专利名称：：一种二萜类抗肿瘤化合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是一种从海洋动物海绵中分离得到的二砲类抗肿瘤化合物d晶(A,及其制备方法。
背景技术：
：海绵是一种海洋动物，其生活环境具有低温，高压，高盐等特点。本申请人曾从细薄星海绵中分离到几种具有抗肿瘤活性的三萜类化合物并已申请专利(申请号200710042653.6)。但至今未见从海绵中分离到具有抗肿瘤活性的二萜类化合物UH:"仏的报道。
发明内容本发明提供一种从生长于我国西沙海域的海绵中提取分离到的二萜类抗肿瘤化合物(7R)-2-甲氧基-5，7-二甲基-7-[(lS，3E)-l-乙基-3-己烯]-l-氧代-2，5-二烯-4-庚酮，分子式为C19H3。03，其化学结构式为〇。本发明化合物的制备方法如下l.制备总浸膏；按常规将新鲜的海绵用丙酮和甲醇以1:00:1比例混合的混合溶液分次进行超声提取或渗漉提取，至提取液无色，合并提取液，减压回收丙酮和/或甲醇后，加入乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；2.纯化将总浸膏溶于85%95%甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层；调整甲醇浓度至60%70%，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲焼，将所得的浸膏浓縮至干；用体积比为1:1的二氯甲垸/甲醇或者体积比为4:5:1的正己垸/二氯甲烷/甲醇混合溶剂将浸膏溶解，过SephandexLH20凝胶柱，用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇或者4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物UH:,。0:,的流分，回收溶剂浓縮至干；过200400目的正相硅胶柱，以体积比为l:00:l石油醚/乙酸乙酯混合溶剂棵度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含d晶。0:,的流分，再过ODS反相柱，以体积比为l:10:1的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C19H:,。03的流分；再经反相高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为7:38.5:1.5的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有UH3。03的流分并减压浓縮，得纯化合物CI9H3。03。本发明化合物C,晶必,为无色液体，在电喷雾离子质谱(ESI-MS)中出现329[M+Na]+，330[M++Na+H]+和635[2M+Na]+准分子离子峰;紫外光谱入，(MeOH)二287.6nm，^和3C核磁共振数据见表1，从而确定了它的化学结构。表1.C19H3。03的^和13C核磁共振数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明使用上海天甲生物有限公司提供的肿瘤细胞株H印G2(人肝癌细胞株)，Bcap-37(人结肠癌细胞株)，H460(人肺癌细胞株)，HT-29(人结肠癌细胞株)，对化合物UH3。03进行体外抗肿瘤试验，表明其具有明显的抑制肿瘤的活性，因此本发明化合物可以用于制备抗肿瘤药物。具体实施例方式现结合实施例，对本发明作详细描述，但保护范围不局限于如下实施例。实施例l从海绵中制备化合物d9H3。03选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，分别用IOOO毫升的甲醇超声提取三次，直至提取液为无色，合并提取液，减压回收甲醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升90%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至60%;用二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓縮至干；加入体积比1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过S印hadexLH20凝胶柱，用流动相体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱监测，收集含UH:,。03流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓缩至干，得到浸膏10克；将浸膏过200目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚丙酮的体积比为50:15:1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含Cl9H3Q03的流分，再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇水体积比为80:20的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含UFUU勺流分。以真空减压旋转蒸发仪浓縮后，得纯化合物C19H3。0316.O毫克。实施例2从海绵中制备化合物C19H3。03选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，用1000毫升的丙酮超声提取三次，直至提取液为无色，合并提取液，减压回收甲醇；加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收二氯甲烷，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升95%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至65%;用二氯甲垸萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓縮至干；加入体积比4:5:l的正己垸/二氯甲垸/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过S印hadexLH20凝胶柱，用流动相体积比为4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，收集含化合物C19H3。03的流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓縮至干，得到浸膏9克，将浸膏过300目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚丙酮的体积比为50:l5:1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含d9H3。0:,的流分，再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇水体积比为77:23的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含C19H3。03的流分。以真空减压旋转蒸发仪浓縮后，得纯化合物d晶。03l5.3毫克。