专利名称：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物催化和纳米技术领域，具体涉及一种制备磁性纳米颗粒固定化碱 性蛋白酶的新方法，该方法在动植物蛋白、动植物油脂和植物纤维素等生物质原料高效绿 色转化成多肽、脂肪酸酯、糖等产品等领域有着广泛的应用。
背景技术：
酶是一种天然的生物催化剂，催化效率极高，反应专一性强，在食品加工、医药等 产业有着极为广泛的应用。然而，由于天然酶稳定性差，不易回收再利用，阻碍了它在工业 生产中的应用。近年来基于酶的固定化技术制备固定化生物酶，应用于生物质绿色转化领 域得到越来越多的关注。与传统的游离酶相比，固定化酶具有稳定性好，可以回收利用以降 低成本低等优点，在当前生物检测、绿色转化等领域获得了 一定的应用。对酶进行固定化处理就要求既要很好的保持酶的天然活性、增强天然酶的稳定 性，又要便于与反应液分离达到重复利用的效果。在现有的固定化技术中，固定化后的酶在 储存或者反应过程中容易泄露、失活，稳定性不好，回收利用的过程比较繁琐。因此研究一 种能防止酶的泄露、提高酶的稳定性、能快捷方便回收利用的固定化酶的制备方法在生物 质绿色转化领域中将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶及其制备方法和其 在生物质绿色转化中的应用。本发明制得的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有与游离碱性蛋白酶相媲美的 酶学性质，并能够在外加磁场的作用下方便快捷的实现回收再利用。实现本发明的技术方案是(1)磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备首先采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性!^e3O4纳米颗粒(也可以用商品化 的磁性狗304纳米颗粒)；再利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷((3-aminopropl) triethoxysilane,APTES)修饰!^e3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入 游离的氨基末端；最后以双功能试剂双硫氰苄(l，4-phenylene dllsothlocyanate, PDC) 将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的!^e3O4纳米颗粒上，得到磁性纳米颗粒固定化碱 性蛋白酶；(2)将得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶用于生物质绿色转化首先以酪素作为底物，分析了磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的相对酶活力、最 适反应条件、贮存稳定性、可重复利用性，最后将其应用到菜籽饼粕的生物催化中，进行水 解度和电泳分析。本发明用磁性纳米颗粒为载体，双功能试剂为偶联剂制备磁性纳米颗粒固定化蛋 白碱性蛋白酶，该磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有很好的稳定性、酶不易泄漏、直接用外加磁场进行回收利用，方便快捷，我们基于磁性纳米颗粒制备了磁性纳米颗粒固定化碱 性蛋白酶，并应用于生物质绿色转化中，催化酪素和菜籽饼粕的水解，检测其催化活性，得 到了很好的效果。本发明为固定化酶技术及生物质绿色转化提供了一种新思路。
图1 磁性纳米粒子与对硝基苯甲醛反应后水解产物的紫外图谱，曲线a是修饰 APTES的四氧化三铁与对硝基苯甲醛反应后水解产物的紫外图谱，在处的吸收值是 0. 391，表面氨基含量98. 48n mol/mg ；曲线b是裸的四氧化三铁与对硝基苯甲醛反应后水 解产物的紫外图谱。图2 室温下!^e3O4 (a)、APTES-I^e3O4 (b)、APTES-I^e3O4-E (c)的磁滞回线；图3 不同量的碱性蛋白酶在磁性纳米颗粒载体上的固定.碱性蛋白酶的浓度为 0. 6U/ μ 1 ；APTES-Fe3O4 浓度固定为 3. 6mg/ml ；图4 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的最适反应温 度；图5 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的最适反应pH ；图6 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的贮存稳定性；图7 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶可回收利用的示意图；图8 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶降解2S蛋白和菜籽饼粕得到的产物的电泳 图。从左至右依次为I 游离碱性蛋白酶酶解2S蛋白；II :2S蛋白；III 游离碱性蛋白酶 酶解菜籽饼粕；IV 菜籽饼粕；Marker ；V 磁性纳米颗粒固定化碱性酶酶解菜籽饼粕(固定 化酶冰箱放置20天，50mg菜籽饼粕于80°C水浴30min助溶)；VI 磁性纳米颗粒固定化碱 性蛋白酶酶解菜籽蛋白(新鲜的固定化酶，50mg菜籽饼粕超声助溶)；VII:磁性纳米颗粒 固定化碱性蛋白酶酶解菜籽蛋白(新鲜的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，50mg菜籽饼粕 于80°C水浴30min助溶)；VIII 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶酶解2S蛋白)。
