕丝、羊毛、尼龙纤维进行染色的染料。是含有 賴酸基、駿基等酸性基团的色素酸的轴盐。用D-S〇3Na、D-COO化的通式表示。
[0022] (化）碱性染料；碱性染料是用于对蚕丝、羊毛进行染色的染料。芳香族环上取代 的-NH2，-NHR，-NR巧是碳数为1-3的焼基）与盐酸等酸成分形成盐，通式用D-NHs+C厂表示。 更好地染色丙帰酸系合成纤维且日光坚牢度高的阳离子染料也是碱性染料。当应用于本发 明时，可见纺丝液的粘度上升。
[0023] (Ic)英光染料；英光染料具有吸收紫外线并发射比其波长长的蓝紫色的光的性 质。是用于消除纤维的黄变使其看起来发白的染料。由于当将英光染料应用于本发明的单 独的蛛丝蛋白来源的多肤的纺前染色纤维时表现出强的英光色，因此适合用于夜间穿用的 外套、标记、商品标签等。
[0024] (Id)直接染料；直接染料是用于对蚕丝、羊毛进行染色的染料。是含有賴酸基的 色素酸的轴盐，用d-s〇3化的通式表示。
[0025] (le)分散染料：分散染料是用于W在分散剂（表面活性剂）作用下在水中分散成 微粒状的状态进行染色的染料。意酿系的化合物占大部分。分子量较小。当应用于本发明 时，可见在凝固浴中脱落。
[0026] (If)植物色素；有红花黄色素、檐子花黄色素、檐子花蓝色素、红辣椒色素、厕脂 树色素、目-胡萝h素色素、可可色素、花青素系色素等。因对人体安全，也作为食品用天然 色素而得到认可。当用于本发明的纺前染色纤维时，可用于手术用缝合线等。
[0027] (Ig)食品用天然色素；除了上述植物色素外，还有焦糖色素、红曲霉色素、紫胶色 素、厕脂虫色素、植物碳色素等。与植物色素同样地可用于手术用缝合线等。
[0028] (Ih)炭黑；炭黑对于将蛋白纤维着色成黑色是有用的。黑色纺前染色蛋白纤维适 于人工毛发。
[0029] (2)使着色剂溶解或分散的溶液
[0030] 作为使着色剂溶解或分散的溶液，优选二甲基亚讽值MS0)、N，N-二甲基甲醜胺 值MF)、六氣异丙醇（HFIP)、六氣丙丽（HFA)等。其中，从成本、操作性的容易性出发，优选 DMS0或DMF。DMS0的烙点为18. 4°C、沸点为189°C、DMF的烙点为一ere、沸点为153。与 W往方法中使用的六氣异丙醇化FI巧的沸点为59C、六氣丙丽化FAc)的沸点为一26.5°C 相比，沸点远远地高。另外，DMS0和DMF由于在通常的产业领域中也用于丙帰酸纤维的聚 合、用作纺丝液并用作聚醜亚胺的聚合溶剂，因此是成本低、安全性也得到确认的物质。当 在DMS0或DMF中加入无机盐时，溶质的溶解度进一步提高。作为无机盐，为选自碱金属团 化物（例如LiCl、Li化等）、碱±类金属团化物（例如化Cy、碱±类金属硝酸盐（例如 Ca(N〇3)2等）、硫氯酸轴（例如化SCN等）中的至少一种。当将溶解成分记为100质量％ 时，无机盐的比例优选为0. 1?20质量％的范围。当加有无机盐时，在最终得到的纺前染 色蛋白纤维内也会微量地残留。将着色剂预先溶解或分散于上述溶液。接着，与纺丝液混 合或加入纺丝液所用的溶剂、然后加入具有纤维形成能力的蛋白粉体，制成纺丝液。
[00引]做蚕丝蛋白
[0032] 蚕丝是从家蚕炬ombyx mori)的幼虫即蚕所结的虽获得的纤维，如图4A的家蚕虽 丝的示意截面图所示，虽丝40 W 2根丝蛋白41被外侧的丝胶（sericin) 42被覆的形式而形 成为1根。更详细而言，如图4B所示的家蚕虽丝的结构那样，丝蛋白41由大量原纤43构成， 丝蛋白41的外侧被4层丝胶42被覆，构成1根虽丝44。为了实用，通过煮丝（scouring) 将外侧的丝胶42溶解除去，制成蚕丝长丝而用于衣料用途。蚕丝的比重为1.33。另外通 常，纤度为平均3. 3deci tex，纤维长为1300?1500m左右。将纤度平均是由于虽的外层部 粗、越向内侧越细，作为整体为不均匀的纤度。本发明中使用的蚕丝蛋白优选是W天然或家 蚕的虽或者二手、废弃的丝布料为原料，对除去了包覆蚕丝蛋白的丝胶、其他脂肪成分等的 蚕丝蛋白进行精制，制成蚕丝蛋白冻干粉而得到的。
[003引 （4)蛛丝蛋白来源的多肤