实施例3从海绵中制备化合物C19H3Q03选择生长于中国海南西沙海域的海绵1500克，洗净，剪碎，用95%乙醇渗漉提取，直至提取液为无色，将提取液减压回收乙醇；加入乙酸乙酯萃取三次，每次1000毫升，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；将总浸膏溶于1000毫升95%甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至65%;用二氯甲垸萃取三次，每次1000毫升，回收二氯甲烷，将所得的浸膏浓縮至干；加入体积比4:5:1的正己烷/二氯甲垸/甲醇混合溶剂5毫升溶解，过S印hadexLH20凝胶柱，用流动相体积比为4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱监测，收集含化合物C19H3。03的流分，以真空减压旋转蒸发仪回收溶剂浓縮至干，得到浸膏9克；将浸膏过400目正相硅胶柱进行色谱分离，以石油醚乙酸乙酯的体积比为50:l5:1的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱监测，收集含UH3。03的流分；再经反相高效液相色谱进行分离，以甲醇水体积比为75:25的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱监测，收集含d晶。0:,的流分；以真空减压旋转蒸发仪浓缩得纯化合物C19H3(A15.0毫克。体外抗肿瘤活性实验本发明对化合物Cl9HM03进行了体外抗肿瘤实验，实验使用的肿瘤细胞株为上海天甲生物有限公司提供的H印G2(人肝癌细胞株)、Bcap-37(人结肠癌细胞株)、H460(人肺癌细胞株)和HT-29(人结肠癌细胞株)。实验结果表明化合物Cl9H3。0:s具有明显的抑制肿瘤的活性，因此口」'以用于制备抗肿瘤药物。实验方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法，台盼兰染色法(Mwh,/!;5b"&'e2^",,'5"Ae/a仏尸.eta丄/.TVa".Cs;cer.i/sLJ9W,《3757—66)。实验分3组空白对照组、阳性对照组和本发明化合物G晶。03组。阳性对照药为长春新碱。将本发明化合物和阳性对照药分别用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6种浓度，细胞先按常规以10%的小牛血清培养，传代时贴壁细胞以0.2%的胰酶消化液消化。使细胞处于对数生长期，实验时细胞接种于96孔培养板，每孔接种180微升，浓度为5X104个/毫升的细胞悬液。于37。C的C02培养箱预培养过夜。预培养后，每孔加20微升药物溶液，空白对照组加20微升DMS0，每种浓度重复5孔。药物作用细胞3天后进行MTT法测定，于96孔培养板每孔加入浓度为5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37。C孵育4小时，弃上清液，加IOO微升DMSO，在570纳米波长下用酶标仪测定OD值。台盼兰排染法，加入台盼兰工作液，计数活细胞。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率对照组细胞数一用药组细胞数~"对照组细胞数半数有效抑制浓度IC5。值采用Logit法计算。实验结果见表2表2.UH3。03对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(ug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述实验结果表明化合物d孔。03对四种不同的肿瘤细胞株均显示明显抑制作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利中国的海洋药用生物资源具有重要意义。权利要求1.一种二萜类抗肿瘤化合物，化学结构式如下2.权利要求1所述抗肿瘤化合物的制备方法，步骤如下1)提取总浸膏将新鲜的海绵用丙酮和甲醇以体积比为1:00:1混合溶剂分次进行超声提取或渗漉提取，至提取液无色，合并提取液，减压回收丙酮和/或甲醇，加入乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得总浸膏；2)纯化将总浸膏溶于85%95%甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层；调整甲醇浓度至60%70%，用二氯甲垸萃取，回收二氯甲院，将所得的浸膏浓縮至干；用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇或者体积比为4:5:1的正己烷/二氯甲垸/甲醇混合溶剂将浸膏溶解，过SephandexLH20凝胶柱，用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇或者4:5:1的正己烷/二氯甲烷/甲醇混合溶剂洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C,9H3。03的流分，回收溶剂浓縮至干；过200400目的正相硅胶柱，以体积比为l:00:l石油醚/乙酸乙酯泡合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C,9H3。03的流分，再过ODS反相柱，以体积比为l:10:i的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物clsao3的流分；再经反相高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为7:38.5:1.5的混合溶剂进行洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有UH3。03的流分并减压浓縮，得纯二萜类化合物C^H3。03。3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于，提取总浸膏时，新鲜海绵用丙酮或甲醇分3次提取；纯化时，总浸膏溶于90%甲醇，再用石油醚萃取，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至60%，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲垸，将所得的浸膏浓縮至干；过正相硅胶柱时，所用的是300目正相硅胶柱。4.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，具体为从中国海绵中分离得到的一个具有抗肿瘤活性的二萜类化合物(7R)-2-甲氧基-5，7-二甲基-7-[(1S，3E)-1-乙基-3-己烯]-1-氧代-2，5-二烯-4-庚酮，结构式如上，体外抗肿瘤试验表明，该化合物对HepG2人肝癌细胞和Bcap-37人结肠癌细胞等4种肿瘤细胞株有明显的抑制作用。本发明可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋药用资源具有重要价值。文档编号C07D313/00GK101445499SQ20081020763公开日2009年6月3日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者张红军,朴淑娟,帆杨,林厚文,许诚成,陈万生,陈建涛申请人:中国人民解放军第二军医大学