专利名称：小红参醌及其衍生物,它的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小红参醌及其衍生物，它的制备方法与应用。
心肌缺血性疾病目前仍是威胁人类健康的主要疾病之一，虽然已有一些临床治疗药物出现，但效果远不理想。小红参作为一味传统中药，已有长期的民间使用经验，且临床及药理实验证实确实对某些心肌缺血性疾病有疗效。
1986年王淑仙等(中草药，7(18)19(1986))以生物发光法(Biolnmisescemt melnod)测定了小红参、茜草和丹参提取物对小鼠心肌和脑组织中ATP含量的影响，实验观察到健康小鼠腹腔注射小红参IIA5-9mg/只，15-30分钟内可使心脑组织中A77含量增加，小鼠静脉注射小红参IIA-6mg/只，10分钟内也可使心肌和脑组织中ATP含量明显增加。
小红参提取物虽然经初步临床和药理证明对心肌缺血性疾病有疗效，但并不清楚什么成分有效，无法保证有效成分含量，临床用药剂量及治疗效果，限制了其应用和发展。
本发明的小红参醌，为式I的化合物及其甲基化衍生物 (式I)其中，R为H、式II的基团或式III的基团 式II 式IIIR为H时的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10蒽醌；R为式II基团时的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙；R为式III基团时的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙。
本发明的另一个目的是提供一种从中药小红参中提取R为H、式II的基团或式III的基团时式I化合物的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种自中药小红参中提取小红参醌的方法，包括以下步骤1)将小红参(Rubia ynananensis(Franch.)Diels)按重量比为1∶8-12的比例溶解于蒸馏水中，用酸，优选浓盐酸及冰醋酸，调节溶液的pH至2.5-3.5，3℃-12℃放置过夜；2)过滤，得滤渣及滤液；3)依次用低分子量醇，优选甲醇、乙醇或正丁醇，和丙酮回流提取所得滤渣，甲醇和丙酮的体积分别为上述用于溶解小红参蒸馏水体积的1/3-1/5；4)合并上述所得的甲醇和丙酮提取液，将甲醇-丙酮溶解部分进行硅胶柱色谱；5)依次用环己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脱硅胶柱，循环12-14次，合并洗脱液；6)3℃-12℃放置过夜，得到析出的结晶，即取代基R为H时的式I化合物；7)收集合并上述第5)步中，依次用环己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脱硅胶柱第13-16次循环的洗脱液；8)3℃-12℃放置至结晶析出，抽滤，得到滤饼；9)用1∶1∶1的甲醇-无水乙醇-四氢呋喃将滤饼溶解，3℃-12℃放置至结晶析出；10)抽滤，干燥，将所得的混合物用离心薄层色谱分离，依次用10∶1、8∶1、6∶1和4∶1的二氯甲烷-甲醇洗脱；11)收集离心薄层色谱的第II峰；12)干燥，即得取代基R为式II时的式I化合物；13)收集上述离心薄层色谱的第III峰，干燥，即得取代基R为式III时的式I化合物。
在上述方法中，所述步骤3)依次用低分子量醇和丙酮回流提取所得滤渣，所述低分子量醇和丙酮是等体积的，提取至提取液肉眼观察不到颜色；所述步骤5)合并洗脱液后，进行旋转蒸发；所述步骤6)得到析出的结晶后，进行抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，将结晶用丙酮溶解，活性碳脱色，3℃-12℃放置过夜，得到析出的结晶，抽滤并用3℃-12℃的冷丙酮洗涤滤饼，干燥得到结晶，即取代基R为H时的式I化合物。所述步骤8)得到的滤饼，将滤饼用3℃-12℃的冷丙酮洗涤后，再进入所述第9)步，用1∶1∶1的甲醇-无水乙醇-四氢呋喃将滤饼溶解后，用活性碳脱色两次，旋转蒸发，再于3℃-12℃放置至结晶析出；所述步骤10)抽滤后，用3℃-12℃的冷丙酮洗涤滤饼后再进行所述的干燥及离心薄层色谱分离。所述步骤13)收集上述离心薄层色谱的第III峰，干燥后用甲醇重结晶，再干燥，即得取代基R为式III时的式I化合物。
取代基R为H的式I化合物，可以采用化学合成的方法获得，包括以下步骤1)3，5-二羟基苯甲酸选择溴代，得2，5-二溴-3，5-二羟基苯甲酸；2)经曼尼希反应，得2，5-二溴-3，5-二羟基-4-氨甲基苯甲酸；3)在碱液中加入Al-Ni合金进行还原反应，得到3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸；4)在AlCl3存在下，使3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸和4-羟基苯甲酸进行反应，得到取代基R为H的式I化合物。
