胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途的制作方法

专利名称：胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗性肽领域，即涉及胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)的新型延长型肽衍 生物。
背景技术：
已使用一系列不同的方法修饰GLP-I化合物的结构，以便提供更长的体内作用时程。WO 2006/097535公开了具有分泌素样活性的胰高血糖素家族的多种肽激动剂及 其治疗用途。在其实施例3和5中公开了包含修饰的GLP-I (7-37)序列的GLP-I (7-37)衍 生物。然而，这些衍生物在22位不具有Glu残基，以及在26位不具有Arg残基。WO 01/04156公开了降低血糖水平的肽。其化合物4、5、6、7、10、11、12和13为 GLP-I衍生物，然而，这些化合物没有一个在22位具有Glu残基和在26位具有Arg残基。EP 1364967公开了胰高血糖素样促胰岛素肽、组合物和方法。其实施例1的5种 GLP-I组合物没有一个包含在22位具有Glu且在26位具有Arg的修饰的GLP-I序列。WO 98/08871公开了延长的GLP-1衍生物，包括利拉鲁肽(Iiraglutide)，其为 GLP-I衍生物，每日给予1次，由Novo NordiskA/S开发。预期利拉鲁肽从2009年起上市治 疗2型糖尿病。利拉鲁肽在22位不具有Glu，在26位不具有Arg。在该参考文献的实施例 30中公开的衍生物具有，但在18、20、23、30、31、34、36、37或39位未被衍生化。WO 2005/027978公开了新的GLP-1衍生物，包括三种，其包含在22位具有Glu且 在26位具有Arg的修饰的GLP-I (7-37)序列。然而，这些衍生物在18、20、23、30、31、34、 36、37或39位未被衍生化。在本发明的优先权日后公布的Runge等人(Journal of BiologicalChemistry, 283卷，第17章，11340-11347页)公开了配体结合的GLP-I受体的胞外结构域的晶体结构。许多糖尿病患者，尤其是处于2型糖尿病的患者存在所谓的“注射恐惧症 (needle-phobia) ”，即极为畏惧自己注射。在2型糖尿病中，大部分患者用口服降糖药物治 疗，且因为预期GLP-I化合物是将给予这些患者的注射药品，所以畏惧注射可能成为广泛 使用这样的临床上非常有前景的化合物的严重障碍。因此，需要开发可低于每日1次给予 的新化合物，例如每2天或3天给予1次，优选每周给予1次，同时保留可接受的临床特点， 或者任选经由非侵入性给予，例如肺部给予、鼻给予、舌下给予、口颊给予或经口给予。本发明的一个目标是提供在化学上、物理上和酶学上稳定的GLP-I衍生物，其优 选具有高α-螺旋含量。本发明的又一个目标是提供长效(即具有上述给予方案)的GLP-I衍生物。本发明的另一个目标是提供具有高效力(受体亲和性)的GLP-I衍生物，以便降 低治疗剂量，例如用于每周1次皮下给药或者替代地非侵入性传递。本发明的另一个目标是提供对GLP-I受体(GLP-IR)的胞外结构域具有高结合亲 和力的GLP-I衍生物。本发明的另一个目标是提供具有高白蛋白结合亲和力的GLP-I衍生物，其保护所述肽免于蛋白水解降解并降低所述肽的肾清除率。效力、稳定性、半衰期、对白蛋白的结合亲和力以及对GLP-I受体的胞外结构域的结合亲和力是实现长效、稳定、治疗有效、有潜力每周给予1次的GLP-I衍生物的整体目标 的潜在相关特性。发明概述在本发明的一个方面，提供包含修饰的GLP-I (7-37)序列的GLP-I衍生物，所述修 饰的GLP-I (7-37)序列具有:i)与GLP-I (7-37) (SEQ IDNo 1)相比总共2-12个氨基酸修 饰，包括a)在等同于GLP-I (7-37)的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于GLP-I (7_37) 的26位的位置的Arg残基；和ii)在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化 等同于 GLP-I (7-37)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。又一方面，提供本发明的衍生物的药物组合物、方法和用途。发明描述定义和优选实施方案在本说明书中，以下术语具有所示含义本文使用的术语“多肽”和“肽”是指由通过肽键连接的至少5个组成氨基酸组成 的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸，它们可以为不是由遗传密码编 码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不是由遗传密码编码的天然氨基酸为例如Y-羧基谷 氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成生产的 氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨 基异丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、β -丙氨酸、3_氨基甲基苯甲酸、邻 氨基苯甲酸。22种形成蛋白质的氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。因此，非形成蛋白质的氨基酸(其也可以被称为非天然氨基酸)是可以经由肽键 掺入到肽中的部分，但不是形成蛋白质的氨基酸。实例为Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝 氨酸、D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺)。合成的非形成蛋白质的氨基酸包括 通过化学合成生产的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和 D-亮氨酸、Aib ( α -氨基异丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、3_氨基甲 基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、去_氨基-组氨酸(缩写为去氨基His，替代名称咪唑并丙酸，缩 写Impr)、氨基酸的β类似物(例如β -丙氨酸等)、D-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β -羟 基_组氨酸、高组氨酸、N α -乙酰基-组氨酸、α -氟甲基-组氨酸、α -甲基-组氨酸、α， α - 二甲基-谷氨酸、Hi-CF3-苯丙氨酸(简写Hi-CF3-Phe)、α，β - 二氨基丙酸(简写Dap)、 3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基) 甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环 辛基)甲酸。本文在提到多肽时使用的术语“类似物”是指修饰的肽，其中所述肽的一个或多个 氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代，和/或其中在所述肽的C-末端的一个氨基酸残基已 由所述肽缺失，或者其中在所述肽的C-末端添加了一个氨基酸残基。
