专利名称：一种白果酚的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种白果酚(ginkgols)的制备方法。
背景技术：
银杏(GMgoW/o^L.)是我国特有的古老树种，银杏的叶、果均可入药，据"本草" 记载，银杏作为药用已有六百多年的历史，二十世纪六十年代以来，银杏黄酮、内酯两 大成分独特的药理作用和临床效果得到肯定，使银杏产首先在欧洲被广泛接受，目前以 银杏黄酮、内酯为药效成分的银杏叶提取物(Extract of Ginkgo biloba，EGb)是公认的预 防、治疗心脑血管疾病的天然植物药。
银杏酚酸是存在于银杏中的另一大类活性成分，银杏中的垸基酚酸类物质包括白果 酚(ginkgols)、银杏酸(ginkgolicacids)和白果二酚(bilobols)，三者的结构式如下
其中银杏酸的含量约占银杏叶干重的1%，外种皮干重的5%。由于银杏酸可疑的致 敏作用，长期以来被认为是EGb中的有毒成分，要求其在EGb761中的含量必须在5ppm 以下；而白果酚没有银杏酸所具有的致敏作用，因此在银杏叶提取物中对其没有限量要 求。
随着人们对银杏叶及其提取物中的酚酸类物质的研究逐渐深入，发现银杏酸除了可 疑的致敏作用外还具有许多生物活性已有的研究表明银杏酸对多种G+菌有良好的抑制
作用，能抑制部分人致病真菌及农业病源菌的生长。银杏酸对多种肺癌细胞株、淋巴瘤
细胞株的生长有很好的抑制作用，而对正常细胞的毒性作用较小；作者研究了银杏酸对 淋巴瘤U937细胞的影响，发现银杏酸能诱导U937细胞凋亡，说明银杏酸的抗肿瘤作用与 诱导肿瘤凋亡有关。银杏酸还具有良好的杀灭钉螺作用，是银杏外种皮中的主要灭螺活 性成分，相关工作作者已申请了相关专利(一种植物杀钉螺剂及其制备方法与使用方法)，
并获得授权(专利号ZL2005 1 0122657.6)。
有关银杏酸的提取、制备、分析及活性已有多篇文献报导
1.仰榴青，吴向阳，陈钧.高效液相色谱法测定银杏外种皮中的银杏酸.分析化学，2002， 30 (8): 901-905.
2. Van Beek T.A. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts .■ J. ChromatographyA, 2002, 967:21-55.
3. H. Jaggy, E. Koch. Chemistry and Biology of Alkyphenols from Ginkgo biloba L. Pharmazie,1997,52:735-738.
4. 杨小明，朱伟，陈钧，等.银杏酸单体的抗菌活性研究.中药材，2004， 27 (9):
5. 杨小明；钱之玉；陈钧.银杏外种皮中银杏酸的体外抗肿瘤活性研究.中药材，2004， 27 (1): 40-42.
6. 吴向阳，仰榴青，陈钧.银杏酸单体的制备及抗菌作用研究.林产化学与工业，2003， 发明人在进一步的研究中发现银杏酸结构中的羧基对热具有不稳定性，在加热的
过程中容易脱羧而转化成白果酚；作者通过生物活性测定，发现白果酚的抗肿瘤活性比 银杏酸更强，因此白果酚可以作为一种比银杏酸具有更强抗肿瘤效果、而无致敏作用的 活性物质进行开发研究，有关白果酚抗肿瘤药物的研究对研发新型肿瘤治疗药物、对银 杏资源的充分开发利用，将产生巨大的社会和经济效益。
由于白果酚在银杏叶、果及外种皮中的含量显著低于银杏酸，因此，除了直接从银 杏中制备白果酚外，利用银杏酸容易脱羧的特点，通过银杏酸脱羧制备白果酚不失为一 种更经济的白果酚制备方法。
有关利用银杏酸脱羧制备白果酚的方法，及白果酚的抗肿瘤活性目前均尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的化合物——白果酚的制备方法及其抗 肿瘤的用途。
本发明所涉及的白果酚为烷基或烯基苯酚类化合物，具有通式(I)的结构。其中， R链为垸基或烯基，是抗肿瘤的主要活性成分，主要存在于银杏^"^0&//06".)的叶、 果和外种皮中，或漆树科漆树属植物的叶、果及树皮中。其R基上的碳原子数为10 19， 双键数0~3。其R基上碳原子可被其它原子，如O、 S 、 N或卤素原子取代。
本发明所述白果酚可以采用以下方式制备
以银杏酸为原料，采用加热方法脱除银杏酸苯环上的羧基，转化成白果酚，具体如
下
1、将银杏酸与碱金属、碱土金属或过渡金属氢氧化物按100:1 ~10:1的比例(g/g)混合后， 在8(TC 10(TC加热、搅拌条件下进行1~4小时，脱去羧基得到白果酚粗品；
661-663.2、 在白果酚粗品中加入2 10倍量(g/ml)的有机溶剂溶解，过滤，浓缩得到粗产物；
3、 将粗产物用硅胶柱层析纯化，得到纯度不小于96%的白果酚同系物。 上述制备方法中，碱金属氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾； 上述制备方法中，碱土金属氢氧化物为氢氧化铍、氢氧化镁或氢氧化钡； 上述制备方法中，过渡金属氢氧化物为氢氧化铜、氢氧化铁或氢氧化锌，但不限于这三 种过渡元素氢氧化物；
上述制备方法中，有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿； 上述制备方法中，所述硅胶柱层析纯化为梯度洗脱，洗脱液为氯仿和氯仿-甲醇混合溶液， 氯仿-甲醇混合溶液比例从9: 1 (v/v)逐渐变为5: 5 (v/v)，但不限于这一洗脱剂组合 体系。
所述的银杏酸通过化学分离方法，从银杏的叶、果、外种皮的提取物中得到；或对 银杏叶提取物在提取加工过程中剩余的肥料中重新回收；或从其它植物含有本类化合物 的各部分提取物中获得。
包含本发明化合物的药物可以是来源于银杏的叶、果和外种皮的提取物，也可以是 来源于其它植物含有本类化合物的各部分提取物。
本发明要求保护该化合物及其药学上可接受的盐，酯，溶剂化物，结晶形态 的物质。
包含本发明化合物的药物可以单独作为抗肿瘤剂使用，也可与其它抗肿瘤剂联合使 用，以降低抗肿瘤效果或降低其毒副作用。
包含本发明化合物的药物组合含有药物可以接受的载体;所述的组合物可以是注射液 或口服药物制剂。