[0034] 本发明的蛋白纤维可W是蛛丝蛋白来源的多肤。蛛丝蛋白来源的多肤可W是天 然型蛛丝蛋白来源或类似的多肤，没有特别限定。所述多肤从强初性优异的观点出发，优 选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的多肤。作为所述大吐丝管拖丝蛋 白，可列举出Nephila clavipes来源的大壶状腺丝蛋白（spi化oin)MaSpl、MaSp2、Araneus diadematus 来源的 ADF3、ADF4 等。
[00巧]上述重组蛛丝蛋白也可W是由蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝管拖丝蛋白来源的 重组蛛丝蛋白。作为上述小吐丝管拖丝蛋白，可列举出N^hila clavipes来源的小壶状腺 丝蛋白（spi化oin)MaSpl、MaSp2。
[0036] 另外，上述重组蛛丝蛋白还可W是由蜘蛛的鞭状腺（flagelliform gland)产生的 横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述横丝蛋白，可列举出例如Ne地ila clavipes来源 的鞭毛状蚕丝蛋白（flagelliform si化protein)等。
[0037] 作为所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肤，可列举出包含2个W上、优选4个W上、 更优选6个W上的式1 ;REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元的多肤。需要说明的是，所述 大吐丝管拖丝蛋白来源的多肤中，式（1) ;REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元可W相同 也可W不同。上述式（1)中，REP1是指聚丙氨酸。
[0038] 上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为2个残基W上、更优选为3个残基W上、进 一步优选为4残基W上、特别优选为5个残基W上。另外上述REP1中，连续排列的丙氨酸 优选为20个残基W下、更优选为16个残基W下、进一步优选为14个残基W下、特别优选为 12个残基W下。上述式（1)中，REP2为由2?200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，且 上述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨醜胺、脯氨酸和丙氨酸的总残基数相对于氨 基酸残基数整体为40% W上、优选为50% W上、更优选为60% W上。
[0039] 大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成结晶目折叠的结晶区域，上述 REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且，上述 [REP1-REP2]相当于由结晶区域和无定型区域构成的重复区域（反复序列），其为拖丝蛋白 的特征性序列。
[0040] 作为包含2个W上的上述式1 ;REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列单元的多肤，可列 举出例如具有序列号2、序列号3和序列号4中的任一个所示的氨基酸序列的ADF3来源的 重组蛛丝蛋白。序列号2所示的氨基酸序列是在N末端添加有由起始密码子、HislO标签 和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列号为5)的ADF3 的氨基酸序列中发生下述变异而成的多肤：第1?13号的反复区域增加至约2倍，并且翻 译在第1154号氨基酸残基处终止。序列号3所示的氨基酸序列是在从NCBI数据库获得的 ADF3的部分氨基酸序列（NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI ;1263287)的氨基酸序 列的N末端添加有由起始密码子、HislO标签和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别 位点构成的氨基酸序列（序列号为5)的氨基酸序列。序列号3所示的氨基酸序列是在N 末端添加有由起始密码子、HislO标签和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构 成的氨基酸序列（序列号为5)的ADF3的氨基酸序列中第1?13号的反复区域增加至约 2倍而成的氨基酸序列。另外，作为含有2个W上的上述式1 ;REP1-REP2(1)所示的氨基酸 序列单元的多肤，可W使用在序列号1、序列号2、序列号3和序列号4中的任一个所示的氨 基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成，且具 有由结晶区域和无定型区域构成的重复区域的多肤。