本文使用的术语“修饰的肽”是指如上定义的修饰的肽。对于本发明用途，该术语 可以与术语“修饰的肽序列，，互换使用。与此相符，术语“修饰，，在本文与肽序列关联使用 时是指氨基酸取代、添加和/或缺失。对于本发明用途，任意的氨基酸取代、缺失和/或添加是指人GLP-I (7-37)的序 列，其在本文作为SEQ ID No:l纳入。然而，序列表中的氨基酸残基的编号总是以1开始， 而对于本发明用途，我们依从本领域现有的实践想以第7位的氨基酸残基开始，并为其指 定编号7。因此，一般而言，本文对GLP-I (7-37)序列的位置编号的任何提及均是指以7位 的His开始并以37位的Gly结束的序列。经常使用简单的体系描述类似物例如[Arg34] GLP-I (7-37) Lys是指这样的 GLP-I (7-37)类似物在34位的天然赖氨酸已被精氨酸取代，并且在C-末端氨基酸残基 (即Gly37)上添加了一个赖氨酸。该GLP-I类似物因此与GLP-I (7-37)相比具有两个氨基 酸修饰，即一个取代和一个添加。表述“等同于......的位置”在本文用于表征修饰的GLP-I (7-37)序列时，是
指天然GLP-I (7-37)序列(具有SEQ ID No :1的序列)中的相应位置。相应的位置易 于例如通过简单的手写和目测来推断。替代地，可以使用标准的蛋白质或肽比对程序，例 如为Needleman-Wunsch比对的“比对”。所述算法描述于Needleman，S. B.和Wunsch， C. D. , (1970), Journal of Molecular Biology，48 :443_453，以及 Myers 和 W. Miller 载 于"Optimal Alignments in Linear Space，，CABIOS(computer applicationsin the biosciences) (1988)4 :11-17的比对程序。为了比对，可以使用默认的计分矩阵BL0SUM50 和默认的单位矩阵，在空位中的第一个残基的罚分可以设定为-12，在空位中的附加残基的 罚分为-2。作为另一个实例，本文的实施例1的GLP-I衍生物包含以下的修饰的GLP-I (7-37) 序列:[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)酰胺，其具有总共5个氨基 酸修饰(在此情况下所有的取代)，包括在等同于GLP-I (7-37)的22位的位置的Glu和在 等同于GLP-I (7-37)的26位的位置的Arg。未指明光学异构体的所有氨基酸都被理解为是指L-异构体。本文关联肽使用的术语“衍生物”是指化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取 代在未修饰的肽或其类似物中不存在，即已共价修饰的肽。典型的修饰为酰胺、碳水化合
物、烷基、酰基、酯等。本发明的GLP-I衍生物在选自18、20、23、30、31、34、36、37或39位的位置被白蛋 白结合残基衍生化或PEG化。所述衍生化是指如上所释的共价键。例如，可以经由化学键将赖氨酸残基或半胱氨酸残基连接至白蛋白结 合残基。这 样的化学键可以作为通过用白蛋白结合残基的活性酯如长脂肪酸酰化衍生化赖氨酸的ε 氨基获得的实例。本发明的GLP-I衍生物(GLP-1 (7-37)的类似物的衍生物)的实例是 N- ε 37 {2- [2- (2_ {2_ [2_ ((R) -3-羧基-3- {[1_ (19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰基]氨基} 丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基His7，Glu22， Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I (7-37)酰胺(本文实施例1的化合物)。在该化合物中，在37 位的天然Gly已被赖氨酸取代，所述赖氨酸已在N- ε 37被以下的白蛋白结合残基衍生化{2- [2- (2- {2- [2- ((R) -3-羧基-3- {[1_ (19-羧基十九酰基)哌啶_4_羰基]氨基}丙酰氨 基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基(结构1) 结构1并且其中，在7位的天然组氨酸已被去氨基His取代，在22位的天然甘氨酸 已被谷氨酸取代，在26位和34位的赖氨酸已被精氨酸取代。在该衍生物中，[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I (7-37)酰胺的 GLP-1 (7-37)类似物已在等同于 GLP-I (7-37)的37位的位置，即在37位的Lys的ε氨基处，被白蛋白结合残基衍生化(通 过酰胺键共价修饰)。因此，GLP-I衍生物为具有两个组成部分的化合物彼此共价连接的 GLP-I肽部分和衍生部分。已衍生化的氨基酸残基可以包含氨基。包含氨基的氨基酸残基的实例为赖氨酸、 鸟氨酸、ε "N-烷基化的赖氨酸(例如ε -N甲基赖氨酸)、0_氨基乙基丝氨酸、0_氨基丙基 丝氨酸或者在侧链包含伯氨基或仲氨基的更长的0烷基化丝氨酸。在本发明的又一方面， 衍生化的氨基酸残基在侧链包含伯氨基。包含伯氨基的氨基酸残基的实例为赖氨酸、鸟氨 酸、0-氨基乙基丝氨酸、0-氨基丙基丝氨酸或者在侧链包含伯氨基的更长的0烷基化丝氨 酸。在本发明的又一方面，衍生化的氨基酸残基为赖氨酸。在本发明的又一方面，本发明的 衍生物仅在一个位置衍生化，例如仅一个氨基酸残基被衍生化。连接用于本发明的两个化学部分的其它实例包括但不限于烷基化、酯形成、酰胺 形成或马来酰亚胺偶联。本文使用的术语“GLP-1 肽”是指 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)或其 GLP-1 (7-37) 类似物。术语“GLP-1 (7-37) ”意在包括GLP-I (7-37)(即所述肽)，以及相应的酰胺，该术语 还应用于GLP-I (7-37)类似物。在具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物为酰胺。在另一个具体的实施方案 中，其为肽，即衍生物的GLP-I肽部分在C-末端具有游离羧基。术语‘‘GLP-I (7-34)，，、"GLP-1 (7-35)，，、"GLP-1 (7-36)，，、"GLP-1 (7-38)，，、 "GLP-1 (7-39) ”、“GLP-1 (7-40) ”、“GLP-1 (7-41) ”或其衍生物偶尔在本文用于指定本发明的 衍生物的GLP-I肽部分的确切长度。例如，“GLP-1 (7-34)衍生物”是指GLP-I (7-37)衍生 物，其中后3个C-末端氨基酸残基已缺失。作为另一个实例，“GLP-l(7-39)衍生物”是指 GLP-I (7-37)衍生物，其中两个氨基酸残基已被添加至C-末端。在优选的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物具有下式(I)的序列=Xaa7-Xaa8-Xa a9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25_Arg —X&&27_1^式(I)(SEQ ID No 2)其中，
