专利名称：人表皮生长因子受体特异性融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤作用的融合蛋白、以该蛋白为活性成分的药物和该蛋白的应用，特别是涉及一种具有人表皮生长因子受体特异性的融合蛋白、以该蛋白为活性成分的药物及其在制药行业的应用。
在人乳腺癌、肺癌等实体瘤细胞的表面，存在着异常大量的表皮生长因子(SEQID NO1)受体(EGFR)。依据这一特性，可以利用EGFR的配体或抗体与毒素蛋白融合，研制导向毒素式的抗肿瘤药物。国外研制的人表皮生长因子-白喉毒素，已进入临床II期，研究表明，它显示了良好的杀肿瘤细胞活性。但该融合蛋白存在着分子量较大，影响免疫毒素高效进入靶细胞等不足。
StxA45-247(它的氨基酸残基序列见SEQ ID NO2)是被突变截短的志贺氏菌毒素亚基，它除了具有对靶细胞的杀伤作用外，更具有分子量低，易于通过胞饮进入靶细胞，实现杀伤作用的特点。
本发明的融合蛋白是由人表皮生长因子与StxA45-247融合形成的，该融合蛋白的编码基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
本发明的融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸残基序列。
本发明的另一个目的是提供以本发明的融合蛋白为活性成分的抗肿瘤药物。特别是治疗乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌及上皮细胞癌的药物。
本发明的又一目的是提供本发明的融合蛋白在制备抗肿瘤药物方面的用途。
本发明的药物以本发明的融合蛋白为活性成分，该药物用于治疗肿瘤。
在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明化合物的药用量可根据患者的年龄、体重、疾病的严重程度进行调整，日剂量一般为20-100μg/kg体重。
本发明巧妙地利用低分子量的StxA45-247与人源的人表皮生长因子形成融合蛋白，既可避免外源毒素产生的免疫原性，降低副作用，又易于通过胞饮进入靶细胞，提高杀伤肿瘤细胞的特异性。本发明的融合蛋白具有很高的临床应用价值，是一种高效的导向抗肿瘤药物。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
2、融合基因在大肠杆菌中的表达所构建的融合基因转化E.coli JM109(DE3)，用作转化的大肠杆菌还可以是E.coli BL21(DE3)等其它带有DE3的大肠杆菌。
经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳分析证实，上述融合基因在E.coli.JM109(DE3)中获得高效表达。
3、融合蛋白的变性、复性以及纯化融合基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达，经过超声破碎，包涵体变性后，在复性液中复性，利用金属螯和层析获得纯度95％以上的纯品蛋白。经对该蛋白的氨基酸测序表明，所得到的蛋白确为本发明的融合蛋白。
实施例2、融合蛋白StxA45-247-EGF的体外细胞毒作用为了观察融合蛋白StxA45-247-EGF对不同肿瘤细胞的生长抑制作用，发明人用融合蛋白StxA45-247-EGF分别对六株肿瘤细胞做了量效关系试验。以EGF为对照，比较了融合蛋白StxA45-247-EGF为1000nm/ml浓度时对六株肿瘤细胞体外细胞毒作用，结果如表1所示表1.各种肿瘤细胞存活百分比MDA A431 A549MCF-7 KB HEPG2StxA45-247-EGF 24.522.8 40.431.1 27.133.3EGF 81.8100.0102.0 81.9 102 101.0其中 从表中的数据可以看出，融合蛋白StxA45-247-EGF对人乳腺癌MDA、MCF-7，人口腔鳞状上皮癌KB，人类上皮样细胞癌A431，人肺癌A549，人肝癌HEPG2六株肿瘤细胞株有明显的杀伤作用。
实施例3、融合蛋白StxA45-247-EGF特异杀伤作用的量效关系分别比较融合蛋白StxA45-247-EGF在0，0.1，1，10，100，1000ng/ml六个浓度时对六株不同肿瘤细胞的体外细胞毒作用，结果如
图1-6所示，图中横坐标为融合蛋白StxA45-247-EGF的浓度，纵坐标为癌细胞的最大存活率。
从图中可以看出，本发明的融合蛋白对六株EGF受体过表达的肿瘤细胞株，随着免疫融合蛋白浓度的增大，细胞存活百分比减少，细胞毒杀伤作用增强，显示了明显的量效关系，即具有剂量依赖性。
实施例4、StxA45-247-EGF的体内抑瘤作用采用六周龄裸鼠，以口腔鳞状上皮细胞(KB)构建裸鼠肿瘤模型，细胞接种密度为105cells/只，注射于背部皮下，接种后观察肿瘤生长至肉眼可见，随机分组，其中，三个试验组，StxA45-247-EGF分别使用高(80ug/ml)、中(40ug/ml)、低(20ug/ml)三种剂量，阳性对照组使用环邻酰胺(CTX)，阴性对照组使用PBS，腹腔注射，连续注射5天，观察肿瘤生长情况，结果见表2及图7，图7中，1号为PBS组，2号为CTX组，4号为StxA45-247-EGF组。
表2 融合蛋白体内对人口腔鳞状上皮癌(KB)的抑制作用组别 剂量(ug/只) 动物数 瘤重(mg) 抑瘤率(％)PPBS安慰剂 5 916±166.4 / /CTX400×1d 5 34.5±6.4 96.2 ＜0.01StxA45-247- 80×5d 5 42.33±3.51 95.4 ＜0.01EGF40×5d 5 121.4±8.59 86.7 ＜0.0120×5d 5 217.8±10.8 76.2 ＜0.01从表中可以看出，融合蛋白高剂量组与环邻酰胺(CTX)的抑瘤率相当，低剂量组也达到76.2％，与PBS组(对照)相比差异极显著(P＜0.01)。