[0041] 本发明中，"1个或多个"是指例如1?40个、1?35个、1?30个、1?25个、1? 20个、1?15个、1?10个、或1个或数个。另外，本发明中，"1个或数个"是指1?9个、 1?8个、1?7个、1?6个、1?5个、1?4个、1?3个、1?2个或1个。
[0042] 作为上述小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出含有式2 ;REP3(2)所 示的氨基酸序列的多肤。上述式2中，REP3是指由佑ly-Gly-幻m佑ly-Ala) 1 (A)r构成的 氨基酸序列，Z是指任意一个氨基酸，但特别优选为选自Ala、Tyr和Gin中的一个氨基酸。 另外，m优选为1?4、1优选为0?4、r优选为1?6。
[0043] 蛛丝中，小吐丝管拖丝从蜘蛛网的中也W螺旋状卷绕，用作网的增强材料，或用作 将捕获的猎物包裹的丝。已知与大吐丝管拖丝相比，拉伸强度差，但伸缩性高。考虑该是由 于，在小吐丝管拖丝中，大量的结晶区域由甘氨酸和丙氨酸交替连接的区域形成，与结晶区 域仅由丙氨酸形成的大吐丝管拖丝相比，结晶区域的氨键更易于变弱。
[0044] 作为上述横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式3 ;REP4(3)所示的氨基 酸序列的多肤。上述式3中，REP4是指由佑ly-Pro-Gly-Gly-幻n构成的氨基酸序列，X是 指任意一个氨基酸，但特别优选为选自Ala、Ser、Tyr和Val中的一个氨基酸。另外，n表示 至少为4 W上的数字，优选为10 W上、更优选为20 W上。
[0045] 蛛丝中，横丝不具有结晶区域，具有由无定形区域构成的重复区域是一大特征。推 测在大吐丝管拖丝等中，由于具有由结晶区域和无定形区域构成的重复区域，因此同时具 有高的应力和伸缩性。另一方面，横丝虽然与大吐丝管拖丝相比应力差，但具有高的伸缩 性。考虑该是由于，横丝的大部分由无定形区域构成。
[0046] (5)蚕丝蛋白与蛛丝蛋白来源的多肤的混合比例
[0047] 本发明的蛋白纤维可W是单独的蚕丝蛋白、单独的蛛丝蛋白来源的多肤、蚕丝蛋 白与蛛丝蛋白来源的多肤的混合组成中的任一种。混合组成时，可蚕丝蛋白为0?100 质量％、蛛丝蛋白来源的多肤为0?100质量％的范围混合。当在上述范围时有优选的可 纺性，两成分不会剥离且亲和性良好，形成复合纤维，形成应力高且具有适当的断裂伸长率 的蛋白纤维。
[004引 做纺丝液（胶浆液）
[0049] 作为所述蚕丝蛋白冻干粉和蛛丝蛋白来源的多肤冻干粉的溶剂，只要是能够溶解 多肤的溶剂，则任何溶剂均可。例如有六氣异丙醇（HFIP)、六氣丙丽（HFA)、尿素、脈、月桂 基硫酸轴（SDS)、含有漠化裡、氯化巧、硫氯酸裡等的水溶液、在二甲基亚讽值MS0)、DMS0 中加入了无机盐而成的溶剂、在N，N-二甲基甲醜胺；DMF中加入了无机盐而成的溶剂等。 其中，从成本、操作性出发，优选二甲基亚讽值MS0)、在DMS0中加入无机盐而成的溶剂、在 N，N-二甲基甲醜胺；DMF中加入无机盐而成的溶剂。蛋白的浓度优选为4. 2?15. 8质量％。 作为无机盐，为选自碱金属团化物（例如LiCl、Li化等）、碱±类金属团化物（例如化Cl2)、 碱±类金属硝酸盐（例如化(N03)2等）、硫氯酸轴（例如化SCN等）中的至少一种。当将溶 解成分记为100质量％时，无机盐的比例优选为0. 1?20质量％的范围。除去杂质和泡， 制成溶液粘度为2500?15000CP (厘泊）的纺丝液（胶浆液）。
[0050] (7)纺丝工序