(Xaa7-Xaa8)为(L_组氨酸_Aib)、(去氨基-组氨酸-丙氨酸)或(去氨基-组 氨酸-Aib)；Xaa9 为 Glu 或 Glu 衍生物；Xaa16 为 Val 或 Leu ；Xaa18 为 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 为 Leu 或 Lys ；Xaa23 为 Gin、Glu、Lys> Cys 或 Arg ；Xaa24 为 Ala 或 Asn ；Xaa25 为 Ala 或 Val ；Xaa27 为 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28 为 Phe 或 Phe 衍生物；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 为 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Cys, Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在；且所述GLP-I 衍生物在选自等同于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、 31、34、36、37或39位的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化。"Glu衍生物”的非限制性实例为α，α - 二甲基-Glu。"Phe衍生物”的非限制性实例为CF3-Phe,例如Hi-CF3-Phe (参见例如实施例3的化 合物)。术语ε -氨基-Lys (或ε -Lys)意在表示第38位氨基酸残基赖氨酸经由其ε氨 基结合GLP-I (7-37)肽，而不(经常是这种情况)经由其α氨基(参见例如实施例28的 化合物)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Gl u_G ln_A la_Ala_Arg-G Iu-Phe-1 Ie-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xa
一一 Xa3<4o一 一R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7为L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组氨酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸； Xaa8 为 Ala、Gly, Val、Leu、lie、Lys, Aib、(1_ 氨基环丙基)甲酸、(1_ 氨基环丁 基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨 基环辛基)甲酸；Xaa18 为 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Lys 或 Trp ；Xaa33 为 Val 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在；且所述GLP-I 衍生物在选自等同于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、 31、34、36、37或39位的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化。本文使用的术语“接头，，是指分隔肽和白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物的间隔 基(两个术语间隔基和接头在本说明书中可互换使用)。本文使用的术语“药学上可接受的”是指适于正常的药物应用，即在患者等当中不 产生严重的副反应事件。本文使用的术语“赋形剂”是指化学化合物，其一般被加入到药物组合物中，例如 缓冲剂、渗透压剂、防腐剂等。本文使用的术语“有效量”是指与无治疗相比足以有效治疗患者的剂量。本文使用的术语“药物组合物”是指包含本发明的活性衍生物或其药学上可接受 的盐、酰胺、烷基、酯等连同药物赋形剂(例如缓冲剂、防腐剂和任选的渗透压调节剂和/或 稳定剂)的产物。因此，药物组合物在本领域也被称为药物制剂。本文使用的术语“(某)疾病的治疗”或“治疗(某)疾病”是指已发生疾病、病症 或障碍的患者的管理和照料。治疗的目的是对抗疾病、病症或障碍。治疗包括给予本发明 的活性衍生物，以消除或控制疾病、病症或障碍，以及缓解与疾病、病症或障碍相关的症状 或并发症。在本发明的一个方面，接头包含一个或多个烷撑二醇单元，例如1-5个烷撑二醇 单元。烷撑二醇单元在又一方面为乙二醇、丙二醇或丁二醇，但也可以为更高级的烷撑二 醇。在本发明的另一方面，接头为选自-(CHADKognEKogp-Qq-的亲水接头，其中
l、m 和 η 独立地为 1-20，ρ 为 0-10，Q 为-Z- (CH2) XD [ (CH2) nG] m (CH2) p-，q为在0-5范围内的整数， D、E 和 G 各自独立选自-0-、-NR3-、-N (COR4)-、-PR5(O)-和-P(ORe) (0)-，其中 R3、 R4> R5和R6独立地代表氢或CV6-烷基，Z 选自-C (0) NH-、-C (0) NHCH2-、-OC (0) NH-、-C (0) NHCH2CH2-、-C (0) CH2-、-C (0) CH =CH-、- (CH2) s-、-C (0) -、-C (0) 0-或-NHC (0)-，其中 s 为 0 或 1。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中1为1或2，n和m独 立地为1-10，P为0-10。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中D为-0-。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中E为-0-。在本发明的又一方面，亲水接头为-O^OKCHAOKag^-，其中m为1-10，ρ为 1-3，Q 为-Z-CH2O[(CH2)20]m(CH2)p-,其中 Z 如上定义。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中q为1。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中G为-0-。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中Z选自-C(O) NH-、-C (0) NHCH2-和-OC (0) NH-。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中q为0。在本发明的另一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中1为2。在本发明的又一方面，所述接头为如上定义的亲水接头，其中η为2。在本发明的一个方面，使用以化学部分分隔肽和白蛋白结合残基的“亲水接头”。在本发明的一个方面，所述亲水接头为-C (0) - (CH2) f0_ [ (CH2CH2-O] m_ (CH2) p-[NHC (O)-(CH2) f0-[ (CH2) n-0]m-(CH2) Ρ]ΓΝΗ-，其中 l、m、n 和 ρ 独立地为 1-5，q 为 0-5。在本发明的又一方面，所述亲水接头为-C(0) -CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 [NHC (0) -CH2 -O-CH2CH2O-CH2CH2] ,-NH-，其中 q 为 0-5。在本发明的又一方面，所述亲水接头为-C(0) -CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NHC (0) -CH2 -O-CH2CH2O-CH2CH2-NH-。