一种制备纳米银的生物方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备纳米银的生物方法，采用自主分离筛选的真菌菌株半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG?1进行培养，利用其菌体在营养缺乏的纯净水环境中分泌的产物，还原硝酸银得到纳米银粒子，再以简单的离心处理获得纳米银粒子的沉淀。本发明方法操作简单，条件温和，复合绿色生态的发展趋势。
【专利说明】
一种制备纳米银的生物方法
技术领域
[0001]本发明属于食品保鲜材料领域，具体涉及一种制备纳米银的生物方法。
【背景技术】
[0002]近年来，关于合成金属纳米粒子的研究很多。纳米粒子是指尺寸在I?10nm间的粒子，处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，具有独特的物化性能和光电性能，在电子学、光学、化工陶瓷、生物和医药等诸多领域都得到了广泛的应用。人类很早就认识到银具有广谱杀菌作用，并用来杀菌消毒，因此在众多的纳米材料中，纳米银(AgNPs)的研究最为广泛、深入，有关纳米银抗菌活性的报道层出不穷，除此之外纳米银还具有抗病毒、抗肿瘤等生物活性，而且经细胞毒性实验、动物实验，证明纳米银基本属无生物毒性的材料，使用安全，可用以解决食品工业中普遍存在的保鲜防腐问题。
[0003]AgNPs制备方法多种多样，主要有物理法、化学法和生物法三大类。物理或化学还原法因为所需实验条件简单、成本低、节能等优点而得到很好的应用，目前在商业性规模生产中也大多采用这些方法，但其中所涉及到的产物稳定性和毒性试剂残留的问题很受争议，由于所用的化学试剂在一定程度上对人体和环境都有危害，并需要添加稳定剂防止纳米粒子聚合，而大多数稳定剂或分散剂都具有致癌性，因此限制了 AgNPs在医学、食品等领域的应用。而采用生物材料体系合成纳米微粒，具有很多优点，如在生物合成过程中控制温度、PH等简单操作就可以控制产物的物理特性，如大小和单分散度等，因此，发展安全、绿色、经济的生物法制备AgNPs具有很大的研究价值，而采用生物材料体系合成纳米微粒正是实现生态友好及安全可靠目标的一种良好途径。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，提供一种制备纳米银的生物方法，以克服现有技术的不足。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0006]—种制备纳米银的生物方法，该方法包括如下步骤:
[0007](I)将真菌菌株接种培养，收集并洗涤菌体；
[0008](2)菌体于纯净水中浸泡得到菌体浸泡液；
[0009](3)向步骤(2)中得到的菌体浸泡液中加入适量的AgNO3溶液；
[0010](4)室温静置；
[0011](5)收集纳米银粒子。
[0012]其中，
[0013]步骤(I)中，所述的真菌菌株为半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG-1 ,CGMCCN0.11127，记载在中国专利201510619009.5中。
[0014]步骤(I)中，所述的真菌菌株接种培养及收集菌体的步骤如下:
[0015](A)真菌培养:将斜面保存的半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG-1接种到YPD(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)培养液中，100?120rpm(优选120rpm)、25?28°C(优选25 °C)培养4?6天(优选5天)，得到发酵液；
[0016](B)收集菌体:将步骤(A)得到的发酵液，4层医用纱布过滤分离菌体和发酵液，菌体用去离子水洗涤至滤过液无颜色，收集湿菌体。
[0017]步骤(2)中，所述的菌体于纯净水中浸泡得到菌体浸泡液，具体条件为:纯净水的用量为5?6ml/g菌体，室温放置，浸泡时间为40?50h，优选48h。浸泡结束后以4层纱布或滤纸过滤，收集滤过的清液，即为菌体浸泡液。
[0018]步骤⑶中，所述的加入适量的AgNO3溶液，可事先配制1mM AgNO3溶液，按一定比例与菌体浸泡液混合，使其终浓度为0.9?1.1mM，优选ImM。
[0019]步骤(4)中，所述的室温静置，其条件为:室温，自然光照，放置时间48?72h(优选60h)o
[0020]步骤(5)中，所述的收集纳米银粒子，其条件为:11000?12000rpm(优选12000rpm)，离心20?25min(优选25min)，所得沉淀即为纳米银粒子
[0021 ]有益效果:纳米银具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，目前在很多领域都有广泛应用，纳米银的制备方法很多。物理法简单，所得产品杂质少，但是对仪器设备要求较高，生产费用昂贵。化学法则需要使用各种还原剂、络合剂、保护剂等来控制粒子尺寸、形貌及稳定性，容易造成化学试剂的残留。本发明采用的生物法操作简单，经济可行，既不需要昂贵精密的设备，也不需要使用有害试剂，整个过程非常绿色环保。
[0022]1、本发明采用菌株半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG-1的菌体细胞在营养缺乏的纯净水环境中分泌的产物作为还原剂，制备纳米银粒子。