[0051] 纺丝采用湿式纺丝。由此，除去使聚合物溶解的溶剂（也称为脱溶剂），得到未拉 伸丝。湿式纺丝中使用的凝固液只要是能够脱溶剂的溶液，则可W是任何凝固液。当溶剂 为HFIP时，凝固液优选使用甲醇、己醇、2-丙醇等碳数为1?5的低级醇。凝固液的温度优 选为0?3(TC。当为上述范围时，纺丝稳定。通过将所述纺丝液挤出到凝固液中，得到未拉 伸丝。当使用具有直径为0. 57mm的喷嘴的注射器粟时，挤出速度优选每孔为0. 2?5. 0ml/ h。当为该范围时，纺丝稳定。进一步优选的挤出速度为每孔为0.25?3ml/h。凝固液槽 的长度优选为200?500mm、未拉伸丝的牵引速度优选为1?20m/分钟、滞留时间优选为 0.05?3min。当为该范围时，脱溶剂可高效地进行。可W在凝固液中进行拉伸（前拉伸）， 但考虑到低级醇的蒸发，优选将凝固液维持在低温，w未拉伸丝的状态进行牵引。凝固液槽 可W设为多段，可W使其拉伸。
[00閲 做拉伸工序
[0053] 拉伸工序优选将未拉伸丝在拉伸温度为16(TC?230°C的干热下拉伸1. 05?4 倍。本发明通过上述该样的高温干热加热，分子高度取向，得到高强度的拉伸丝。优选的拉 伸温度为16(TC?18(TC。优选的拉伸倍率为1. 05?1. 5倍。关于干热，作为一个例子使 用电管状炉或干热板。
[0054] 巧a)连续拉伸工序
[00巧]从纺丝到拉伸可W为连续工序，也可W分为任意的工序实施。图1为表示本发明 的一个实施例的制造工序的说明图。图1表示连续工序。纺丝拉伸装置10包括挤出工序 1、未拉伸丝制造工序2、干热拉伸工序3。纺丝液6胆藏在胆存槽7并从齿轮粟8挤出到纺 丝头9。在实验室规模中，可W将纺丝液充填到滚筒中，用注射粟从喷嘴挤出。被挤出的纺 丝液具有空隙13地或直接供给至凝固液槽12的凝固液11内，将溶剂除去。接着，供给至 干热拉伸装置17,在丝道18内进行拉伸，制成卷丝体4。拉伸由供给夹持親15与牵引夹持 親16的速度比决定。14a?14f为导丝器。
[0056] 巧b)分离的拉伸工序
[0057] 图2A-B为将本发明的另一实施例的制造工序分离的例子的说明图。图2A表示纺 丝工序20、图2B表示干热拉伸工序30。各工序中，还可W将丝卷取或不卷取地留存在容器 中。纺丝工序20中，将纺丝液22预先加入微型注射器21内，用注射粟使其沿箭头P方向 移动，将纺丝液22从喷嘴23挤出，供给至凝固液槽24内的凝固液25中，制成未拉伸丝的 卷丝体26。然后，在干热拉伸工序30中，将未拉伸丝从卷丝体26拉出，供给至干热拉伸装 置29,在丝道31内进行拉伸。拉伸由供给夹持親27与牵引夹持親28的速度比决定。接 着，将拉伸丝卷取成卷丝体32。由此，得到本发明的丝蛋白纤维的拉伸丝。
[005引 巧C)热水浴拉伸工序
[0059] 本发明方法中，在干热加热拉伸之前也可W预先进行热水浴拉伸。通过热水浴拉 伸，能够进一步促进分子取向。热水浴拉伸对于蚕丝蛋白与蛛丝蛋白的混合（复合）也是 有用的。热水浴拉伸的条件优选为30?9(TC、拉伸倍率优选为1.05?6倍。图3表示热 水浴拉伸的工序。直至凝固工序与图2A相同。经过了凝固工序的未拉伸丝33a从夹持親 36通过进入到热水浴槽34内的热水浴35中，由夹持親37进行拉伸，由此制成拉伸丝33b 并卷绕成卷丝体38。39为热水浴拉伸工序。经过了热水浴拉伸工序39的拉伸丝通过图2B 所示的干热拉伸工序30拉伸。
[0060] 本发明的纺前染色纤维的单纤维直径优选为5?200 ym的范围。当为所述范围 时，能够稳定地获得拉伸纤维。纤度高的丝适于人工毛发。更优选的纤维直径为7?100 y m 的范围、进一步优选为10?80]im的范围。计算纤度（单位；tex或deci tex)时，纤维截 面为圆形时，根据由纤维直径计算的截面积、比重和长度算出。需要说明的是，本发明的纤 维由于通过湿式纺丝而得到，因此截面并不限于圆形，包括各种形状，因此平均直径是指将 截面假定为圆形时的平均直径。
[00川 实施例
[0062] W下使用实施例对本发明更具体地进行说明。需要说明的是，本发明并不限于下 述实施例。
[0063] (实施例1-5、比较例1-2)
[0064] 1.蚕丝蛋白原料的准备
[00财 （1)将丝布料剪切为约2mmX 10mm左右，在煮沸的0. 5质量％马赛皂水（马赛皂使 用用锥屑器挫细后的皂粉）中煮约30分钟。
[0066] 0)之后，在煮沸的热水中煮30分钟。
[0067] (3)在顺序1和2之后再重复2次（计3次）。
