专利名称：一种高效的固相萃取-hplc方法分离纯化真菌产紫杉醇的制作方法
一种高效的固相萃取-HPLC方法分离纯化真菌产紫杉醇
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效的固相萃取-HPLC方法 分离纯化真菌产紫杉醇。
背景技术：
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜 生物碱。其基本结构由浆果赤霉素III (baccatinin)和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构 成。
工业生产紫杉醇的早期策略，是采用从红豆杉树木原料中直接提取的方法，但由于紫杉 醇含量极低，水溶解性差，随着该药品应用范围的扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也 给红豆杉资源带来严重威胁，可能造成生态环境的严重破坏。
化学法全合成紫杉醇，已于1994年在实验室里取得了成功。但是，紫杉醇手性基团较多， 合成路线复杂，成本高、产率低，至今无法应用于工业生产。近年来，国内外学者进行了大 量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，其中大部分已证实能产生紫杉醇，但是离体培 养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破。
国际制药公司当前较普遍釆用的生产技术则是生化半合成法。半合成法虽然提高了紫杉 醇产量，但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别，仍然需要消耗大量红豆杉树木。
由于紫杉醇的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面的制约，使得药价昂贵。为此， 制药界和学术界一直在寻找新的更好的原料及方法，来代替现有的生产技术，以提高紫杉醇 的产量、满足临床需求。过去十余年中取得的最有意义的进展，是发现了与红豆杉等裸子木 本植物共生的一些真菌产生紫杉醇，并且其化学结构和生物活性与红豆杉所产紫杉醇完全相 同。据统计，国内外已报道的产生紫杉醇真菌种类已超过三十种，这些真菌绝大多数是子囊 菌或半知菌，而且大都是内共生真菌。和植物组织提取物一样，真菌发酵液中产物众多，而 紫杉醇的含量极低，这样就在很大程度上增大了生产紫杉醇的成本，同时发酵液的粘度很大， 极容易堵塞色谱柱。为了解决这些问题，研究高效、经济的提取分离方法，以提高紫杉醇的 纯度和回收率，从而促进紫杉醇的工业化发酵生产。
发明内容为了克服现有技术的不足和满足市场的需求，本发明的目的在于Mf共一种高效 的固相萃取-HPLC方法分离纯化真菌产紫杉醇，以提高发酵^中紫杉醇的得斜卩纟屯度。 本发明mf共的一种固相萃取小柱的i真装方法，其包括±真料的选择和±真装方法。 所述的固相 小柱的填装方法为干柱±真充法，填料为^t性氧化铝。 本发明提供的一种固相萃取的方法，其包括固相柱的活化、上样和M。 戶腿的活化方法为向固相小柱中依次加入氯仿、甲醇进斤活化，上样为处理好的发MS接 上样，l，液为乙酸乙酯。
本发明掛共的一种高效液相色谱分析的方法，其包括样品的前处理，色谱柱的选择和高效液 相色谱斜牛的确立。
所述的样品的前处理步骤为固相,后收集的淵兑液，用氮气挥干，甲醇复溶，再经0.45nm 的滤膜过滤。
所述的色谱柱为Cl8色谱柱5 urn (250 mmx(p4.6 mm)。
戶脱的高效液相色谱剝牛为流动相为甲醇7K(v/中70: 30，进样量20jiL，〗繊1.0mL/min， 紫外检测波长为227nm， t主温为3(TC。
本发明的优点和积^*:
本发明提供了一种利用碱性氧化铝固相萃取结合高效液相色谱分离纯化真菌产紫杉醇的方 法，与常规的分离纯化方法相比，紫杉醇的回收率得至U了显著的提高，超i」138%,并且紫據纯 度超lj了 92%。同时该方縣用干柱i真装法，填料和活化、^i^试剂M以不需进一歩处理，节约 了时间，节省了费用。
图1是固相萃取小柱的结构图。1、聚丙烯柱管2、筛板3、填料4、接头 图2是碱性氧化铝固相魏前后的色谱靴匕较。 其中Taxol处为紫杉醇峰，色谱流出曲线1为萃取前的图谱，色谱流出曲线2为M后的图谱。
4本发明劍共的能产紫杉醇的菌株是一株腐生真菌拟盘多毛孢，已于2008年10月8日保藏于 中国微生物菌种1BI管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区大屯路，中国科学院 微生物研究所，薪中臓号CGMCCNo.2694，分类命名/^加fo^戸^。
