[0041]2、蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
[0042]将2.5ml孢子悬液接种至实施例2制得的培养基中，在温度22°C，150r/min条件下振荡培养21d。
[0043]实施例6:蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用。
[0044]1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号:CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9%的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25°C恒温培养7d。再加入5ml0.9%的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为8.0X 16个/ml。
[0045]2、蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
[0046]将2.5ml孢子悬液接种至实施例3制得的培养基中，在温度27°C，180r/min条件下振荡培养28d。
[0047]对比例1:
[0048]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L,溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养基水相。
[0049]2)将步骤I)中的发酵培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入0.25g
腺嘌呤，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
[0050]3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号:CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9%的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25°C恒温培养7d。再加入5ml0.9%的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0X 16个/ml。
[0051]4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
[0052]将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25°C，160r/min条件下振荡培养25d。
[0053]对比例2:
[0054]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L,溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵基础培养基水相。
[0055]2)将步骤I)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入
2.2mm液面高度的花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油等量混合的甘油酯，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
[0056]3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号:CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9%的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25°C恒温培养7d。再加入5ml
0.9%的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0X 16个/ml。
[0057]4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
[0058]将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25°C，160r/min条件下振荡培养25d。
[0059]对比例3:
[0060]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L,溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵基础培养基水相。
[0061]2)将步骤I)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
[0062]3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号:CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9%的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25°C恒温培养7d。再加入5ml
0.9%的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0X 16个/ml。
[0063]4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
[0064]将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25°C，160r/min条件下振荡培养25d。
[0065]发酵液虫草素含量测定
[0066]实施例4-6和对比例1-3的发酵液中虫草素的含量通过高效液相色谱法测定。发酵液离心取上清液用纯水稀释6倍，振荡混匀，检测虫草素。色谱条件:色谱柱:UltimateAQ-C18(4.6mmX250mm，5 μπι)，流动相:甲醇:磷酸盐溶液(10mmol/L KH2PO4溶液)=15:85，柱温30°C，流速lml/min，进样量20 μ L，检测波长为260nm。
[0067]结果:实施例4制得的培养基分别比对比例1-3的虫草素含量增加约为50.0%,66.7%和 87.5%o
【主权项】
1.一种蛹虫草发酵液体培养基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温和水的基础培养基，其特征在于，它还包括腺嘌呤和甘油酯。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，腺嘌呤浓度为4.05?6.76g/Lo
3.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的甘油酯为花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油和三油酸甘油酯中的任意一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1或3所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，甘油酯加入量为高出基础培养基液面2?3_。
5.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的基础培养基配方为:葡萄糖40?50g/L，酵母膏3?10g/L，蛋白胨5?15g/L，磷酸二氢钾0.2?1.0g/L，磷酸氢二钾0.2?L Og/L，硫酸镁0.2?L Og/L，吐温800.5?5.0g/L，溶剂为水，ρΗ5.5?6.00
6.根据权利要求5所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的基础培养基配方为:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，pH5.8。
7.权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤: 1)配制基础培养基； 2)将步骤I)中的基础培养基倒入发酵容器内，加入腺嘌呤，再加入甘油酯，经高压蒸汽灭菌，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，腺嘌呤浓度为4.05?6.76g/L ;甘油酯加入量为高出基础培养基液面2?3_。
9.权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基在发酵生产虫草素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基中接种蛹虫草，对于每IL培养基中接种浓度为5.0X 106-8.0X 16个/ml的蛹虫草孢子悬液50ml，置于摇床中进行培养，培养温度为22?27°C，摇床转速为150?180r/min，培养时间为21?28do
【专利摘要】本发明公开了一种蛹虫草发酵液体培养基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温和水的基础培养基，它还包括腺嘌呤和甘油酯。本发明还公开了上述蛹虫草发酵液体培养基的制备方法与应用。本发明提供的培养基是将传统液体培养基，加入腺嘌呤和脂肪酸甘油酯后，在温度22-27℃、转速150-180r/min条件下培养21-28d，发酵蛹虫草，结果发现发酵液中虫草素的含量增加了50％-87.5％，本发明方法具有很高的实际应用价值。
【IPC分类】C05G3-00, A01G1-04
【公开号】CN104860756
【申请号】CN201510234290
【发明人】汤佳鹏, 葛彦
【申请人】南通大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月8日