序列表(1)一般信息(I)申请人中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所(II)发明名称人表皮生长因子受体特异性融合蛋白及其应用(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度53个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR 53(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度180个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2TGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTT 60AVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTV 120TAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRI 180(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度870碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO3NTACNAAACNCTTNCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA 63GATATACATATGACAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATGTCAGAGGGATAGATCCAGAGGAA126GGGCGGTTTAATAATCTACGGCTTATTGTTGAACGAAATAATTTATATGTGACAGGATTTGTTA 190ACAGGACAAATAATGTTTTTTATCGCTTTGCTGATTTTTCACATGTTACCTTTCCAGGTACAAC 254AGCGGTTACATTGTCTGGTGACAGTAGCTATACCACGTTACAGCGTGTTGCAGGGATCAGTCG317TACGGGGATGCAGATAAATCGCCATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATTTAATGTCGCATAAGT 381GGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGGCAAGAGCGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGCTGA 443AGCTTTACGTTTTCGGCAAATACAGAGGGGATTTCGTACAACACTGGATGATCTCAGTGGGC 505GTTCTTATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAAGGGTGAGTAGN 567GTCCTGCCTGACTATCATGGACAAGACTCTGNTCGTGTNGGAAGAANTTCTTTTGGAAGCAT 629TAATGCAATTCTGGGAAGCGTGGCATTAATATTGTTATCGCATCATCATGCA AATTCCGAC693TCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTGCACGATGGTGTTTGCATGTATATCGAA756GCTCTGGACAAATACGCGTGCGGCTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAACGTTGCCAGTACCG 818TGACCTGAAATCGTGGGAACTGCGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 870(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度233个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID N04TGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFAD 50FSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMS 100HSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTA 150EDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRINSDSECPLSHDGYCLHDGVC 200MYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR 23权利要求
1.融合蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
2.融合蛋白，具有SEQ ID NO4的氨基酸残基序列。
3.以权利要求2所述的融合蛋白为活性成分的抗肿瘤药物。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述药物为治疗乳腺癌的药物。
5.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述药物为治疗肺癌的药物。
6.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述药物为治疗肝癌的药物。
7.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述药物为治疗口腔癌的药物。
8.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述药物为治疗上皮细胞癌的药物。
9.权利要求1的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种由人表皮生长因子与StxA
文档编号C07K14/435GK1394956SQ01120100
公开日2003年2月5日 申请日期2001年7月9日 优先权日2001年7月9日
发明者马清钧, 陈东立, 许伟利 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所