下面将M:实施例x寸本发明作进一步的描述，这些描述并不^x寸本发明内容作进一步的限定。 本领域的技术人员应aif，对发明技术特征所作的等同替换、或相应的改进，仍属于本发明的保 护范围之内。
^!i例i、 固相靴小柱的±真装
采用干柱填充法进行小柱的填装。先^A下端的聚丙烯膜(筛板)，接着把称觀的±辩斗200 mg 碱性氧化铝沿着漏斗加入管内，最后驗战的筛板，用力压实，即可f顿。固相靴小柱(SPE
柱)结构图见图l。
^M例2、 发M的固相,
先进行固相萃取小柱的活化向固相小柱中依7効n入2mL氯仿和2mL甲醇进行活化，最后 将液面维持在筛lli:l 2mm高度。向活化好的柱中力口入处理好的发 0.1 mL，上柱后，{顿2 mL乙酸乙酯直接M， ^BIS制为0.2mUmin，反复 5次，收^fel兑液，常温常压下用氮气 挥干，再用a2mL甲醇复溶。
鄉例3、高效液相色谱的纯化
样品经甲醇复溶，经0.45Mm的滤Ma滤后，进行高效液相色谱(HPLC)纯化。高效液相色 谱^#:自审iJCw， 5nm， cp4.6 x 250mm，流动相为甲醇水(v/v)-70: 30，迸祥量20mL。
^11.0mL/min，紫外检测波长为227nm，法温为3(TC。样品经固相魏前后的色谱图比
5较见图2。由图2可以看出，发酵液直接进样(色谱流出曲线l)，基线不稳，杂峰很多，而 且紫杉醇对应的峰有点拖尾；经过固相萃取后(色谱流出曲线2)，不仅基线水平降低，较平 稳，而且在5 min内的紫外吸收值明显降低，其它各处的杂峰也有所下降，紫杉醇对应的峰 形得到改善。
实施例4、固相萃取后的回收率和纯度测定
固相萃取后回收率的测定向已知浓度Co的样品中添加等体积的0.025 mg/mL的紫杉醇 标准品，取6份进行SPE-HPLC (固相萃取—HPLC)，根据标准曲线计算出最终浓度d。则 回收率为(Ci-Co)/0.025xlOO%
经回收率测定，结果如表l所示
表l固相萃取后的回收率
填料样品含量加入的标准品回收taxol回收率RSD
Co (mg/mL)(mg/mL)Ci (mg/mU
碱性氧化铝0.00720.0250麓7138%1.44%
紫杉醇纯度的检测，按照面积百分比的方法计算纯度，经过SPE-HPLC (固相萃取一 HPLC)，纯化后的紫杉醇纯度为92%。
实验结果表明利用本发明的技术方法-碱性氧化铝固相萃取结合高效液相色谱法分离纯 化真菌产紫杉醇，取得了较高的的回收率，提取的紫杉醇纯度达到了 92% 。'
权利要求
1、一种高效的固相萃取-高效液相色谱(HPLC)方法分离纯化真菌产紫杉醇，其特征在于将固相萃取技术和HPLC结合，从产紫杉醇真菌的发酵液中分离纯化紫杉醇，紫杉醇的得率和纯度得到了很大的提高。
2、 根据权利要求1所述的方法，，征在于固相萃取技术包括固相萃取小柱的±真装，固相柱的活化、上样和m
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于固相萃取小柱的填装方法为干掛真充法，填料为碱 性氧化铝。
4、 根据权利要求2所述的方法， 征在于固相柱的活化方法为向固相小柱中依次加入氯仿和 甲醇进摘化。
5、 根据权利要求2戶皿的方法，^#征在于固相柱的上样为处 的发 3:接上样。
6、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于固相柱的洗脱液为乙酸乙酯。
7、 根据权利要求1戶M的方法，欺寺征在于高效液相色谱纯化的方,括样品的前处理，色谱 柱的选，鳴效液相色谱剩牛的确立。
8、 根据权利要求7戶皿的方法，其特征在于样品的前处理步骤为固相萃取后收* 液，用 氣气挥干，甲醇复溶，再经0.45nm的滤Ea滤。
9、 tSffi权利要求7所述的方法，赚征在于高效液相色谱柱为C18色谱柱5Mm (250mmx(p4.6 mm)。
10、 根据权利要求7舰的方法，辦征在于高效液相色谱^f牛为流动相为甲醇水(v/v"70: 30，进样量20nL， Ml.OmL/min，紫外检测波长为227 nm， tt^温为30。C。
全文摘要
本发明涉及用一种高效的固相萃取-HPLC方法分离纯化真菌产紫杉醇，其包括应用固相萃取原理，改良性地建立了利用碱性氧化铝固相萃取结合高效液相色谱分离纯化真菌产紫杉醇的新方法，并且取得了138％的回收率，纯度达到了92％，RSD(相对标准偏差)为1.4％。该方法采用干柱填装法填装碱性氧化铝小柱，而且填料和活化、洗脱试剂都可以不需进一步处理，节约了时间，节省了费用，并且紫杉醇的回收率得到了显著的提高。
文档编号C07D305/00GK101492432SQ20081015365
公开日2009年7月29日 申请日期2008年12月1日 优先权日2008年12月1日
发明者吕宪禹, 朱旭东, 毕建男, 皎 潘, 苗会娟 申请人:南开大学