专利名称：燕窝全基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及脱氧核酸的提取方法。
背景技术：
常见的燕窝是雨燕科(Apodidae)金丝燕属(Aerodramus或Collocalia)的多种鸟类分 泌出的唾液或唾液与其绒羽混合而成的凝胶干结物，也有部分燕窝是雨燕科(Apodidae)雨 燕属(Apus)某些鸟类筑巢时分泌出的唾液干结物，如中国广东省怀集县出产的燕窝(有的地方 也叫龙牙燕窝)。由于燕窝是名贵补品，市价之高导致不法商贩以假乱真、以次充好，许多伪 劣、假冒产品从外观上难以区分，而燕窝中的DNA主要来自于唾液中脱落的n腔上皮细胞 和绒羽上的毛囊细胞，这是无法伪造的，因此，分子检测手段在燕窝质量控制方面显得尤为 重要。
目前常用的DNA提取方法主要有苯酚法、CTAB法和高盐低pH法。
苯酚法用SDS裂解细胞使DNA释放出来，然后交替用苯酚/氯仿这两种不同的蛋白质变 性剂抽提，去除溶液中的蛋白质。苯酚、氯仿去蛋白质的能力较强而去多糖的能力较弱，因 此常用于动物组织的DNA提取，对植物组织的DNA提取效果欠理想。
CTAB法因为能较好地去除多糖杂质，故常用于植物组织的DNA提取。CTAB即十六烷 基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂。CTAB即可以裂解细胞膜，使DNA释放出来，又可 以在不同盐浓度下选择性地沉淀多糖或DNA，达到纯化的目的。当溶液中盐浓度大于0.7M 时，CTAB与多糖形成沉淀，与DNA形成水溶性复合物，通过氯仿抽提可使CTAB-多糖沉 淀复合物从溶液中释出去除，而CTAB-DNA复合物仍保留在上清液中，分离上清液并加入异 丙醇或乙醇，可使DNA释出沉淀而CTAB仍留在溶液中。当溶液中盐浓度小于0.5M时，CTAB 与DNA形成沉淀，通过高速离心可使CTAB-DNA沉淀从溶液中释出与蛋白质、多糖等杂质 分离，CTAB-DNA沉淀可通过高盐溶解，再加入异丙醇或乙醇沉淀DNA。
高盐低pH法主要也是用于植物组织DNA提取。低pH有利于防止植物中的多酚类物质 氧化，高盐则有利于蛋白质沉淀。
但是，燕窝唾液中的主要成分是唾液酸糖蛋白，其分子结构含有肽链和糖链，因而要兼 具蛋白质与多糖的理化性质，在提取DNA时，大量的唾液酸糖蛋白容易与DNA共沉淀，因 此，无论使用上述哪一种提取方法，所得DNA的纯度不高，使下游实验难以进行。
发明内容
本发明的目的是提供一种从燕窝中提取基因组DNA的方法。本发明实现上述目的的技术方案是-
燕窝全基因组DNA的提取方法，该方法由以下步骤组成
(1) 取燕窝干品研磨成120目细粉，按重量体积比为1 : IO加入SDS缓冲液，于65。C 水浴2小时，高速离心；
(2) 取上清，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合均匀，高速离心；
(3) 取上清，在室温下加入十分之一体积的CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min， 然后加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀，高速离心；
(4) 取上清，加入0.6 0.8体积倍预冷的异丙醇，混匀后立即高速离心；
(5) 取沉淀物用75 80%乙醇洗涤后将乙醇吹干，溶于TE溶液，即可； 上述步骤中，
所述的SDS缓冲液是Tris-HCl、 EDTA、 SDS、 DTT、蛋白酶k和NaCl的混合水溶液， 其中Tris-HCl的浓度为30 100mM， EDTA的浓度为8 30mM， SDS的浓度为5 20g/L， DTT的浓度为0.04 M，蛋白酶k的浓度为100 300mg/L， NaCl的浓度为0.7 2.0M;
所述的CTAB缓冲液是CTAB和NaCl的混合水溶液，其中CTAB的浓度为50 150g/L， NaCl的浓度为0.7M。
本发明方法中，所述的SDS缓冲液中的SDS浓度最好是10g/L， NaCl浓度最好是2.0M; 所述的CTAB缓冲液中CTAB的浓度为100g/L。
本发明方法中，步骤(4)所述的异丙醇的用量最佳为0.7体积倍。 本发明方法中，步骤(5)所述的乙醇的浓度最佳为75°/0。 本发明方法中，所述的Tris-HCl的浓度最佳为50mM。 本发明方法中，所述的EDTA的浓度最佳为10mM。 本发明方法中，所述的蛋白酶k的浓度最佳为200mg/L。
本发明方法中，所述的燕窝是雨燕科(Apodidae)金丝燕属(Aerodramus或Collocalia) 的鸟类分泌出的唾液或唾液与其绒羽混合而成的凝胶干结物，如金丝燕燕窝、白燕燕窝、血 燕燕窝；或者是雨燕科(Apodidae)雨燕属(Apus)的鸟类分泌出的唾液或唾液与其绒羽混合 而成的凝胶干结物，如怀集出产的燕窝(有的地方也称龙牙燕窝)。
本发明方法中，所述的SDS为十二烷基磺酸钠，EDTA为二乙胺四乙酸，DTT为二硫苏 糖醇，CTAB为十六垸基三甲基溴化铵。
本发明方法中，各步骤中所述的高速离心为本领域分离基因组DNA的常规操作，其速 度和时间通常为12000g和5min，并尽量在低温(4°C)下操作；步骤(2)和(3)所述的氯 仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的比例为24 : 1。本发明首先利用SDS和DTT使燕窝中细胞裂解，在裂解的同时用高浓度的NaCl除去大 部分糖蛋白，可减少纯化时糖蛋白对DNA的干扰，接着用氯仿异戊醇除去蛋白质，此时DNA 所在的上清液仍处于高盐状态，加入CTAB进一步除去糖蛋白，然后再次通过氯仿异戊醇将糖 蛋白和CTAB的结合物除去，最后用-2(TC预冷的异丙醇在室温下短时间使DNA沉淀，可最大 限度减少糖蛋白和DNA共沉淀。由此可见，本发明方法主要是利用高浓度盐溶液使蛋白沉淀 以及CTAB在高离子强度下能使多糖沉淀但不能使核酸沉淀的原理，消除了糖蛋白对DNA 提取的干扰，所得基因组DNA质量较好，能满足PCR反应的要求，使得利用分子手段鉴定燕 窝品种得以实现。此外，本发明方法结果稳定，重现性好，且操作简单、费用低、无需特殊 试剂和仪器。
图1是燕窝中基因组DNA电泳图，其中泳道M: Marker DNA大小标准；S:鲑鱼精基 因组DNA对照品；1-4:实施例l-4提取的DNA; 5-10:实施例5-10提取的DNA; 11-12: 实施例11-12提取的DNA。
图2是实施例3所得的燕窝基因组DNA的巢示PCR产物电泳图，其中泳道M: Marker
DNA大小标准；1: PCR产物。
具体实施方式
例l
1、 材料白燕燕窝，购自新加坡锦兴公司。
2、 方法
取白燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65°。水浴2h， 前半小时轻轻摇动4次。4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C) 加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 。C的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04 M DTT、 200ng/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。3、结果取6^iLDNA溶液于0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。