在本发明的又一方面，所述亲水接头为_[CH2CH20]m+1(CH2)pQ「，其中m和ρ独立地 为 0-10，而 Q 为如上定义的-Z-(CH2) P [ (CH2)nG]m (CH2)ρ-。在本发明的又一方面，所述亲水接头为-(CH2) r0- [ (CH2) n-0] m_ (CH2) p- [C (0) NH-(CH2)1-O-[(CH2)n-0]m-(CH2)1Jr，其中 l、m、n 和 ρ 独立地为 1-5，q 为 0-5。在本发明的又一方面，所述接头包含除Cys之外的氨基酸残基，或者诸如Gly-Lys 的二肽。在本文中，表述“诸如Gly-Lys的二肽”用于指示一种二肽，其中C-末端氨基酸残 基为Lys、His或Trp，优选为Lys，且其中N-末端氨基酸残基选自Ala、Arg、ASp、ASn、Gly、 Glu、Gin、lie、Leu、Val.Phe 和 Pro。适宜的PEG聚合物通常市售可得，或者可以通过本领域技术人员众所周知的技术 制备。在本发明的一个方面，GLP-I衍生物已被PEG化。在具体的实施方案中，PEG聚合物具有大于700D的分子量。在进一步的实施方案中，分子量大于5kD、大于IOkD和大于20kD。PEG聚合物可为线性的或分支的。就PEG 聚合物大于20KDa的情况而言，PEG聚合物优选具有分支结构，例如43kD的分支PEG-肽 (ShearwaterfOOl 目录号 2D3XOTOl, mPEG2-MAL)。可以通过将PEG连接在与受体相互作用的肽表面的对侧完成PEG在完整的肽上的 连接。有几种策略将PEG偶联至肽(参见例如Veronese，Biomaterials22 :405_417， 2001)，所有这些策略都通过整体引用结合到本文中。本领域技术人员因此将能够利用众所 周知的技术将PEG聚合物连接至本文描述的GLP-I肽。简而言之，半胱氨酸PEG化是一种用于位点特异性PEG化的方法，并可以如下实 现在人胰淀素或胰淀素类似物上的其中一个特定位置引入唯一的半胱氨酸突变，然后使 所获得的肽与半胱氨酸特异性PEG化试剂如PEG-马来酰亚胺反应。可能必须突变所述肽， 以便允许位点特异性PEG化。例如，如果所述肽包含半胱氨酸残基，则需要用保守氨基酸取 代，以便确保位点特异性PEG化。另外，可以将刚性接头(包括但不限于“GGS”、“GGSGGS” 和“PPPS”)加至C-末端，但在PEG连接位点(即唯一的半胱氨酸残基)之前。另一方面，本发明的GLP-I衍生物已被白蛋白结合残基衍生化。在一个实施方案中，白蛋白结合残基为亲脂残基。在又一个实施方案中，亲脂残基任选地通过缀合化学(例如通过烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成)经由接头连接至赖氨酸 残基，或者通过马来酰亚胺偶联连接至半胱氨酸残基。在本发明的又一个实施方案中，白蛋白结合残基于生理PH带负电荷。在本发明的 另一方面，白蛋白结合残基包含可以带负电荷的基团。可以带负电荷的一个优选基团为羧基。在本发明的再一个实施方案中，白蛋白结合残基选自直链烷基、支链烷基、具有 ω-羧酸基团的基团以及部分或完全氢化的环戊烯并菲(cyclopentanophenanthrene)骨
^K O在本发明的又一个实施方案中，白蛋白结合残基为汽巴克隆(cibacronyl)残基。在本发明的又一个实施方案中，白蛋白结合残基具有6-40个碳原子、8-26个碳原 子或8-20个碳原子。在本发明的又一个实施方案中，白蛋白结合残基为选自CH3(CH2)XO-的酰基， 其中r为4-38的整数，优选为4-24的整数，更优选选自CH3 (CH2) 6C0_、CH3 (CH2) 8C0_、 CH3 (CH2) 10CO-、CH3 (CH2) 12C0_、CH3 (CH2) 14C0_、CH3 (CH2) 16C0_、CH3 (CH2) 18C0_、CH3 (CH2) 20CO_ 禾口 CH3 (CH2) 22C0-。在本发明的另一个实施方案中，白蛋白结合残基为直链或支链链烷α，ω-二羧 酸的酰基。在另一个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物包含在修饰的GLP-I序列和 一个或多个白蛋白结合残基之间的亲水间隔基。亲水间隔基可以指在两个末端具有合适的官能团的未分支的寡乙二醇部分，其在 修饰的GLP-I序列的氨基和白蛋白结合残基的官能团之间形成桥。本发明的GLP-I衍生物的优选实施方案、包括它们的组合物以及使用它们的方法 列于题头为“本发明的实施方案”、“本发明的附加实施方案”和“本发明的更具体的实施方案”的章节，这些章节靠近本申请的实施例部分的开始处。功能特性如在实施例部分所述，已合成并测试了本发明的众多GLP-I衍生物。参阅实施例，本发明的GLP-I衍生物具有如在下文所释的几个有利和有益的特性。第一方面，本发明的GLP-I衍牛物具有延长的作用特件，这使该衍牛物潜在地话 于以低于每日1次的频率给予，优选具有每周1次乃至更低频率给予的潜力。作用特性可 以在药代动力学实验中用实验室动物如小鼠或猪评价。适宜的实验可见于本申请的实施例 39 (小种猪)和实施例43 (小鼠)。如在小种猪实施例39中所述，(i)GLP-l衍生物可以皮下或静脉内给予，优选皮下 给予；(ii)所述猪优选为GSttingen小种猪，优选约5月龄，重8-l0kg;(iii)所述动物优 选在给药前禁食，优选如所述实施；(iv)注射优选按照指示给予；(ν)测试的动物数优选如 所示；(Vi)剂量优选如所示；和/或(Vii)血样也优选如在该实施例中所示获取、采集并测定。如实施例39中的药代动力学实验获得所述化合物对时间的血浆浓度谱，根据它 可以确定半衰期τ72，优选如在实施例39中所述。在第一个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在18小时之上，优选在24小时之上，更优选在28小时之上，甚至更优选在30小时 之上，最优选在32小时之上。在第二个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在32小时之上，优选在34小时之上，更优选在36小时之上，甚至更优选在38小时 之上，最优选在40小时之上。在第三个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在45小时之上，优选在50小时之上，更优选在55小时之上，甚至更优选在60小时 之上，最优选在65小时之上。在第四个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在45小时之上，优选在50小时之上，更优选在55小时之上，甚至更优选在60小时 之上，最优选在65小时之上。在第五个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在70小时之上，优选在75小时之上，更优选在80小时之上，甚至更优选在85小时 之上，最优选在90小时之上。在第六个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 半衰期在92小时之上，优选在94小时之上，更优选在96小时之上，甚至更优选在98小时 之上，最优选在100小时之上。在第七个具体的实施方案中，在皮下给予小种猪之后，本发明的GLP-I衍生物的 体内半衰期为至少50小时，优选在皮下给予小种猪之后的体内半衰期为至少80小时。因此，通过皮下给予小种猪测定的本发明GLP-I衍生物的示例性半衰期间隔 (以小时 h 指示的时间)为20-100,30-100,40-100,50-100,60-100,70-100,80-100 或 90-100 (小时)。