从植物中寻找抗肿瘤药物，在国内外均为抗癌药物研究的重点，有效地抗肿瘤化合 物具有重要的临床价值和开发前景。我国有着丰富的银杏资源，每年随着白果的生产， 大量的银杏外种皮被作为废弃物浪费掉，利用银杏外种皮中含量丰富的银杏酸为原料， 制备具有显著抗肿瘤活性的白果酚化合物，对于新型抗肿瘤药物的开发，对于银杏资源 的充分利用都具有重要意义。 具体实施方法
实施例l:白果酚同系物的制备 (1)银杏酸的提取
将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1: 5的比例加入石油醚(沸程60 90。C)超声萃取lh，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。
将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的
玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脱，以薄层层析在 254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓縮至干；重复过柱一次，得到的银杏酸 组分水洗至中性，浓縮至干，或用无水NaS04干燥后，得银杏酸混合物。
(2) 白果酚的制备
取1.0 g银杏酸和0.02 g NaOH混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入IOO'C的水浴， 磁力搅拌l小时，混合物冷却至室温，得到0.9g的白果酚，然后用3.0mL乙醇萃取。过 滤，浓縮得到一黑褐色油状物。
该产物以乙醇溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的玻璃柱， 湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9: 1逐渐变为5: 5, V/V) 洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓缩至干；重复过柱 一次，得到的白果酚同系混合物。
(3) 白果酚的鉴定
制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201， 275nm; 红外光谱(KBr压片)上3340cm-1处有宽的vo.H振动，1260 cm"处vc.o和1370 cm"处的 So-H (面内)均可证实为垸基取代苯酚。
LC-ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷伦TC18柱(150x4.6腿,5nm)， 流动相甲醇一3MHAc溶液(90:10,v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276， 304， 302， 330， 328，分别对应于银杏酸C13:0,C15:0,C15:1，C17:1和C17:2。 实施例2:白果酚同系物的制备
(4) 银杏酸的提取
将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按l: 5的比例加入石油醚(沸程60 90。C)超声 萃取lh，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。
将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的 玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脱，以薄层层析在 254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓縮至干；重复过柱一次，得到的银杏酸 组分水洗至中性，浓縮至干，或用无水NaS04干燥后，得银杏酸混合物。
(5) 白果酚的制备
取1.0 g银杏酸和0.01g Mg (OH) 2混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入9(TC的水浴，磁力搅拌l小时，混合物冷却至室温，得到0.9g的白果酚，然后用8.5mL乙酸乙酯 萃取。过滤，浓縮得到一黑褐色油状物。
该产物以乙醇溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的玻璃柱， 湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9: 1逐渐变为5: 5， V/V) 洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓縮至干；重复过柱 一次，得到的白果酚同系混合物。 (6)白果酚的鉴定
制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201, 275nm; 红外光谱(KBr压片)上3340cm"处有宽的vo.H振动，1260 cm'1处Vc.o和1370 cm'1处的 So-H (面内)均可证实为烷基取代苯酚。
LC陽ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷伦TCI 8柱(150x4.6mm,5^im)，流 动相甲醇一3%HAc溶液(90:10,v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276， 304， 302， 330， 328，分别对应于银杏酸C13:0，C15:0,C15:1,C17:1和C17:2。 实施例3:白果酚同系物的制备及抗肿瘤活性
(1) 银杏酸的提取
将100g干燥、粉碎的银杏外种皮，按1: 5的比例加入石油醚(沸程60 90'C)超声
萃取lh，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取，挥去石油醚得外种皮提取浸膏。