例2
1、 材料血燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取血燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65。C水浴2h， 前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C) 加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min,然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 'C的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200昭/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、 结果取6pLDNA溶液于0.8n/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。
例3
1、 材料金丝燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取金丝燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g,加入1,2mlSDS缓冲液，65。C水浴 2h，前半小时轻轻摇动4次。4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯 仿异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20 nC)加入0.1体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的 氯仿异戊醇混合液，混合均匀后，4匸下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体 积-2(TC的异丙醇，混合均匀后马上4'C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20匸保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重量体积百分含量为1%SDS、 0.04 M DTT、 200吗/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7M NaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、 结果取6^iLDNA溶液于0.8y。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。
4、 以巢式PCR反应结果检测DNA的提取质量，方法如下
PCR反应缓冲液采用预混合液(2 x )，含Taq酶1.25U/25nl， dNTP各0.4mM， Mg2+ 3mM。 第一次PCR反应体系为25^1，其中premixTaql2.5ial，引物浓度各0.3)aM，模板0.8pl-2^1， 纯水补足体积。循环参数94'C变性lmin， 51。C退火lmin， 72"C延伸90S， 40个循环。首 次循环前94。C变性4min，最后一个循环后72'C延伸4min。正向引物为ND5(序列 TAGCTAGGATCTTTCGCCCT)，反向引物为Thr(序列TCTTTGGTTTACAAGACCAATGTT)。 第二次PCR反应体系为5(^1，其中预混合液25pl，引物浓度各0.3pM，模板1.2pl，纯水补 足体积。循环参数94'C变性30S， 60'C退火30S, 72。C延伸30S， 30个循环。首次循环前 94'C变性2min，最后一个循环后72 °C延伸4min 。正向引物为Cytb413(序列 GTAGGATATGTCCTNCCHTGAGG)， 反向引物为Cytb818(序歹U : GGCATATGCGAATARGAARTATCA)。取第二次PCR产物3pL于2%琼脂糖凝胶中电泳检测。
PCR产物的电泳图见图2，该图显示按本发明方法提取的DNA可进行PCR反应，所得 产物大小符合实验设计(400bp)。
例4
1、 材料怀集出产的燕窝，购自中国广东省怀集县燕窝加工厂。
2、 方法:
取燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入L2mlSDS缓冲液，65'C水浴2h，前 半小时轻轻摇动4次。4"C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异戊 醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C)加 入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，fC下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-2(TC 的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙醇。 沉淀溶解于TE溶液。-20卩保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04M DTT、 200吗/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成；所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。 例5
1、 材料白燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取白燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65。C水浴2h， 前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C) 加入0.1体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后,4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 。C的异丙醇，混合均匀后马上4"下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-20匸保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为0.5°/。 SDS、 0.04MDTT、 200ng/ml蛋白酶k、 0.7M NaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10°/。 CTAB、 0.7M NaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、 结果取6nLDNA溶液于0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。