[0068] (4)最后在煮沸的热水中煮30分钟。通过该操作将包覆蚕丝蛋白的丝胶或其他添 加剂等完全除去。
[0069] (5)将湿蚕丝蛋白在37C环境下干燥过夜。
[0070] (6)巧帽干燥后的蚕丝的重量，加入Li化水溶液巧mol/L)，使得达到lOw/v%，在 4(TC环境下溶解2小时。
[0071] (7)将其水溶液倒入纤维素透析膜（VISKASESELES C0AP 制 Seamless Cellulose Tubing, 36/32)中，用蒸觸水透析3?4天。
[0072] (8)将透析后的回收溶液在2(TC、15000巧m离也1小时，除去溶解残留物、杂质等。
[0073] (9)进而用MilliQ稀释，使得浓度达到2质量下。
[0074] (10)稀释后，从ADVANTEC公司的150ym过滤器通过，将细小的杂质完全除去。
[00巧](11)将蚕丝蛋白水溶液在一8(TC环境下冷冻，冷冻干燥一整夜。确认充分地去除 水分后，W蚕丝蛋白粉末形式保存。如此，得到蚕丝蛋白冻干粉。
[0076] 2.蛛丝蛋白来源的多肤的准备
[0077] <基因合成〉
[0078] (l)ADF3Kai 基因的合成
[0079] 从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3佑I ; 1263287)的部分氨基酸序列，委巧GenScript公司合成编码在该序列的N末端添加了由起 始密码子、HislO标签和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列 (序列号4)的氨基酸序列（序列号2)的基因。其结果，获得了导入了由序列号5所示的碱 基序列构成的ADF3Kai基因的PUC57载体（基因在5'末端紧接的上游具有Nde I位点、和 在5'末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制性酶 处理，重组到祀T2化(+)表达载体中。
[0080] (2) ADF3Kai-Large 基因的合成
[00引]WADF3Kai为模板，使用T7启动子引物（序列号8)和Rep甜a I引物（序列号9) 进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中的5'侧一半的序列（W下记为序列A)进行扩增， 将该片段重组到预先使用Mi曲ty Cloning Kit (Takara Bio株式会社制）并用Nde I和甜a I进行限制性酶处理而得到的PUC118载体中。同样地，WADF3Kai为模板，使用甜a I Rep 引物（序列号10)和T7终止子引物（序列号11)进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中 3'侧一半的序列（W下记为序列B)进行扩增，将该片段重组到预先使用Mi曲ty Cloning Kit (Takara Bio株式会社制）并用甜a I、EcoR I进行限制性酶处理而得到的pUCl 18载 体中。将导入了序列A的PUC118载体用Nde I、甜a I进行限制性酶处理，将导入了序列B 的PUC118载体用甜a I、EcoR I进行限制性酶处理，利用凝胶的切出对序列A和序列B的 目标DM片段进行精制。使DM片段A、B与预先用Nde I和EcoR I进行限制性酶处理而 得到的祀T2化(+)进行连接反应，转化到大肠杆菌D册a中。利用使用了 T7启动子引物和 T7终止子引物的菌落PCR，在确认了目标DNA片段插入后，从得到了目标大小（3.6化P)的 条带的菌落提取质粒，通过使用了 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)的序 列反应对全碱基序列进行确认。其结果，确认构建了序列号6所示的ADF3Kai-Large基因。 需要说明的是，ADF3Kai-Large的氨基酸序列如序列号3所示。
[0082] (3)ADF3Kai-Large-NRSHl 基因的合成