在上述化学合成式I化合物的过程中所述步骤1)的选择溴代反应是在Br2/CHCl3，25℃的条件下进行的；所述步骤2)的曼尼希反应是在33％二甲基胺(HNMe2)，37％HCHO，(乙醇)EtOH，HAc，25℃的条件下进行的；所述步骤3)是在NaOH溶液中进行的；所述步骤4)中3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的反应是在搅拌，加热到180-200℃下进行的。
本发明的再一个目的是提供以本发明的化合物为活性成分的抗心肌缺血药物。
本发明的又一目的是提供本发明的化合物在制备抗心肌缺血药物方面的用途。
本发明的药物含有治疗有效量的本发明的化合物，特别是含有2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10蒽醌、2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙或2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙的为优选。该药物用于抗心肌缺血。
在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明化合物的药用量可根据患者的年龄、体重、疾病的严重程度进行调整，日剂量一般为5-10mg/kg体重。
实验结果表明，本发明的药物不仅可以提高小鼠常压耐缺氧能力，而且在较低浓度(35μM)时即能显著地增加冠脉流量，此外，对心脏也有一定的抑制作用，这对降低心肌能量代谢和氧代谢，保护心肌均是有益的。
脑垂体后叶素能使冠状动脉收缩、痉孪从而使冠脉流量下降，引起急性心肌缺血，加之外周阻力增加，导致心脏负荷加重，在心电图上呈现缺血性变化。本发明的药物不仅在体外能对抗脑垂体后叶素诱发的离体豚鼠心脏冠脉流量减少和心率减慢，而且在体内也几乎可以完全对抗后叶素诱发的急性心肌缺血性心电改变，表明本发明的药物有抗心肌缺血、缺氧的作用。
急性心肌梗死(AMI)的主要死亡原因是严重性心率失常和泵衰竭，其发生率与心肌梗死范围密切相关，而泵衰竭又增加室性心律失常的发生率。因而寻找有效药物，在缩小心梗范围(IS)的同时改善AMI早期的心泵功能，以期降低AMI死亡率，改善其预后是AMI治疗的关键。本发明的化合物不仅能显著缩小急性心肌梗死大鼠的心梗范围，而且对心功能也有一定的改善作用。
本发明对传统的中药小红参做了全面的，系统的研究，从根本上了解清楚了小红参在治疗心肌缺血性疾病方面的本质所在，明确了有效成分的化学结构，提供了自中药小红参中提取小红参醌以及用化学合成的方式合成小红参醌的方法，并且对以小红参醌为活性成分的药物进行了较为深入的研究。本发明提取、生产小红参醌的方法简单方便，实用性强，尤其是化学合成的方法中，巧妙地采用了三氯化铝为催化剂，操作简单快速，产率高，无需色谱分离，使今后大规模生产小红参醌成为可能。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步介绍。
2)鉴定Rf0.75，系统(1)展开。
mp＞300℃元素分析C15H10O5.
理论值 c％， 66.67；H％，3.70
实测值 c％， 66.62；H％， 3.74MeOHUVλ nm217，276，312(sh)，322，422maxKBrIRv cm-13420、3411(游离-OH)，3020、3075(缔合-OHmax和/或芳-H)，2840、2921(-Me)， 1662(游离＞C＝O)，1621(缔合＞C＝O)， 1600、1590(芳环)。
1H-NMR(CD3COCD3)δ(ppm)8.09(1H，d，J＝3.5Hz)，7.50(1H，d，J＝2.4Hz)，725(1H，s)，7.21(1H，dd，J＝0.5，2.4Hz(，0.91(3H，s).
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.34(1H，s，缔合羟基质子)，11.12(1H，s，无邻位取代羟基质子)，11.07(1H，s，有邻位取代羟基质子)，8.11(1H，d，J＝8.5Hz)，7.45(1H，d，J＝2.4Hz)，7.23(1Hs)，7.22(1H，dd，J＝8.5、2.4Hz)，2.07(3H，s).
13C-NMRδ(ppm)185.41(S)，181.66(S)，162.90(S)，162.16(S)，161.91(S)，134.95(S)，131.54(S)，129.07(d)，142.62(S)，120.94(d)，117.29(S)，112.35(d)，108.41(S)，106.97(S)，7.96(S)。
13C(｀H)-NWR LRSD(远程选择质子去偶)；见附图2LR-MS(EI)m/z(％)270(｀100，M+)，252(3.1，M-H2O)，242(11.4，M-CO)，213(6.1，M-2XCO+H)，160(3.0)，(139(7.2)，121(6.9).