例6
1、 材料血燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取血燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65"C水浴2h, 前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C) 加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 。C的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-20°<:保存备用。所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的lOmM的EDTA、重 量体积百分含量为2%SDS、 0.04MDTT、 200吗/ml蛋白酶k、 2.0MNaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8c/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。 例7
1、 材料金丝燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取金丝燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2mlSDS缓冲液，65。C水浴 2h，前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯 仿异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20 'C)加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的 氯仿异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体 积-20。C的异丙醇，混合均匀后马上4'C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20"保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为0.5%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 1.4MNaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、 结果取6nLDNA溶液于0.8M琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。
例8
1、 材料怀集出产的燕窝，，购自中国广东省怀集县燕窝加工厂。
2、 方法
取燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2mlSDS缓冲液，65'C水浴2h，前 半小时轻轻摇动4次。4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异戊 醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(2(TC)加 入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20'C的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹千乙醇。 沉淀溶解于TE溶液。-20^保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200ng/ml蛋白酶k、 1.4MNaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10% CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8o/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。 例9
1、材料血燕燕窝，购自新加坡锦兴公司 '2、方法
取血燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65。C水浴2h， 前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(2(TC) 加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 。C的异丙醇，混合均匀后马上4。C下12000xg离心5min，所得沉淀用75。/。乙醇洗漆，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200吗/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成；
所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为5% CTAB、 0.7M NaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8y。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。 例10
1、 材料金丝燕燕窝，购自新加坡锦兴公司
2、 方法
取金丝燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2mlSDS缓冲液，65'C水浴 2h,前半小时轻轻摇动4次。4。C下12000化离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯 仿异戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20'C)加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的 氯仿异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体 积-20'C的异丙醇，混合均匀后马上4t:下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20'C保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的lOmM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水组成； 所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为15%CTAB、 0.7M NaCl和水组成 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，所提取的DNA 条带清晰，说明DNA质量较好。 例11