本发明的GLP-I衍生物的半衰期也可以在db/db小鼠中以剂量_反应研究测定，例如在实施例43中所述。如在该实施例中所述，(i)小鼠优选来自Taconic ； (ii) 10-12周 龄；(iii)自由获取标准饲料如Altromin 1324和自来水；(iv)保持于24°C ； (ν)适应环境 1周；(vi)基于匹配平均血糖值分配为7组(优选η = 6) ； (vii)如在该实施例中所述接受 治疗；(viii)如所述给药；(ix)按照所述流程评价血糖，优选如所述测定；和/或(χ)基于 血糖对时间测定确定半衰期，优选如在该实施例中所述。在第一个具体的实施方案中，在皮下给予db/db小鼠之后，本发明的GLP-I衍生物 的半衰期为10小时以上，优选11小时以上，更优选12小时以上，甚至更优选13小时以上， 最优选14小时以上。在第二个具体的实施方案中，在皮下给予db/db小鼠之后，本发明的GLP-I衍生物 的半衰期为15小时以上，优选16小时以上，更优选17小时以上，甚至更优选18小时以上， 最优选19小时以上。在第三个具体的实施方案中，在皮下给予db/db小鼠之后，本发明的GLP-I衍生物 的半衰期为20小时以上，优选21小时以上，更优选22小时以上，甚至更优选23小时以上， 最优选24小时以上。在第四个具体的实施方案中，在皮下给予db/db小鼠之后，本发明的GLP-I衍生物 的半衰期为25小时以上，优选26小时以上，更优选27小时以上，甚至更优选28小时以上， 最优选29小时以上。因此，通过皮下给予db/db小鼠测定的本发明GLP-I衍生物的示例性半衰期间隔 (以小时h指示的时间)为5-30、10-30、15-30、20-30或25-30 (小时)。在第五个具体的实施方案中，本发明涉及GLP-I肽衍生物，其在啮齿动物和非啮 齿动物模型中相比于利拉鲁肽具有显著改善的终末半衰期。在啮齿动物或非啮齿动物模型 中的终末半衰期相对于利拉鲁肽优选改善至少3倍。或者，在非啮齿动物模型中终末半衰 期相对于利拉鲁肽改善至少6倍，或者在静脉内给予大鼠后，本发明的GLP-I衍生物具有至 少10小时的体内半衰期。第二方面，本发明的GLP-I衍牛物具有改善的稳定件。具体地说，其具有显著的 α -螺旋骨架的二级结构。预期具有显著的α -螺旋骨架的二级结构赋予所述分子化学、物 理和/或酶学稳定性。α -螺旋含量可以使用圆二色性(CD)光谱测定，例如在实施例44中所述。在具 体的实施方案中，(i)以5 μ M所述化合物的优选IOmMTris/C104pH 8. 0溶液记录远-UV⑶ 光谱；( )扣除缓冲背景；(iii)数据对基于肽键浓度的克分子椭圆率M-1CnT1标准化；(iv) 求出222nm的密度值(Δ ε) ； (ν)基于(iv)的密度值，假定比例，并为了转换使用-ΙΜΑπΓ1 密度值对应于10% α-螺旋结构的事实，计算α-螺旋含量。在第一个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物具有20%以上的α -螺旋含 量，优选25%以上，更优选30%以上，甚至更优选35%以上，最优选36%以上。在第二个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物具有40%以上的α -螺旋含 量，优选45%以上，更优选50%以上，甚至更优选55%以上，最优选58%以上。因此，本发明的GLP-I衍生物的α -螺旋含量的示例性范围为20-60、30-60、40_60 和 50-60 (% )。
在第三个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物对化学降解(一般用毒蜥外 泌肽-4观察，尤其是氧化和去酰胺)是稳定的。在第四个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物于中性pH、最优选于6-8的范 围是化学和物理稳定的。在第五个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物几乎没有或没有聚集的趋 势。当以硫黄素测定法测试时，所述聚集趋势优选相对于利拉鲁肽的聚集趋势显著改善。
第三方面，本发明的GLP-I衍生物具有可接受的、优选高的K对于受体)。促 胰岛素药物如本发明的GLP-I衍生物的效力可如在实施例40中所述通过剂量-反应曲线 计算EC5tl值确定。本文使用的术语“促胰岛素药物”是指为人GLP-I受体激动剂的衍生物，即在含有 人GLP-I受体的适宜培养基(下文公开了一种这样的培养基)中刺激cAMP形成的衍生物。在具体的实施方案中，(i)使用表达克隆的人GLP-I受体的幼仓鼠肾(BHK)细 胞，优选 BHK-467-12A，更优选 BHK-467-12A(tk_tsl3) ；(ii)所述细胞在加入 100IU/ mL青霉素、100 μ g/mL链霉素(1% Pen/Str印)、5%胎牛血清(FCS)和0. 5mg/mL遗传霉 素G-418 (LifeTechnologies)的DMEM培养基中优选于5 % CO2中生长；(iii)用磷酸缓 冲盐水(PBS)洗涤优选约80%汇合的所述细胞2次；(iv)用乙二胺四乙酸四钠盐水溶 液如Versene收获细胞；(ν)通过勻化由细胞制备质膜，优选在缓冲液1中；(vi)例如以 48，OOOxg于4°C离心勻化物15分钟；和/或(vii)通过勻化将沉淀悬浮在缓冲液2中；优 选重复步骤(vi)和(viii)，例如1次或2次以上。可如实施例40所述，通过检测作为对促胰岛素药物刺激的响应的环AMP(cAMP)， 进行功能性受体测定。形成的cAMP优选通过AScreen cAMP试剂盒(Perkin Elmer Life Sciences)定量。温育可在半面积96孔微量滴定板中以50 μ L总体积的缓冲液3 (50mM Tris-HCI,5mM HEPES, IOmM MgCl2, pH 7.4)进行，所述缓冲液 3 具有以下添加物lmM ATP、 ΙμΜ GTP、0. 5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0. 01 % 吐温 _20、0. 1 % BSA、6 μ g 膜制 备物、15 μ g/mL受体珠、与6nM生物素化-cAMP预温育的20 μ g/mL供体珠。优选用缓冲液 3溶解并稀释要测试激动剂活性的衍生物。用于每个实验的GTP新鲜制备。所述板在黑暗 中于缓慢搅拌下于室温温育3小时，之后以Fusion 设备(Perkin Elmer Life Sciences) 计数。作图各个衍生物的浓度_响应曲线，并使用优选4. 0版或5. 0版的4参数logistic 模型(GraphPad，Carlsbad, CA)评估 EC5tl 值。在第一个具体的实施方案中，据使用cAMP测定检测，本发明的GLP-I衍生物具有 4. 00以下的效力(EC5tl，nM)，优选3. 50以下，更优选3. 00以下，甚至更优选2. 50以下，最优 选2. 00(ηΜ)以下。在第二个具体的实施方案中，据使用cAMP测定检测，本发明的GLP-I衍生物具有 1.80以下的效力(EC5tl，nM)，优选1.60以下，更优选1.40以下，甚至更优选1.20以下，最优 选1. 00 (nM)以下。在第三个具体的实施方案中，据使用cAMP测定检测，本发明的GLP-I衍生物具有 0. 80以下的效力(EC5tl，nM)，优选0.60以下，更优选0.40以下，甚至更优选0. 20以下，最优 选0. 10 (nM)以下。在第四个具体的实施方案中，据使用cAMP测定检测，本发明的GLP-I衍生物具有0.090以下的效力(EC5tl，nM)，优选0.080以下，更优选0.070以下，甚至更优选0. 060以下， 最优选0.050 (nM)以下。在第五个具体的实施方案中，据使用cAMP测定检测，本发明的GLP-I衍生物具有 0.040以下的效力(EC5tl，nM)，优选0.030以下，更优选0.020以下，最优选0.010 (nM)以下。