HR-MS(EI)M/Z(％)270.0519(100，C15H10O5)，242.0570(10.20，C14H10C4)，213.0560(4.93，C13H9O3)，185.0625(0.61，C12H9O2).
从上述分析鉴定的数据可以看出，第1)步中所得到的化合物确为取代基R为H的式I小红参醌，即2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10蒽醌。
实施例2、取代基R为式II时的式I小红参醌的分离和鉴定1)取代基R为式II时的式I小红参醌的分离收集实施例1中MAS部分硅胶柱色谱第15份，旋转蒸发浓缩至少量，5℃冰箱放置至结晶析出，抽滤并用冷丙酮(3×5ml)洗涤滤饼，用甲醇-无水乙醇一四氢呋喃(1∶1∶1)将滤饼溶解，活性碳脱色两次，旋转蒸发浓缩溶液至少量，5℃冰箱放置至结晶析出，抽滤并用冷丙酮(3×5ml)洗涤滤饼，红外干燥得一橙黄色混合物，将此混合物用离心薄层色谱(CLC)分离，依次用二氯甲烷-甲醇10∶1、8∶1、6∶1和4∶1各500ml洗脱，收集CLC-II峰(如
图1所示)，旋转蒸发浓缩至干，得黄色残渣，残渣用甲醇重结晶一次，结晶真空干燥即得取代基R为式II时的式I小红参醌300mg，该化合物为黄色针状结晶，收率为0.15％。
2)鉴定Rf0.42，系统(1)展开。
mp282-283℃(分解)[α]25D(DMSO)3-68.92℃(c＝0.74)[M]25D-297.7℃元素分析C21H28O10·1/2H2O理论值 c％， 57.14％H％，4.76％实测值 c％， 57.18％H％，5.05％NeOHUVλnm220，267，300，323，410maxKBrIRvcm-13420(-OH)、2920(-Me)1662(游离＞C＝O)，1630(缔max合＞C＝O)，1600 1575(芳环)，1055(甙键)。
1H-NMR(CD3COCD3)δ(ppm)8.12(1H，d，J＝8.5Hz)，7.54(1H，d，J＝2.4Hz)，7.48(1H，s)，7.25(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，5.20(1H，d，J＝5.2Hz 3.47-3.85(mH，m)，2.18(3H，s).
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.18(1H，s，加D2O消失，缔合-OH)，11.13(1H，s，加D2O消失，无邻位取代羟基质子)，8.03(1H，d，J＝8.5Hz)，7.43(1H，d，J＝2.4Hz)，7.38(1Hs)，7.19(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz)，5.09(1H，d J＝7.3Hz).3.16-3.72(mH，m)，2.10(3H，s).
13C-NMR δ(ppm)186.37(S)，181.60(S)，163.48(S)，161.32(S)，160.76(S)，135.28(S)，131.97(S)，129.65(d)，124.53(S)，121.42(s)，120.82(d)，112.62(d)，110.56(S)，105.64(d)，190.34(d)，77.33(d)，76.31(d)，73.24(d)，69.38(d)，，60.47(t)，8.47(q)，2Dz-NMR11H-1H COSY 见附图3LR-MS(EI)m/z(％)270(100，基峰)，252(3，85，B-H2O)，242(10.43，B-CO).213(4.39，B-2XCO+H)，168(2.16)，(139(3.86)，121(5.62).