1、 材料金丝燕燕窝，购自新加坡锦兴公司。
2、 方法
取金丝燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入L2mlSDS缓冲液，65。C水浴 2h，前半小时轻轻摇动4次。4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积苯 酚氯仿异戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等 体积氯仿异戊醇混合液，混合均匀后，4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7 体积-20'C的异丙醇，混合均匀后马上4'C下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤， 吹干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20'<:保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 2.0MNaCl和水组成； 所述的苯酚氯仿异戊醇混合液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25: 24:1。
所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、 结果取6pLDNA溶液于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，泳道11的DNA 加样孔滞留，DNA条带弯曲拖尾，说明用常规的苯酚法提取燕窝DNA效果欠佳。
例12
1、 材料血燕燕窝，购自新加坡锦兴公司。
2、 方法取血燕燕窝干品研磨成120目细粉，称取0.1200g，加入1.2ml SDS缓冲液，65。C水浴2h， 前半小时轻轻摇动4次。4'C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中加入等体积氯仿异 戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液中在室温下(20°C) 加入O.l体积CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入与混合液等体积的氯仿 异戊醇混合液，混合均匀后，4。C下12000xg离心5min取上清。所得上清液加入0.7体积-20 'C的异丙醇，混合均匀后马上4"下12000xg离心5min，所得沉淀用75%乙醇洗涤，吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(rc保存备用。
所述的SDS缓冲液由pH为8.0的50mM的Tris-HCl、 pH为8.0的10mM的EDTA、重 量体积百分含量为1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k和水组成；
所述的CTAB缓冲液由重量体积百分含量为10%CTAB、 0.7MNaCl和水组成； 所述的氯仿异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1。
3、结果取6pLDNA溶液于0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1所示，电泳图泳道12 中显示没有DNA，说明裂解时的SDS缓冲液若不含NaCl，不能提取到燕窝DNA。
权利要求
1、燕窝全基因组DNA的提取方法，该方法由以下步骤组成(1)取燕窝干品研磨成120目细粉，按重量体积比为1∶10加入SDS缓冲液，于65℃水浴2小时，高速离心；(2)取上清，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合均匀，高速离心；(3)取上清，在室温下加入十分之一体积的CTAB缓冲液，混合均匀后室温下放置15min，然后加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀，高速离心；(4)取上清，加入0.6～0.8体积倍预冷的异丙醇，混匀后立即高速离心；(5)取沉淀物用75～80％乙醇洗涤后将乙醇吹干，溶于TE溶液，即可；上述步骤中，所述的SDS缓冲液是Tris-HCl、EDTA、SDS、DTT、蛋白酶k和NaCl的混合水溶液，其中Tris-HCl的浓度为30～100mM，EDTA的浓度为8～30mM，SDS的浓度为5～20g/L，DTT的浓度为0.04M，蛋白酶k的浓度为100～300mg/L，NaCl的浓度为0.7～2.0M；所述的CTAB缓冲液是CTAB和NaCl的混合水溶液，其中CTAB的浓度为50～150g/L，NaCl的浓度为0.7M。
2、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的SDS缓冲液中的SDS浓度是10g/L， NaCl浓度是2.0M。
3、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的CTAB缓冲液中CTAB的浓度为 100g/L。
4、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(4)所述的异丙醇的用量为0.7体 积倍。
5、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(5)所述的乙醇的浓度为75%。
6、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的Tris-HCl的浓度为50mM。
7、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的EDTA的浓度为10 mM。
8、 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的蛋白酶k的浓度为200mg/L。
9、 如权利要求1 8之一所述的提取方法，其特征在于所述的燕窝是雨燕科金丝燕属或 雨燕属的鸟类分泌出的唾液或唾液与其绒羽混合而成的凝胶干结物。
全文摘要
本发明提供了一种从燕窝中提取基因组DNA的方法，该方法是首先利用SDS和DTT使燕窝中细胞裂解，在裂解的同时用高浓度的NaCl除去大部分糖蛋白，可减少纯化时糖蛋白对DNA的干扰，接着用氯仿异戊醇结合CTAB进一步除去糖蛋白，最后用异丙醇在低温下短时间使DNA沉淀，可最大限度减少糖蛋白和DNA共沉淀。本发明方法结果稳定，重现性好，且操作简单、费用低、无需特殊试剂和仪器，所得基因组DNA质量较好，能满足PCR反应的要求，可实现燕窝品种的鉴定。
文档编号C07H21/00GK101423542SQ200810219930
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者雁 候, 冼小敏, 华 周, 林洁茹, 王培训, 蒋东旭, 赖小平, 陈建南, 松 黄 申请人:广州中医药大学