将浸膏分次用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的 玻璃柱，湿法装柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脱，以薄层层析在 254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分，浓縮至干；重复过柱一次，得到的银杏酸 组分水洗至中性，浓縮至干，或用无水NaS04干燥后，得银杏酸混合物。
(2) 白果酚的制备
取1.0 g银杏酸和0.08 g Cu(OH)2混于一个50ml的单颈烧瓶中，浸入80。C的水浴， 磁力搅拌4小时，混合物冷却至室温，然后用5.0mL丙酮萃取。过滤，浓縮得到一黑褐 色油状物。
该产物以氯仿溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32X400mm的玻璃柱， 湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例从9: 1逐渐变为5: 5， V/V) 洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓縮至干；重复过柱 一次，得到的白果酚同系混合物。
(3) 白果酚的鉴定
7制备得到的白果酚同系物为浅棕色液体，其甲醇溶液紫外吸收峰分别为201， 275nm; 红外光谱(KBr压片)上3340cm"处有宽的vo-H振动，1260 cm'1处vc-o和1370 cm"处的 S0-H (面内)均可证实为垸基取代苯酚。
LC-ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷伦TCI 8柱(150x4.6腿,5ijm)，流 动相甲醇一3n/。HAc溶液(90:10,v/v)，测得白果酚5个同系物的质量分别为276， 304， 302， 330， 328，分别对应于银杏酸C13:0，C15:0，C15:1,C17:1和C17:2。
(4)白果酚同系物的抗肿瘤活性
采用MTT法，白果酚以DMSO溶解，再用DMEM培养液稀释成需要浓度；将对 数生长的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液制成5xl04 个/mL细胞悬液，接种至96孔培养板中，每孔20(^L于37'C， 5%0)2的培养箱内培养 24 h后，将不同浓度的药液加入上述培养孔内，设5个平行孔，以含10%胎牛血清的 DMEM培养液为阴性对照，顺铂为阳性对照，继续培养48 h，中止前4 h加入5mg/ml MTT 溶液2(^L，培养4h后吸出培养液，加入DMSO20(VL，震荡均匀，在490nm处测定光 密度(OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。抑制率(％) =1- (OD实验-OD空白)/ (OD对照-OD空自)X100%。 实验设三次重复。
试验了白果酚对人肝癌细胞株SMMC7721、人白血病细胞株K562和人胶质瘤细胞株 U251的细胞毒性，结果见表l。
表l、银杏酸、白果酚对人肿瘤细胞的抑制作用LDso(mg/L)
细胞SMMC7721K562U251
白果酚6.852.714.8
银杏酸13.067.821.6
顺铀4.24.56.权利要求
1、一种白果酚的制备方法，其特征在于以银杏酸为原料，采用加热方法脱除银杏酸苯环上的羧基，转化成白果酚。
2、 如权利要求l所述的一种白果酚的制备方法，具体为(1)将银杏酸与碱金属、碱土金属或过渡金属氢氧化物按100:1 ~10:1的比 例(g/g)混合后，在80°C~ IO(TC加热、搅拌条件下进行1 4小时，脱去羧基得到 白果酚粗品；(2) 在白果酚粗品中加入2 10倍量(g/ml)的有机溶剂溶解，过滤，浓縮得 到粗产物；(3) 将粗产物用硅胶柱层析纯化，得到纯度不小于96%的白果酚同系物；
3、 如权利要求2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于碱金属氢氧 化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾。
4、 如权利要求2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于碱土金属氢 氧化物为氢氧化铍、氢氧化镁或氢氧化钡。
5、 如权利要求2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于过渡金属氢 氧化物为氢氧化铜、氢氧化铁或氢氧化锌。
6、 如权利要求2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于有机溶剂为 丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿。
7、 如权利要求2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于所述硅胶柱层析纯化为梯度洗脱，洗脱液为氯仿和氯仿-甲醇混合溶液，氯仿-甲醇混合溶液比例从9: 1 (V/V)逐渐变为5: 5 (V/V)。
8、 如权利要求1或2所述的一种白果酚的制备方法，其特征在于所述的 银杏酸通过化学分离方法，J人银杏的叶、果、外种皮的提取物中得到；或对银杏 叶提取物在提取加工过程中剩余的肥料中重新回收；或从其它植物含有本类化合 物的各部分提取物中获得。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种白果酚的制备方法。所述白果酚是用包括如下步骤的方法制备的从银杏(叶、果及外种皮)中制备得到银杏酸，将银杏酸加热处理脱羧，经纯化制得白果酚。本发明所制备的白果酚可有效地抑制人肿瘤细胞增殖，其对人肿瘤细胞的抑制作用均优于银杏酸。
文档编号C07C37/50GK101514143SQ20081023428
公开日2009年8月26日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者方 刘, 杨小明, 龚爱华 申请人:江苏大学