HR-MS(EI)m/z(％)270.0532(100，C15H10O5)，242.0597(10.43，C14H10O4)，213.0555(5.59，C13H9O3)，185.0609(1.72，C12H9O)，128.0630(1.31，C10H8)
FD-MS m/z(％)866(3.51，2M+2)，434(100，M+2)，(271(6.32，M-161)。
从上述分析鉴定的数据可以看出，第1)步中所得到的化合物确为取代基R为式II时的式I小红参醌，即2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙。
实施例3、取代基R为式III时的式I小红参醌的分离和鉴定1)取代基R为式III时的式I小红参醌的分离收集实施例2中离心薄层色谱分离的CLC-III峰(如图1所示)，旋转蒸发浓缩洗脱液至干，残渣用甲醇重结晶后真空干燥得黄色粉末状化合物2mg，即为取代基R为式III时的式I小红参醌，收率为0.001％。
为了得到更多的取代基R为式III时的式I小红参醌，也可以从小红参粗提物中直接进行分离。
称取小红参1kg，溶解于10L蒸馏水中，用浓盐酸酸化至pH3，室温放置过夜，抽滤，沉淀拌入适量硅胶，红外干燥后于沙氏提取器用丙酮提取至提取液颜色极淡，回收丙酮至少量并拌入聚酰胺粉、干燥后进行聚酰胺柱色谱(聚酰胺13-40目，柱体，17×30cm)，依次用水，53％乙醇，84％乙醇及丙酮洗脱，84％乙醇洗脱部分，回收乙醇至少量，自然过滤，滤液浓缩后冰冻干燥，冰冻干燥后的样品进行硅胶柱色谱(硅胶粒度150-250目，柱体0.5×30cm)，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-丙酮(2∶1)及乙酸乙酯-甲醇(2∶1)洗脱，TLC控制收集与取代基R为式III时的式I小红参醌相同的组分，旋转蒸发浓缩洗脱液至少量，5℃冰箱放置至沉淀析出，抽滤并用冷丙酮(3×5ml)洗脱滤饼，真空干燥得取代基R为式III时的式I小红参醌2g。
此外，自聚酰胺柱色谱丙酮洗脱部分还得到取代基R为H的式I小红参醌32g，硅胶柱色谱乙酸乙酯-丙酮洗脱部分得到取代基R为式II时的式I小红参醌1.5g。
2)鉴定Rf0.20，系统(1)展开。
mp262-264℃(分解)[α])25D(DMSO)-57.27℃(C＝1.1)[M]25D-331.0℃元素分析C27H30O14·2H2O理论值c％，52.76％ H％，5.54％实测值c％，52.72％ H％，5.24％MeOH
UVλ nm219，273，288，320，410maxKBrIRv cm-13390、3250(-OH)、1680(游离＞C＝O)，1625(缔合max ＞C＝O)，1610 1585(芳环)，1056、1049(甙键)。
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.26(1H，s，缔合OH)，11.51(1H，s，无邻位取代羟基质子)，8.09(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，d，J＝2.4Hz)，7.40(1H，s)，7.3 1(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，5.41(1H，d，J＝7.38Hz5.26(1H，6s)，3.17-5.60(mH，m)，2.15(3H，s)，δ1.15(3H，s).
13C-NMR δ(ppm)186.31(S)，181.61(S)，183.51(S)，161.30(S)，160.21(S)，135.26(S)，131.92(d)，129.52(d)，124.52(S)，121.44(s)，120.64(s)，112.60(d)，110.59(S)，105.04(d)，100.22(d，J＝1716Hz)，97.50(d)，77.40(d)，77.40(d)，77.11(d)，76.42(d)，72.00(d)，70.50(d)，70,39(d)，69,55(d)，68.51(d)，60,33(t)，18,08(q)，8.74(q).
LR-MS(EI)m/z(％)270(100，B)，252(4.45，B-H2O)，242(15.65，B-CO，214(3.47，B-2XCO).FD-MS m/s(％)601(100，M123)，270(42.1，M-300)，23(100，Na+).
从上述分析鉴定的数据可以看出，第1)步中所得到的化合物确为取代基R为式II时的式I小红参醌，即2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙。
实施例4、取代基R为H的式I小红参醌甲基化衍生物的制备取代基R为H的式I小红参醌165mg溶于MeI34ml，加Ag2O粉6.5mg及甲醇少量，磁力搅拌回流加热40分钟，反应终止后滤除Ag2O，将MeI旋转蒸发浓缩至干，残渣用乙酸乙酯重结晶，抽滤并干燥得黄色针状结晶55mg。对该化合物进行下述分析，证实该化合物为2，5-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌，即取代基R为H的式I小红参醌甲基化合物。
mp212-214℃KBrIRvcm-13080、3020(缔合-OH和/或芳-H)、1670(游离＞C＝O)，max 1630(缔合＞C＝O)，1600 1570(芳环)。
1H-NMR δ(ppm)13.06(1H，s，)，8.16(1H，d，J＝8.6Hz)，7.56(1H，d，J＝2.4Hz)7.44(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，7.30(1H，s，)，3.97(3H，s)，3.35(3H，s)，2.09(3H，s).LR-MS(EI)m/z(％)298(109，M+)，280(43.3，M-H2O)，269(21.9，M-CO+H)，252(10.1M-H2O-CO)。
实施例5、取代基R为式II时的式I小红参醌全甲基化物甲醇解产物的制备取代基R为式II时的式I小红参醌200mg，溶于二甲基甲酰胺5ml，加Ag2O0.5g及MeI10ml，混合液磁力搅拌回流加热4小时，抽滤，滤液加H2O适量，使沉淀析出，抽滤，得化合物100mg。
上述甲基化物溶于MeOH 10ml，并加浓H2SO42ml，回流加热4小时，待反应液冷却后加水适量使沉淀析出，抽滤并用水3×1ml洗涤滤饼，滤液弃去，滤饼再用1NNaOH及H2O反复洗溶，洗涤液加稀盐酸酸化使沉淀析出，抽滤，水洗后将滤饼干燥得黄色粉末物，即为取代基R为式II时的式I小红参醌全甲基化物甲醇解产物。经下面的鉴定分析，断定其分子式为C17H14O5。
1H-NMR δ(ppm)18.99(1H，s，有邻位取代的羟基质子)，8.07(1H，d，J＝8.7H)，7.40(1H，d，J＝2.9Hz)7.47(1H，s)，7.36(1H，dd，J＝8.7、2.8Hz)，3.92(3H，s)，3.77(3H，s)，2.14(3H，s).