[0083] W导入了上述中得到的ADF3Kai-Large基因的祀T2化(+)载体为模板，通过 使用了 Prime Star Mutagenesis Basal Kit(Takara Bio 株式会社制）的部位特异 性变异导入，使ADF3Kai-Large的氨基酸序列（序列号3)中的与第1155号氨基酸残 基甘氨酸佑ly)对应的密码子GGC变异为终止密码子TAA，在祀T2化(+)上构建序列 号7所示的ADF3Kai-Large-NRS化基因。关于变异导入的准确性，通过使用了 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)的序列反应进行确认。需要说明的是， ADF3Kai-Large-NRSHl的氨基酸序列如序列号1所示。
[0084] <蛋白的表达〉
[0085] 将包含上述得到的ADF3Kai-Large-NRS化的基因序列的祀T2化(+)表达载体转化 到大肠杆菌Rosetta值E3)中。将得到的单菌落在含有氨予青霉素的2mL的LB培养基中培 养15小时后，将该培养液1. 4ml添加到含有氨予青霉素的140mL的LB培养基中，在37°C、 20化pm的条件下进行培养，直至培养液的ODe。。达到3. 5。接着，将ODe。。为3. 5的培养液与 50%葡萄糖140mL -起加入到含有氨予青霉素的化的2XYT培养基中进一步进行培养，直 至ODe。。达到4. 0。其后，向得到的ODe。。为4. 0的培养液中添加异丙基-目-硫代半乳糖化 喃糖巧（IPTG)使终浓度达到0. 5mM，诱导蛋白表达。在IPTG添加后的2小时时，将培养液 离也分离，回收菌体。将由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液制备的蛋白溶液进行聚丙 帰醜胺凝胶电泳，结果观察到依赖于IPTG添加的目标大小（约101. IkDa)的条带，从而确 认了目柄蛋白表达。
[008引 < 精制〉
[0087] (1)向离也管（1000ml)中添加表达ADF3Kai-Large-NR甜1蛋白的大肠杆菌的菌 体约50g和缓冲液AI(20mMTris-肥l，抑为 7.4)300ml，用混合机aKA公司制"T18basic ULTRA TURRAX"，2级）将菌体分散，然后用离也分离机（Kubota制的"Model 7000")进行 离也分离（ll〇〇〇g、l〇分钟、室温），弃去上清。
[0088] (2)向通过离也分离得到的沉淀物（菌体）中添加300ml缓冲液AI和3ml的0. 1M 的PMSF(用异丙醇溶解），用上述IKA公司制的混合机（2级）分散3分钟。之后，用高压匀 浆机佑EA化ro Saovi公司制的"Panda Plus 2000")将菌体重复破碎3次。
[0089] 做在经破碎的菌体中加入含有3w/v% SDS的缓冲液B(50mM Tris-肥UlOOmM 化Cl、抑为7. 0)300血，用上述IKA公司制的混合机（2级）使其充分分散后，用振荡器 (TA口EC公司制、200巧m、37°C )揽拌60分钟。之后，用上述Kubota制的离也分离机进行离 也分离（11000g、30分钟、室温），弃去上清，得到SDS洗涂颗粒（沉淀物）。
[0090] (4)将SDS洗涂颗粒用含有1M氯化裡的DMS0溶液息浮，使得达到lOOmg/mL的浓 度，在80°C下热处理1小时。之后，用上述Kubota制的离也分离机进行离也分离（llOOOg、 30分钟、室温），回收上清。
[00川 妨准备相对于回收的上清为3倍量的己醇，向己醇中加入回收的上清，在室温 下静置1小时。之后，用上述Kubota制的离也分离机进行离也分离（11000g、30分钟、 室温），回收凝聚蛋白。接着，用纯水洗涂凝聚蛋白，通过离也分离回收凝聚蛋白，重复 该工序3次，然后用冷冻干燥机将水分除去，回收冻干粉。得到的冻干粉中的目标蛋白 ADF3Kai-Large-NR甜 1(约 56. IkDa)的精制度通过使用 Totall油（nonlinear dynamics ltd.)对粉末的聚丙帰醜胺凝胶电泳（CBB染色）的结果进行图像解析来确认。其结果， ADF3Kai-Large-NRSHl 的精制度为约 85%。
[009引3.着色剂的制备
[0093] 计量作为着色剂的纤维用酸性染料Acid Milling Sky Blue FSE(日本化药公司 制），使得单位纤维的干燥质量（制品质量）的染料浓度达到1质量％，首先W 20质量％将 酸性染料溶解或分散到二甲基亚讽DMS0中。酸性染料易于溶解或分散在DMS0中，而完全 不溶解或分散在六氣异丙醇（HFIP)中。在使酸性染料溶解的DMS0液；5质量％中加入六 氣异丙醇（HFIP) ;95质量％进行混合。DMS0和HFIP为使蚕丝蛋白粉末和蛛丝蛋白来源的 多肤粉末溶解的胶浆溶剂。