因此，本发明的GLP-I衍生物的效力(EC5Q，nM,使用cAMP测定检测)的 示例性范围为 0. 010-2. 00、0· 010-1. 80、0· 010-1. 60、0· 010-1. 40、0· 010-1. 20、 0. 010-1. 00,0. 010-0. 80,0. 010-0. 60,0. 010-0. 40,0. 010-0. 30,0. 010-0. 20,0. 010-0. 10 和 0. 010-0. 90 (nM)，优选 0. 010-0. 40,0. 010-0. 30,0. 010-0. 20,0. 010-0. 10 和 0. 010-0. 90 (nM)。在第六个具体的实施方案中，对于白蛋白结合亲和力低于IOOnM的非常强的白 蛋白结合类似物，在cAMP测定中的GLP-I效力优于3μπι01，优选效力优于Ιμπιο 。对于 白蛋白结合亲和力低于500ηΜ的强白蛋白结合衍生物，在cAMP测定中的GLP-I效力优于 1 μ mol,优选效力优于0. 2μπιο1。在第七个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物可以同时结合白蛋白和 GLP-I受体。例如，本发明的GLP-I衍生物可以在存在2%白蛋白的情况下以低于IOOnM的 亲和力、优选低于30ηΜ的亲和力结合GLP-I受体。本发明的GLP-I衍生物还可以对GLP-I受体具有亲和力，在比较存在非常低浓度 (例如0. 005 % -0. 2 % )的人白蛋白时的亲和力与存在2 %人白蛋白时的亲和力时，该亲和 力仅部分降低。在这些条件下的结合亲和力的改变优选低于50倍，更优选低于30倍，最优 选低于10倍。第四方面,本发明的GLP-I衍牛物具有高白蛋白结合亲和力。所述白蛋白是指人 血清白蛋白(HSA)，所述亲和力可以如实施例41所述测定。GLP-I衍生物对人血清白蛋白(HSA)的亲和力可通过竞争邻近闪烁测定(SPA)检 测，优选如下检测(i)将链霉抗生物素蛋白-SPA珠(例如GE Healthcare RPNQ0009)与 生物素化HSA温育例如5小时；(ii)用缓冲液洗涤所述珠；(iii)将所述珠与125I-标记 的酰化 GLP-I 类似物优选在含 IOOmM !fepes、100mM NaClUOmM MgS04、0. 025 % 吐温-20， PH 7.4的缓冲液中混合，所述GLP-I类似物例如N- ε 26_[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[ (S) _4_羧 基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙 氧基)乙酰基][Aib8，125I-Tyrl9，Arg34]GLP-I (7-37)或 N- ε 37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1Η-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基)_4_羧 基丁酰基氨基)-4_羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，125I-Tyrl9， Glu22,Arg26,34,Lys37]GLP-l (7-37)-NH2 ;(iv)使用适宜的体积如 100 μ 1 的待检测 GLP-1 衍生物优选在相同缓冲液中的适宜连续稀释液，将混合物转移至闪烁计数器如Perkin Elmer0ptiplate-966005290(100y 1/孔)的孔中；(ν)在适宜的温育时间如20小时后离心 所述板，优选采用温和摇动，更优选于室温；(vi)计数所述板，例如在TopCoimter上；和/ 或(vii)以GLP-I衍生物浓度的函数作图结合的cpm。竞争曲线的EC5tl值优选用作衍生物 对HSA亲和力的量度。HSA结合亲和力也可以表示为Kd表观(解离平衡常数，Kd)。在第一个具体的实施方案中，白蛋白结合亲和力(即竞争曲线的EC5tl值(nM)，使 用实施例41的测定检测)低于2000nM，优选低于1500nM，更优选低于ΙΟΟΟηΜ，甚至更优选低于800nM，最优选低于600nM。
在第二个具体的实施方案中，白蛋白结合亲和力(即竞争曲线的EC5tl值(nM)，使 用实施例41的测定检测)低于500nM，优选低于400nM，更优选低于300nM，甚至更优选低于 200nM，最优选低于ΙΟΟηΜ。在第三个具体的实施方案中，本发明的GLP-I衍生物的白蛋白结合亲和力低于 Ιμπιο ，优选低于500ηΜ，甚至更优选低于200ηΜ乃至ΙΟΟηΜ。因此，本发明的GLP-I衍生物的白蛋白结合亲和力(EC5tl，nM)的示例性范围为 1-2000,100-2000,200-2000,400-1500,600-1500 和 800-1500 (nM)。第五方面，本发明的GLP-I衍牛物对孤立的N-末端的GLP-I警体胞外结构域 (nGLP-lR)具有高结合亲和力。所述亲和力可以以替代125I-毒蜥外泌肽-4(9-39)结合 nGLP-lR的能力来量度，例如在实施例42中所述。蛋白nGLP-lR 可以如 Runge 等人 2007 (载于 Biochemistry，46 卷，5830-5840 页)所述制备。所述蛋白然后被生物素化，并优选固定在包被链霉抗生物素蛋白的 SPA珠上。可以使用75yg BNHS(SigmaH1759)将在适宜的缓冲液如0. IM NaHCO3中的 nGLPIR生物素化至Img蛋白。随后优选对PBS透析生物素化nGLPIR。所有的试剂和 衍生物优选以PBS稀释，优选用0.05% (体积/体积)的吐温20。结合测定例如可以 在96孔OptiPlates (PerkinElmer 6005290)中以200 μ 1终体积进行。每个孔可以含 有包被2mg链霉抗生物素蛋白的SPA珠(例如PerkinElmer RPNQ007)、0. Ipmol生物素 化nGLPlR、50pCi125I-毒蜥外泌肽(9_39)和适宜的终浓度的测试肽，所述终浓度例如在 IOOOnM-O. 064nM的范围内。所述板在摇床上优选于RT (室温)或20°C温育适宜的时间，例 如3小时。SPA粒子可以通过离心沉降，例如以1500rpm离心10分钟，并计数所述板，例如 用 TopCount-NXT(PerkinElmer)。亲和力可以利用IC5tl值表示，所述IC5tl值以替代50 %的125I-毒蜥外泌肽_4 (9-39) 结合nGLP-lR的GLP-I衍生物浓度由曲线读取。在第一个具体的实施方案中，依据实施例42的测定中的IC5tlAiM量度，本发明 的GLP-I衍生物对GLP-I受体(nGLP-lR)的胞外结构域具有1500nM以下的亲和力，优选 IOOOnM以下，甚至更优选500nM以下，最优选400nM以下。在第二个具体的实施方案中，依据实施例42的测定中的IC5tlAiM量度，本发明的 GLP-I衍生物对GLP-I受体(nGLP-lR)的胞外结构域具有300nM以下的亲和力，优选200nM 以下，甚至更优选150nM以下，最优选IOOnM以下。在第三个具体的实施方案中，依据实施例42的测定中的IC5tlAiM量度，本发明的 GLP-I衍生物对GLP-I受体(nGLP-lR)的胞外结构域具有80nM以下的亲和力，优选60nM以 下，甚至更优选40nM以下，最优选20nM以下。在第四个具体的实施方案中，依据实施例42的测定中的IC5tlAiM量度，本发明的 GLP-I衍生物对GLP-I受体(nGLP-lR)的胞外结构域具有15nM以下的亲和力，优选IOnM以 下，甚至更优选8nM以下，最优选6nM以下。在第五个具体的实施方案中，依据实施例42的测定中的IC5tlAiM量度，本发明的 GLP-I衍生物对GLP-I受体(nGLP-lR)的胞外结构域具有5. OnM以下的亲和力，优选4. OnM 以下，甚至更优选3. OnM以下，最优选2. OnM以下。