LR-MS(EI)m/z(％)293(109，M+)，281(43.0，M-H2O)，269(29.4，M-CO+H)，252(17.6M-H2O-CO)。
实施例6、化学合成取代基R为H的式I小红参醌(1)合成3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸以3，5-二羟基苯甲酸为原料经选择溴代(Br2/CHCl3，25℃，0.5h)得2，6-二溴-3，5-二羟基苯甲酸，2，6-二溴-3，5-二羟基苯甲酸经曼尼希反应(33％HNNe2，37％HCHO、EtOH，HAc，25℃，25h)得2，6-二溴-3，5-二羟基-4-氨甲基苯甲酸，于2，6-二溴-3，5-二羟基-4-氨甲基苯甲酸的NaOH溶液中加入Al-Ni合金进行还原反应(25-34℃，16h)脱去溴及氨基得到3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸。经光谱(MS、NMR)分析，与文献一致。
(2)合成取代基R为H的式I小红参醌将3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸1g和4-羟基苯甲酸3g的混合物研细并干燥后加入熔融的AlCl3(20g)-NaCl(4g)-P2O5(2g)混合液中，维持温度180-200℃(油浴温度)，反应5min，反应液放冷后加入冰水80ml和浓盐酸15ml，120-140℃煮沸10min，冷后即有沉淀生成，将上清液倾入分液漏斗并用乙酸乙酯(2×50ml)萃取，萃取液与上述沉淀合并，依次用5％NaHCO3、饱和NaCl水溶液及水各4×50ml洗涤，洗涤后的乙酸乙酯萃取液用无水Na2SO4干燥，回收乙酸乙酯至干，残渣用乙酸乙酯多次重结晶，得取代基R为H的式I小红参醌化合物110mg(产率为7％)。
(3)对所得化合物进行鉴定，其结果如下mp＞300℃元素分析C15H10O5·H2O理论值 C％62.50％H％ 4.17％实测值 C％62.30％H％ 4.14％UV及1R叠谱与天然化合物I完全一致。
实施例7、本发明化合物对常压缺氧小鼠活存时间的影响1)药物分别将2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10蒽醌、2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙、2-甲基-1，3，6-三羟基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙溶于等摩尔数的NaOH溶液，冰冻干燥后生理盐水稀释至需要的浓度，分别得到药物I，药物II，药物III；将2，5二甲基-1，3，6-三羟基-9，10蒽醌溶于两摩尔数的NaOH溶液，冰冻干燥后生理盐水稀释至需要的浓度，得到药物Ia。
2)实验方法取健康小鼠98只，随机分成10组，小剂量和大剂量各5组(包括对照组)、小剂量给药1mg/0.2ml/鼠；大剂量给药2mg/0.2ml/鼠；对照组给等体积生理盐水，均为腹腔给药，给药后20分钟将小鼠密闭于耐缺氧实验装置中，记录动物呼吸终止时间，以给药组比对照组活存时间增加的百分比比较各化合物的药效。 3)结果如表1所示，药物I和药物II及大剂量药物Ia均有抗缺氧活性，腹腔注射药物I 1mg/鼠、2mg/鼠，小鼠活存时间分别延长39.5％(P＜0.01)、26.3％(P＜0.01)；腹腔注射药物II 1mg/鼠、2mg/鼠，小鼠活存时间分别延长20.6％(P＜0.01)、39.4％(P＜0.001)，腹腔注射药物Ia 2mg/鼠，小鼠活存时间延长20.0％(P＜0.05)。
药物III及小剂量药物Ia与对照组相比差异不显著。
表1组别 1毫克/鼠2毫克/鼠存活时间(分) 增加(％) 存活时间(分) 增加(％)对照 13.5±0.98.017.5±0.80.9
(10) (9)化合物I 25.5±1.339.5**22.1±1.126.3**(10) (8)化合物Ia21.2±1.214.621.4±0.520.0*(10) (10)化合物II23.4±1.720.6*24.4±1.539.4***(10) (10)化合物III 21.1±1.214.120.3±1.016.0(10) (11)*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 数值＝均数±标准误实施例8、本发明化合物对离体豚鼠心脏的影响1)试剂药物I，药物II，药物III，药物Ia同实施例7；脑垂体后叶素为长沙生化制药厂生产，批号861101。