具体实施例方式实施例1下面以Iml碱性蛋白酶(0. 6U/ μ 1)固定在Iml磁性纳米颗粒(3. 6mg/ml)上为例 对本发明中磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶制备的实施作具体说明。(1)配制!^eSO4 (0. 06M) ^P FeCl3 (0. 1M)的混合溶液，用盐酸调整pH值为1. 5，氩气 保护，逐滴滴加25 %的氨水并剧烈搅拌，直至pH上升至9，继续通入氩气，搅拌0. 5h,之后用 磁铁分离!^e3O4颗粒，用水洗5遍，乙醇洗2遍，最终得到的颗粒分散在无水乙醇中，颗粒浓 度大约是 3. 45mg/ml (0. 015M)。(2)取出25ml上述!^e3O4的乙醇溶液，分散在50ml乙醇和75ml水中，通入氩气以 排除空气，然后超声0. 5h,加入适量APTES，搅拌40h后磁性分离，用无水乙醇洗5遍，分散 在25ml乙醇中，得到氨基修饰的纳米磁性颗粒(APTES-Fe3O4)，浓度为3. 6mg/ml，分别取2ml Fe3O4和anl APTES-Fe3O4与对硝基苯甲醛反应，定量检测APTES-Fe3O4表面的氨基含量，结 果如图1，APTES-Fe3O4表面的氨基含量为98nm/mg。(3)将步骤(2)中得到的APTES-Fe3O4分散在DMF中，取出Iml该溶液，加入ImlPDC的DMF溶液(浓度为2mg/ml)，摇床振荡反应池，之后用DMF、甲醇、丙酮、硼酸缓冲液 中(0. 2M，ρΗΙΟ. 5)各洗一遍，再加入Iml浓度为0. 6U/ μ 1的碱性蛋白酶酶液，振荡12h， 之后用硼酸缓冲液洗5遍，最后将得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(E-APTES-Fe3O4) 分散在硼酸缓冲液中，浓度为8. 5mg/ml。用振动磁强计(VSM)表征狗304、APTES-Fe3O4和 E-APTES-Fe3O4的磁性性能，结果如图2，三者的剩磁和矫顽力都较小，接近于超顺磁性，有 利于对E-APTES-Fe3O4的回收利用；不同量的碱性蛋白酶在磁性纳米颗粒上的固定结果见 图3，当加酶量为700ul时磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的酶活力趋于饱和。实施例2下面以本发明的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶催化酪素和菜籽饼粕的水解为 例对该磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在生物质绿色转化中的应用的实施做具体说明。(1)磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶对酪素催化活性的检测采用福林试剂显色的方法检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的催化活性。取出 Iml磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶液，40°C预热2min，加入Iml酪素(10mg/ml)，40°C水 浴反应IOmin,加入2ml三氯乙酸(0. 4mol/L)，混勻，5000rad离心lOmin，取出Iml上清，加 Λ 5ml Na2CO3溶液(0. 4mol/L)，再加入Iml福林试剂(稀释一倍)，40°C水浴显色20min, 于680nm波长，用IOmm比色皿测出吸光度值，根据公式X = AXKX V/TXη计算出样品的 酶活力(X-样品的酶活力(本实施例中为2776. 1832IU/ml) ；A-样品平行试验的平均吸光 度(用紫外分光光度计检测，本实施例中为0. 427) ；K-吸光常数(以不同浓度酪氨酸为标 准液，用紫外分光光度计检测其吸光度做标准曲线，根据标曲的线性方程计算所得，本实施 例中为96. 75) ；V-反应试剂的总体积(本实施例中为細1) ；T-反应时间(本实施例中为 IOmin) ；η-稀释倍数(用硼酸缓冲液稀释磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的稀释倍数，本 实施例中为168))。在25V _75°C范围内研究了磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的最适反应温度催 化酪素反应时，调节催化反应温度，从25°C开始，每上升10°C测一次磁性纳米颗粒固定化 碱性蛋白酶的催化活性，结果见图4，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的 最适反应温度都在60°C _65°C之间，但前者比后者的最适反应温度略微高一点，说明该磁 性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的热稳定性要比游离碱性蛋白酶好。在pH 6-12之间研究磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的最适 反应pH 调节缓冲液的pH，检测不同pH时催化酪素反应的催化活性，结果见图5，随着pH 的升高，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的酶活力都相应升高，当PH为 10. O时达到最大，之后继续提高PH，两者的酶活力却迅速下降，固定化酶和游离酶的最适 反应pH基本保持一致，都在ρΗΙΟ左右，且在pH8-10范围内，均能保持较高的催化活性。