[0094] 4.纺丝液（胶浆液）的制备
[009引 （1)实施例1-5
[0096] 实施例1-5中，计量蚕丝蛋白冷冻干燥后的粉末和蛛丝蛋白来源的多肤冷冻干燥 后的粉末，W下述比例的合计粉末浓度使它们溶解，制成胶浆液。用于制成胶浆液的溶剂使 用 DMS0。
[0097] (a)蚕丝 100%、蚕丝：蛛丝=75 ;25,6. 3 (w/w) %
[0098] (b)蚕丝：蛛丝=50 ;50, 7. 5 (w/w) %
[0099] (C)蚕丝：蛛丝=25 ;75,8. 6 (w/w) %
[0100] (d)蛛丝 100%，12. 9 (w/w) %
[0101] 胶浆液用振荡器溶解16小时后，除去杂质和泡，制成纺丝液（胶浆液）。胶浆液的 溶液粘度为4500cP (厘泊）。
[0102] (2)比较例 1-2
[0103] 比较例1-2除了未加入染料W外，与实施例1-5同样地制成纺丝液（胶浆液）。胶 浆液的溶液粘度为4500CP (厘泊）。
[0104] 5.纺丝工序
[0105] 纺丝工序使用图3所示的方法。首先，将纺丝液（胶浆液）填充到滚筒中，用注射 器粟从0. 2mm直径的喷嘴在100质量％甲醇凝固液中制作未拉伸丝。挤出速度设为2. 0? 2. 5ml/h。使凝固液槽的长度为400mm、使热水浴拉伸槽的长度也为400mm，凝固液槽中的拉 伸倍率为1. 5倍、热水浴拉伸槽中的拉伸倍率为2倍。
[0106] 6.拉伸工序
[0107] 纺丝工序使用图2B所示的方法。将上述得到的拉伸丝用干热板进一步进行干热 拉伸。干热板的长度为500mm、拉伸倍率为1. 05?1. 5倍。拉伸温度如下所述。
[010引（a)蚕丝 100%、蚕丝：蛛丝=75 ;25，16(TC
[0109]化）蚕丝：蛛丝=50 ;50，170°C
[0110] (c)蚕丝；蛛丝=25 ;75，18(TC
[0111] (d)蛛丝 100%，180°C [011引 7.物性测定
[0113] (1)使用光学显微镜求出纤维的直径。
[0114] (2)在温度为25C、相对湿度为60%的气氛温度下使用牵引试验机（岛津公司制 小型台式试验机EZ-巧测定纤维的强度（应力）、初始弹性模量（测定20点的最大斜率。 W 50msec间隔进行测定，将W 20点间隔进行斜率计算时的最大斜率作为初始弹性模量）， 测定伸长率，算出初性。将样品贴到用厚纸制作的框架上，在夹具间距离为20mm、牵引速度 为10mm/分钟下进行。测力传感器容量为1N、夹具为clip式。测定值取样品数n = 5的平 均值。初性的算出式如下所述。
[01 巧]圧/ (f2 X 31 X L) X 1000](单位
[0116] 其中：
[0117] E;破坏能量（单位J)
[0118] R ;纤维的半径（单位；mm)
[0119] 31 :圆周率
[0120] L ;牵引试验测定时的夹具间距离；20mm
[012。 （3)纤维的比重测定向外委巧一般财团法人Kaken Test Center进行分析，基于 JIS L 1015浮沉法进行测定。实施例5样品的比重为1.34。
[0122] 8.溶剂残量测定
[0123] 在实施例33中测定溶剂残量。准备作为内部标准的1，2-二氯己焼-甲酸溶液浓 度为31(K)ppm(0.00310mg/ml)。将蛋白溶液（10ml甲酸中溶解有0. Ig纺前染色纤维的蛋白 溶液）500y 1与内部标准溶液500y 1混合。进而，同量程度地加入用于H-NMR测定的己膳 気化溶剂，稀释至约2倍，进行H-NMR测定（NMR的机型JE0L公司JNM-ECX 100)。比较内 部标准试样1，2-二氯己焼的H-NMR积分强度与DMS0的H-NMR积分强度。标准曲线的作成 为制作化pm?3000ppm的DMS0-甲酸溶液，按照上述操作流程制成标准曲线。通过与标准 曲线进行比较，求出蛋白溶液中的DMS0浓度。DMS0浓度测定使用巧化公司制、核磁共振装 置（NMR)。
[0124] 实施例1-5、比较例1-2的条件和结果一并示于表1。
[0125] 表 1
[0126]

【权利要求】