[0023]2、本发明采用真菌分泌的产物作为一种生物催化剂制备纳米银，条件温和，操作简单，是一种生态友好及安全可靠的途径。
[0024]3、本发明所采用的制备和收集纳米银粒子的方法均不需要使用特殊设备和试剂，成本低。
[0025]4、本发明所采用的方法不需要添加稳定剂防止纳米粒子聚合，既简化了操作，又减少了杂质和有害试剂残留。
【附图说明】
[0026]图1菌体浸泡液与硝酸银溶液反应体系的溶液外观。
[0027]图2菌体浸泡液与硝酸银溶液反应体系的紫外-可见扫描光谱图
[0028]图3纳米银粒子的透射电镜图像
【具体实施方式】
[0029]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0030]实施例1:真菌的培养。
[0031 ] 半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG-1菌种，4°C保存于I3DA斜面。用接种针取菌丝接种到YB)培养液中，120rpm,25 °C培养5天，得到活化发酵液;取活化发酵液，按10 %接种量于新的YI3D培养液中120rpm ,25 °C培养4天。
[0032]YPD配方为:酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸馈水100mL，121°C灭菌20min。
[0033]实施例2:菌体分离
[0034]取实施例1中获得的乳酸菌真菌培养物，用4层医用纱布过滤，弃去滤过液，保留菌体。菌体继续用去离子水洗涤至滤过液无颜色，得到湿菌体。
[0035]实施例3:菌体浸泡液的制备
[0036]取实施例2中获得的真菌菌体10g，添加纯净水500ml，室温和自然光照条件下放置48h。再以4层纱布或滤纸过滤，收集滤过的清液，即为菌体浸泡液。
[0037]实施例4:纳米银的制备。
[0038]称取硝酸银AgNO3 1.69g，以10ml纯净水溶解，配制成浓度为10mM的AgNO3溶液。取99ml实施例3中获得的菌体浸泡液，加入上述10mM的AgNO3溶液lml，使AgNO3终浓度为ImM0
[0039]室温、自然光照条件下放置60h，可见溶液颜色变为棕褐色，见图1所示。
[0040]实施例5:纳米银粒子的收集。
[0041]实施例(4)中得到的纳米银溶液，在12000rpm条件下离心25min，所得沉淀即为纳米银粒子。
[0042]以纯净水重新悬浮，进行紫外-可见光谱扫描以及透视电镜观察，结果见图2、图3。
[0043]图2为反应体系的紫外-可见扫描光谱图，在440-450nm范围内有纳米银粒子的特征性等离子吸收峰。图3为纳米银粒子的透射电镜图像，制备的纳米银粒子为球形，直径范围2-50nm。调节放大倍数至一定程度，可见纳米银粒子表面的晶格条纹。
【主权项】
1.一种制备纳米银的生物方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)将真菌菌株接种培养，收集并洗涤菌体； (2)菌体于纯净水中浸泡得到菌体浸泡液； (3)向步骤(2)中得到的菌体浸泡液中加入适量的AgNO3溶液； (4)室温静置； (5)收集纳米银粒子。2.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的真菌菌株为半乳糖地霉Galactomycesgeotrichum KG-1 ,CGMCC N0.11127。3.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的真菌培养和收集菌体通过如下步骤获得: (A)真菌培养:将斜面保存的半乳糖地霉GalactomycesgeotrichumKG-1接种到YPD培养液中，100?120rpm、25?28 °C培养4?6天，得到发酵液； (B)收集菌体:将步骤(A)得到的发酵液，4层医用纱布过滤分离菌体和发酵液，菌体用去离子水洗涤至滤过液无颜色，收集湿菌体。4.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的菌体于纯净水中浸泡得到菌体浸泡液，具体条件为:纯净水的用量为5?6ml/g菌体，室温放置，浸泡时间为40?50h，优选48h。浸泡结束后以4层纱布或滤纸过滤，收集滤过的清液，即为菌体浸泡液。5.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的加入适量的AgNO3溶液，其终浓度为0.9?1.1mM。6.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的室温静置，其条件为:室温，自然光照，放置时间48?72h。7.根据权利要求1所述的制备纳米银的生物方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的收集纳米银粒子，其条件为:11000?12000rpm，离心20?25min，所得沉淀即为纳米银粒子。
【文档编号】B82Y40/00GK105935781SQ201610395606
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】刘小莉, 周剑忠, 刘源, 夏秀东, 李莹, 王英, 张丽霞, 黄自苏
【申请人】江苏省农业科学院