检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的储存稳定性将磁性纳 米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶放置在4°C的冰箱中，每隔一段时间，取出一部 分样品测其酶活力，结果见图6，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶比游离碱性蛋白酶具备更 好的贮存稳定性，能够更好的保持酶活力，并在较长时间内相对稳定。 检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的操作稳定性即重复利用将磁性纳米颗粒 固定化碱性蛋白酶与酪素反应后，磁场分离，再重新反应，重复反应7次，结果见图7，在循 环7次之后，酶活力依旧能保持原有的52%左右，且逐步趋于稳定，说明磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶有较好的回收利用能力。(2)磁性纳 米颗粒固定化碱性蛋白酶对菜籽饼粕水解度的检测采用水合茚三酮法来检测固定化酶对菜籽饼粕的水解度。将50mg菜籽饼粕溶解 在3ml磷酸缓冲液中(ρΗΙΟ. 5)，80°C水浴30min帮助其溶解，再加入2ml磁性纳米颗粒固定 化碱性蛋白酶，50°C水浴反应2h后，将混合溶液放入沸水浴15min，使磁性纳米颗粒固定化 碱性蛋白酶失活。将混合溶液离心取上清，稀释一定倍数。取出2ml稀释液，加入Iml茚三 酮的乙醇溶液，混勻，沸水浴15min后，待其冷却到室温，加入5ml 45%的乙醇，静置15min 后，于570nm波长处测出其吸光度值，根据公式水解度=水解液中的总氨基氮量/水解原料 中的总氮量X 100%计算出磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶对菜籽蛋白的水解度，结果见 图8，从图中可以看到，菜籽饼粕中蛋白呈现一个较宽的分布(通道IV)，其中含有较多的大 分子量蛋白，这一点从2S蛋白的电泳图中也可以得到证实(通道II)。加入游离的碱性蛋 白酶后，可发现无论是菜籽饼粕(通道III)还是2S蛋白(通道I)，原本大分子蛋白所在的 条带都消失了，只在小于IOKD的地方出现了条带，这说明两者中的大分子蛋白被碱性蛋白 酶降解了。同样，在固定化酶催化体系中也观察到了同样的结果。可以看到，2S蛋白经固定 化酶处理后大分子蛋白的条带消失了(通道VIII)。而无论是新鲜制备的固定化酶(通道 VII)还是存放了 20天的固定化酶(通道V)，均未检测到大分子蛋白的条带。这说明菜籽 饼粕中的大分子蛋白确被碱性蛋白酶降解了，最终的酶解液里可能只有小分子的多肽或氨 基酸，证明我们的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有较好的催化能力。
权利要求
1.一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，其特征在于，它是利用硅烷化试剂3-氨丙 基-三乙氧基硅烷修饰Fe53O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的 氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的I^e3O4纳 米颗粒上得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶。
2.一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于利用硅烷化试剂 3-氨丙基-三乙氧基硅烷修饰!^e3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引 入游离的氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的 Fe3O4纳米颗粒上，即得到磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶。
3.权利要求1所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在生物质绿色转化中的应用。
4.权利要求1所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在菜籽饼粕的生物催化中的应用。
5.根据权利要求2所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于， 是采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性狗304纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征 在于，采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性狗304纳米颗粒的具体方法是利用 FeSO4 (0. 06M)和!^eCl3 (0. 1M)或!^e (acac) 3、狗(CO) 5 为原料合成磁性 ^304 纳米颗粒，FeSO4 和FeCl3的摩尔比为1.6 1。
全文摘要
本发明提供了一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，它是利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷修饰Fe3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的Fe3O4纳米颗粒上得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，并将该表面功能化的磁性纳米颗粒为载体固定化碱性蛋白酶应用于生物质绿色转化中。本发明简单、易行，并能通过外加磁场迅速便捷的对生物催化剂进行回收利用，有助于生物催化反应连续化规模化生产的实现。
文档编号C01G49/08GK102108353SQ20091027340
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者姜达海, 李菊芳, 董绪燕, 赵元弟, 金欣, 陈洪, 黄平英 申请人:华中科技大学