1. 一种纺前染色蛋白纤维，其特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质量％时蚕丝蛋 白为0?100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100?0质量％的纺前染色蛋白纤维，其中， 所述纺前染色蛋白纤维含有纺前染色色素。
2. 根据权利要求1所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素为选自染料和 颜料中的至少一种纺前染色色素。
3. 根据权利要求1或2所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素为选自酸性 染料、碱性染料、荧光染料、直接染料、分散染料、植物色素、食品用天然色素和炭黑中的至 少一种纺前染色色素。
4. 根据权利要求1?3中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色色素的 存在量相对于蛋白纤维100质量％为〇. 1?2质量％。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤 维的直径为5?200 ii m的范围。
6. 根据权利要求1?5中任一项所述的纺前染色蛋白纤维，其中，所述纺前染色蛋白纤 维中含有选自碱金属卤化物、碱土类金属卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸钠中的至少 一种无机盐。
7. -种纺前染色蛋白纤维的制造方法，其特征在于，其为当将蛋白纤维记为100质 量％时蚕丝蛋白为0?100质量％、蛛丝蛋白来源的多肽为100?0质量％的纺前染色蛋 白纤维的制造方法， 其中，将纺前染色色素预先溶解或分散到纺丝液所用的溶剂中或者溶解或分散到二甲 基亚砜中制成着色液，在所述着色液中加入纺丝液所需量的溶剂，在所述溶剂中加入蛋白 粉体并溶解，制成纺丝液，进行湿式纺丝或干湿式纺丝。
8. 根据权利要求7所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，将进行了所述湿式纺 丝的纺前染色蛋白纤维的未拉伸丝至少在干热下进行加热拉伸。
9. 根据权利要求8所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述干热加热拉伸的 条件为160°C以上、拉伸倍率为1. 05?4倍。
10. 根据权利要求8或9所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，在所述干热加热 拉伸之前，预先进行热水浴拉伸。
11. 根据权利要求10所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述热水浴拉伸的 条件为30?90°C、拉伸倍率为1. 05?6倍。
12. 根据权利要求7?11中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺 前染色色素为选自染料和颜料中的至少一种纺前染色色素。
13. 根据权利要求7?12中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺 前染色色素为选自酸性染料、碱性染料、荧光染料、直接染料、分散染料、植物色素、食品用 天然色素和炭黑中的至少一种纺前染色色素。
14. 根据权利要求7?13中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺 前染色色素相对于蛋白100质量％添加〇. 1?2质量％。
15. 根据权利要求7?14中任一项所述的纺前染色蛋白纤维的制造方法，其中，所述纺 丝液使用在作为溶解蛋白纤维的溶剂的二甲基亚砜中含有选自碱金属卤化物、碱土类金属 卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸钠中的至少一种无机盐的溶剂。
【文档编号】D01F4/00GK104395511SQ201380034158
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2012年6月28日
【发明者】石川瑞季, 关山和秀 申请人:丝芭博株式会社