2)实验方法取豚鼠50只，随机分成6组；药物I、Ia、II及III组，脑垂体后叶素和脑垂体后叶素加药物I组。
实验时，用木锤猛击豚鼠后脑，趁其昏迷剪开胸腔，暴露心脏并立即向心脏内注入肝素抗凝，然后取下心脏挂于灌流系统，将心尖通过蛙心夹连接于微拉力传感器并通过多道生理记录仪记录心率和心搏幅度，灌流液为氧饱和的洛氏液，温度35-37℃，灌流压70mmH2O，用两套灌流装置分别灌流洛氏液及药液，药液稀释于洛氏液中，各药液浓度均为85μM(pH7.5)。
待示波器上心搏稳定，冠脉流量恒定后，开始记录连续两分钟内每分钟的心搏及流量，以此作为给药前的正常对照值，然后灌流药液，记录连续5分钟内每分钟的心搏和流量，计算给药时5分钟比给药前2分钟每分种冠脉流量平均增加的百分比，比较药效。 3)结果如表2所示，当灌流液内药物浓度均为85μM时，药物I和药物Ia均能显著地增加离体豚鼠心脏冠脉流量，增加百分比分别为94.6％(P＜0.001)和53.7％(P＜0.01)，同浓度的药物II和药物III对冠脉流量无影响。
各药物对心率影响不明显，除药物I对心搏幅度有一定的抑制作用(35.5％，P＜0.05)外，其余各药物对心搏幅度均无明显影响。
脑垂体后叶素(2×10-3U/ml)能显著减少离体豚鼠心脏冠脉流量(-36.9％，P＜0.05)。药物I(85μM)能完全对抗后叶素诱发的冠脉流量减少作用。
表2组别 冠脉流量X±SE 增减 心率 X±SE 增减 舒缩性能 X±SE 增减对照 给药 (％) 对照 给药 (％) 对照给药 (％)药物I(9)5.6±0.5 10.9±0.5 94.6***241±16 248±10 2.9 7.6±0.7 4.9±0.7-35.5*药物Ia(9) 8.2±0.7 12.6±1.2 53.7**226±16 222±11 -1.8 6.7±0.7 6.4±0.9-4.5药物II(8) 5.8±0.7 6.0±0.6 3.4252±5250±7 -0.8 12.2±1.3 12.4±1.1 1.6药物III(6) 7.0±1.1 6.9±1.2 -1.4 220±8206±11 -5.4 5.8±0.5 5.8±0.60.0后叶素(6) 11.1±0.9 7.0±0.8 -36.9*251±10 210±9 -16.3 13.0±1.8 11.0±2.0 -15.4后叶素+I(6) 8.3±0.7 9.9±0.7 19.3 247±4239±4 -3.2 10.0±1.3 6.0±0.9-40.0*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 数值＝均数±标准误灌流液乐氏液 药物浓度85μM 垂体后叶素浓度2×10-3U/ml实施例9药物I对脑垂体后叶素诱发的大鼠心肌缺血心电图的影响1)药物I、脑垂体后叶素同实施例72)实验方法取大鼠22只，雌雄各半，随机分成两组，脑垂体后叶素组和脑垂体后叶素加药物I组。
大鼠腹腔注射25％乌拉坦(4ml/kg)麻醉后仰卧固定，在四肢皮下插入针状电极，调节心电图机定标灵敏度1mv＝10mm，纸速50mm/s，记录正常II导心电图后，对照组通过股静脉注射生理盐水0.2ml/鼠，给药组通过股静脉注射药物150mg/0.2ml/kg，1分钟后分别注射后叶素0.75U/kg(15秒内注射完毕)，分别于即刻，15”、30”、1’、2’、3’、4’和5’重复记录II导心电图。
以注射后叶素后I期(0-30’)心电图T波高耸且S点抬高超过0.1mv，II期(30”-5’)心电图T波压低且S点下降超过0.1mv者判断为阳性缺血性心电图，反之为阴性，比较两组阴性率差异，X2检验统计显著性。
3)结果如表3所示大鼠静注垂体后叶素0.75U/kg，均出现I、II期缺血性心电图，且有两例出现病理性Q液，大鼠静注药物I50mg/kg能非常有效地对抗上述I、II期缺血性心电图改变，也无病理性Q液出现。
表3药物I对脑垂体后叶素诱发的大鼠心肌缺血心电图的影响组别动物数I-期阴性数I-期阴性数Q液对照 11 0 1 2给药 11 9 109P＜0.001 ＜0.001给药途径股静脉给药剂量对照组，垂体后叶素0.75U/kg给药组，化合物I 50mg/kg实施例10、药物I对急性实验性心肌梗死(AMI)大鼠左心室收缩性能及梗死范围的影响。
1)药物I同实施例72)实验方法取健康大鼠40只，随机分成四组小剂量组、大剂量组、假手术组和心理盐水组。