因此，本发明的GLP-1衍生物对nGLP-lR的亲和力(IC5Q，nM)的示例性范围为 2-1500,2-1000,2-500,2-300,5-500,10-500 和 2-10(nM)。在该测定中，毒蜥外泌肽-4以5nM的IC5(1值结合nGLP-lR，GLP-1 (7_37)以1120nM 的IC5Q值结合nGLP-lR，利拉鲁肽以1500nM的IC5(1值结合nGLP-lR。在第六个具体的实施方案中，本发明的GLP-1衍生物以低于利拉鲁肽的IC5(I值、更 优选以低于lOOnM、甚至更优选低于lOnM乃至低于5nM的IC5(1值结合nGLP-lR。第六方面，本t提及多妝俥用的术语“DPP-IV保护(的)”是指多妝R被化学修饰 以使所述衍生物抗血浆肽酶二肽基氨基肽酶_4 (DPP-IV)。已知血浆中的DPP-IV酶参与几 种肽激素(例如GLP-l、GLP-2、毒蜥外泌肽-4等)的降解。因此，已付出了相当多的努力 来开发对DPP-IV介导的水解敏感的多肽的类似物和衍生物，以便降低DPP-IV的水解速率。在一个实施方案中，本发明的衍生物为DPP-IV保护的衍生物，其比利拉鲁肽更抗 DPP-IV。肽对二肽基氨基肽酶IV降解的抗性通过以下的降解测定来检测将等份的肽 (5nmol)于37°C与在100 uL 0. 1M三乙胺-HC1缓冲液，pH7. 4中的1 y L纯化的二肽基氨 基肽酶IV (对应于5mU酶活性)温育10-180分钟。通过加入5iiL 10%三氟乙酸终止酶反 应，使用HPLC分析分离并定量肽降解产物。一种进行该分析的方法是按照Siegel等人， Regul. Pept. 1999 ；79 :93_102 和 Mentlein 等人，Eur. J. Biochem. 1993 ；214 :829_35，将混 合物施加至Vydac C18大孔径(30nm孔径，5 y m颗粒)250x4. 6mm柱，并用在0. 1 %三氟乙 酸中的乙腈线性分步梯度(0%乙腈，3分钟；0-24%乙腈，17分钟；24-48%乙腈，1分钟)以 lml/分钟的流速洗脱。肽及其降解产物可以通过其在220nm(肽键)或280nm(芳香族氨 基酸)的吸光度监测，并通过积分它们的峰面积相对于标准品的峰面积定量。于导致低于 10%的肽水解的温育时间评估二肽基氨基肽酶IV水解肽的速率。或者，通过以下的降解测定确定肽对二肽基氨基肽酶IV降解的抗性在有或没有 1.6%人血清白蛋白的情况下，将等份的肽(4nmol)于37°C与10. 9mU纯化的二肽基氨基肽 酶IV在40iiL 0. 085MTris-HCl缓冲液，pH 8. 0中温育22小时。在0、4和22小时后，取 10iU样品，通过与100 yl的三氟乙酸混合终止酶反应。使用HPLC分析分离并定量肽 降解产物。一种进行该分析的方法是将混合物施加至Agilent Zorbax 300SB-C18 (5 u m 颗粒)150x 2. 1mm柱，并用30分钟内0. 三氟乙酸至含0. 07% TFA的100%乙腈的线性 梯度以0. 5ml/分钟的流速洗脱。肽及其降解产物通过其在214nm的吸光度监测，并通过积 分它们的峰面积定量。肽对二肽基氨基肽酶IV的稳定性以完整的肽的峰面积相对于完整 的肽和在切割后缺失两个氨基末端氨基酸的降解产物的峰面积之和来测定。第七方面，本发明涉及GLP-1肽的衍牛物,其可以被配制为适于肺部给药(递送) 的颗粒。这涉及可用于肺部制剂的物理或化学方面。或者，衍生物对气管和肺中的酶降解 是稳定的。在本发明的实施方案中，实现了一种或多种以上特征的组合。白蛋白结合本文使用的术语“白蛋白结合部分”是指非共价结合人血清白蛋白的残基。连接治 疗性多肽的白蛋白结合残基通常具有低于1 P mol的白蛋白结合亲和力，优选低于500nM， 甚至更优选低于200nM乃至低于100nM。
已知一类白蛋白结合残基属于含有远端酸性基团的4-40个碳原子的线性和分支 亲脂部分。本文使用的术语“亲水接头”是指以化学部分分隔肽和白蛋白结合残基的间隔基， 所述化学部分包含至少5个非氢原子，它们中的30-50%为N或0。在下面的结构式中，连接基团的末端键被视为连接键，而不是以亚甲基基团终止， 除非另有说明。本发明的另一个目标是提供含有本发明的衍生物的药物制剂，所述衍生物以 0. lmg/ml-25mg/ml的浓度存在，其中所述制剂具有3. 0-9. 0的pH。所述制剂可进一步包含 缓冲系统、防腐剂、渗透压剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。制剂在本发明的一个实施方案中，药物制剂为水性制剂，即含有水的制剂。这样的制剂 通常为溶液或混悬液。在本发明的又一个实施方案中，药物制剂为水溶液。术语“水性制剂”被定义为含有至少50% (重量/重量)水的制剂。同样，术语 “水溶液”被定义为含有至少50% (重量/重量)水的溶液，术语“水性混悬液”被定义为 含有至少50% (重量/重量)水的混悬液。在另一个实施方案中，药物制剂为冻干制剂，医师或患者在使用前加入溶剂和/ 或稀释剂。在另一个实施方案中，药物制剂为没有任何在先的溶解的情况下备用的干燥制剂 (例如冻干的或喷雾干燥的)。又一方面，本发明涉及含有本发明的衍生物的水溶液和缓冲液的药物制剂，其中 所述衍生物以0. lmg/ml或以上的浓度存在，其中所述制剂具有约3. 0至约9. 0的pH。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约7. 0至约9. 5。在本发明的另一个 实施方案中，制剂的PH为约3. 0至约7. 0。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约 5.0至约7.5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约7.5至约9.0。在本发明的另 一个实施方案中，制剂的PH为约7. 5至约8. 5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH 为约6.0至约7. 5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约6.0至约7.0。在另一 个实施方案中，药物制剂为8. 0-8. 5。在本发明的一个实施方案中，每个给药剂量均包含0. Olmg-lOmg活性衍生物。在 一个实施方案中，给予的剂量包含0.05mg以上的活性衍生物。在一个实施方案中，给予的 剂量包含0. lmg以上的活性衍生物。在一个实施方案中，给予的剂量包含至多10mg活性衍 生物。在一个实施方案中，给予的剂量包含至多9mg活性衍生物。在一个实施方案中，给予 的剂量包含至多8mg活性衍生物。在一个实施方案中，给予的剂量包含至多7mg活性衍生 物。在一个实施方案中，给予的剂量包含至多6mg活性衍生物。在一个实施方案中，给予的 剂量包含至多5mg活性衍生物。在一个实施方案中，给予的剂量包含0. 2mg-5mg活性衍生 物。在本发明的又一个实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘 氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)_氨 基甲烷、N，N-(2-羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹甲酸、琥珀酸盐、