手术前半小时给药一次，然后将全部动物在乙醚麻醉下，于左侧3-4肋间心尖搏动最明显处作一长约2cm的切口，剪开皮下筋膜及肌肉，用一弯止血钳撑开肋骨，施加一侧向压力于胸侧壁及剑突下挤出心脏，以心脏表面静脉为标志，在左心耳根部与肺动脉圆锥之间，相当于左冠状动脉起始处向下2-3mm处，用3号丝线结扎左冠状动脉主干，假手术仅穿线而不结扎，立即送还心脏，押出胸腔内气体，夹紧皮肤切口行人工呼吸，待自主呼吸恢复后，缝合胸壁，立即记录动物心电图，无缺血性心电图变化者弃去。
给药组于手术后第二天开始，每日分别腹腔注射药物I 25mg/kg(小剂量)、50mg/kg(大剂量)；对照组给同体积生理盐水；假手术组什么都不给，连同手术前一次共给药8次(8天)。
最后一次给药后30分钟，腹腔注射25％乌拉坦(4ml/kg)麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于实验台上，分离出右颈总动脉后，自尾静脉注射肝素300U抗凝，将心导管导入颈总动脉0.5cm，测定动脉压后再继续将导管延伸2.5-3cm，待示波器上显示出左室内压曲线图时，表示导管已进入左心室，将导管连同动脉壁结扎固定，5分钟后测定左室收缩性能各指标，同时记录心电图。
所测指标及测定条件如下左室内压(LVP)及左室内压峰值(LVSP)曲线；定标灵敏度50mmHg/10mm，纸速50mm/s。
左室内压变化速率(dp/dt)曲线，定标灵敏度2000mmHg/s/5mm，纸速100mm/s，微分时间常数1ms，高频滤波50Hz。
待上述指标测定结束后，立即将大鼠开胸，取出心脏，除去心房，将心脏横切成四片，N-BT染色15分钟，10％甲醛固定，正常心肌染成蓝色，梗死心肌不着色(呈灰白色)，染色后心脏切片梗切面用彩色胶卷照相，冲洗放大3.3倍，用透明塑料薄膜描下照片上左心室梗死区及非梗死区界线，剪纸称重法计算梗死区横切面范围占整个左心室横切面范围的百分比，t检验求P值。 3)结果如表4所示大鼠腹腔注射药物I 50mg/kg/天，连续8天，心功能明显好于生理盐水对照组(P＜0.05)，与假手术组差异不显著，大鼠腹腔注射药物I25mg/kg/天，连续8天，心功能也有改善的趋势，但与生理盐水对照组差异不显著如表5所示，大鼠腹腔注射药物I 50mg/kg/天和25mg/kg/天，连续8天，均能非常显著地缩小心梗范围，当对照组心梗范围为38.5％时，大剂量和小剂量给药组心梗范围仅分别为15.9％(P＜0.001)和11.8％(P＜0.001)。抑制强度分别为58.7％和69.4％。
表4药物I对急性心肌梗死大鼠左室心肌收缩性能的影响组别 动物数 HR LVSP +dp/dtmax-dp/dtmax(beals/min)(mmHg) (mmHg/sec) (mmHg/sec)X±SEX±SE X±SEX±SE对照 7429±24104.6±5.39900±5857800±526假手术 7450±12119.6±6.411917±306*9714±529*药物I7394±29114.3±5.719886±622 8743±614(25mg/kg)药物I9400±11111.8±2.611570±388*8533±666(50mg/kg)给药途径腹腔给药次数每天一次，连续3天P＜0.05测定时间最后一次给药后30分钟表5药物I对急性心肌梗死大鼠心醒范围的影响组别动物数 心梗范围(％LV) 抑制强度(％)P对照 738.5±2.5 0.0化合物I(25mg/kg) 10 11.2±1.8 69.4 ＜0.001化合物I(50mg/kg)9 15.9±2.558.7＜0.001给药途径腹腔 数值＝均数±标准误给药次数每天一次，连续8天。
由上述实施例可以看出，药物I确有较好的抗心肌缺血作用。
权利要求
1.通式I的化合物及其甲基化衍生物 其中，R为H、式II的基团或式III的基团
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物为通式I的化合物，其中，R为H、式II的基团或式III的基团。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于该化合物是R为H时的式I化合物。
4.权利要求2化合物的生产方法，包括以下步骤1)将小红参(Rubia ynananensis(Franch.)Diels)按重量比为1∶8-12的比例溶解于蒸馏水中，用酸，优选浓盐酸及冰醋酸，调节溶液的pH至2.5-3.5，3℃-12℃放置过夜；2)过滤，得滤渣及滤液；3)依次用低分子量醇，优选甲醇、乙醇或正丁醇，和丙酮回流提取所得滤渣，甲醇和丙酮的体积分别为上述用于溶解小红参蒸馏水体积的1/3-1/5；4)合并上述所得的甲醇和丙酮提取液，将甲醇-丙酮溶解部分进行硅胶柱色谱；5)依次用环己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脱硅胶柱，循环12-14次，合并洗脱液；6)3℃-12℃放置过夜，得到析出的结晶，即取代基R为H时的式I化合物；7)收集合并上述第5)步中，依次用环己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脱硅胶柱第13-16次循环的洗脱液；8)3℃-12℃放置至结晶析出，抽滤，得到滤饼；9)用1∶1∶1的甲醇-无水乙醇-四氢呋喃将滤饼溶解，3℃-12℃放置至结晶析出；10)抽滤，干燥，将所得的混合物用离心薄层色谱分离，依次用10∶1、8∶1、6∶1和4∶1的二氯甲烷-甲醇洗脱；11)收集离心薄层色谱的第II峰；12)干燥，即得取代基R为式II时的式I化合物；13)收集上述离心薄层色谱的第III峰，干燥，即得取代基R为式III时的式I化合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤3)依次用低分子量醇和丙酮回流提取所得滤渣，所述低分子量醇和丙酮是等体积的，提取至提取液肉眼观察不到颜色；所述步骤5)合并洗脱液后，进行旋转蒸发；所述步骤6)得到析出的结晶后，进行抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，将结晶用丙酮溶解，活性碳脱色，3℃-12℃放置过夜，得到析出的结晶，抽滤并用3℃-12℃的冷丙酮洗涤滤饼，干燥得到结晶，即取代基R为H时的式I化合物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤8)得到的滤饼，将滤饼用3℃-12℃的冷丙酮洗涤后，再进入所述第9)步，用1∶1∶1的甲醇-无水乙醇-四氢呋喃将滤饼溶解后，用活性碳脱色两次，旋转蒸发，再于3℃-12℃放置至结晶析出；所述步骤10)抽滤后，用3℃-12℃的冷丙酮洗涤滤饼后再进行所述的干燥及离心薄层色谱分离。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤13)收集上述离心薄层色谱的第III峰，干燥后用甲醇重结晶，再干燥，即得取代基R为式III时的式I化合物。
8.化学合成权利要求3所述化合物的方法，包括以下步骤1)3，5-二羟基苯甲酸选择溴代，得2，5-二溴-3，5-二羟基苯甲酸；2)经曼尼希反应，得2，5-二溴-3，5-二羟基-4-氨甲基苯甲酸；3)在碱液中加入Al-Ni合金进行还原反应，得到3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸；4)在AlCl3存在下，使3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸和4-羟基苯甲酸进行反应，得到取代基R为H的式I化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤1)的选择溴代反应是在Br2/CHCl3，25℃的条件下进行的；所述步骤2)的曼尼希反应是在33％HNMe2，37％HCHO，(乙醇)EtOH，HAc，25℃的条件下进行的；所述步骤3)是在NaOH溶液中进行的；所述步骤4)中3，5-二羟基-4-甲基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的反应是在搅拌，加热到180-200C下进行的。
10.以权利要求1所述的小红参醌为活性成分的抗心肌缺血药物。
11.权利要求1-3中任意一项的化合物在制备抗心肌缺血药物中的应用。
全文摘要
本发明的名称为小红参醌及其衍生物，它的制备方法与应用。本发明公开了一种通式I的化合物及其甲基化衍生物，其中，R为H、式II的基团或式III的基团，本发明还公开了从中药小红参中提取通式I化合物方法、化学合成通式I化合物的方法，以及以通式I的化合物为活性成分的抗心肌缺血的药物。
文档编号C07H15/244GK1397541SQ01120320
公开日2003年2月19日 申请日期2001年7月20日 优先权日2001年7月20日
发明者王升启, 马立人, 李鲁, 任建平, 康利平, 王景霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所