22马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每一个均构成本发明的 备选实施方案。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含药学上可接受的防腐剂。在本发 明的又一个实施方案中，所述防腐剂选自苯酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚、对-羟基苯 甲酸甲酯、对_羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对-羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、 氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对-羟基 苯甲酸乙酯、苯索氯铵、氯苯甘油醚(3对-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在一 个实施方案中，防腐剂为苯酚或间-甲酚。在本发明的又一个实施方案中，防腐剂以0. lmg/ ml-20mg/ml的浓度存在。在本发明的又一个实施方案中，防腐剂以0. lmg/ml-5mg/ml的浓 度存在。在本发明的又一个实施方案中，防腐剂以5mg/ml-10mg/ml的浓度存在。在本发明 的又一个实施方案中，防腐剂以10mg/ml-20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂的每一个 均构成本发明的备选实施方案。防腐剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为 方便起见参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 19 片反，1995。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含等渗剂。在本发明的又一个实施 方案中，等渗剂选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨 酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛醇(例如甘油(丙三醇)、1，2_丙二醇 (丙烯二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。在一个 实施方案中，等渗剂为丙二醇。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶液聚糖，包 括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、 糊精、环糊精、a和0HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方 案中，糖添加剂为蔗糖。糖醇被定义为具有至少一个-0H基的C4-C8烃，包括例如甘露醇、 山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂为甘露 醇。以上提及的糖或糖醇可独立使用或组合使用。使用量没有固定限制，只要糖或糖醇在 液体制剂中是可溶性的，没有不利影响使用本发明方法获得的稳定作用。在一个实施方案 中，糖或糖醇浓度在约lmg/ml至约150mg/ml之间。在本发明的又一个实施方案中，等渗剂 以lmg/ml-50mg/ml的浓度存在。在本发明的又一个实施方案中，等渗剂以lmg/ml-7mg/ml 的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，等渗剂以5mg/ml-7mg/ml的浓度存在。在本发 明的又一个实施方案中，等渗剂以8mg/ml-24mg/ml的浓度存在。在本发明的又一个实施方 案中，等渗剂以25mg/ml-50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗剂中的每一个均构成了本发 明的替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为方便起见参 考 Remington :The Science andPractice of Pharmacy，第 19 片反，1995。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含螯合剂。在本发明的又一个实施 方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。在本发明 的又一个实施方案中，螯合剂以0. lmg/ml-5mg/ml的浓度存在。在本发明的又一个实施方 案中，螯合剂以0. lmg/ml-2mg/ml的浓度存在。在本发明的又一个实施方案中，螯合剂以 2mg/ml-5mg/ml的浓度存在。这些具体螯合剂中的每一个均构成了本发明的替代实施方案。 螯合剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为方便起见参考Remington :The Science andPractice of Pharmacy,第 19 版，1995。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为方便起见参考Remington :The Science and Practice of Pharmacy, % 19 版，1995。更具体地说，本发明的组合物为稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包括在 储存过程中可能于液体药物制剂中表现出聚集体形成的多肽。所述“聚集体形成”是指多肽分子之间的物理相互作用，该作用导致形成寡聚 物，所述寡聚物可能保持可溶性，或者由溶液沉淀的大的可见聚集物。所述“在储存过程 中”是指液体药物组合物或制剂制成后不立即给予受试者。相反，制备后，其以液体形 式、冷冻状态或干燥形式(以后复溶为液体形式或适于给予受试者的其它形式)包装储 存。所述“干燥形式”是指通过下列方式干燥的液体药物组合物或制剂冷冻干燥(即冻 干；参见例如 Williams 和 Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48_59)、喷雾干燥 (# JAL Masters (1991)，i 于 Spray-DryingHandbook (第 5 片反；Longman Scientific and Technical，Essez，U. K. )，491-676 页；Broadhead 等人，(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18 1169-1206 ；和 Mumenthaler 等人，(1994) Pharm. Res. 11 12-20)或风干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology 25 :459_470 ；禾口 Roser (1991) Biopharm. 4 :47_53)。在液体药物 组合物储存过程中多肽形成聚集体可能不利地影响该多肽的生物活性，导致药物组合物失 去治疗效力。此外，聚集体形成可能引起其它问题，例如在使用输注系统给予含多肽的药物 组合物时的管路、膜或泵的阻塞。 本发明的药物组合物还可以包含一定量的氨基酸碱基，所述量足以降低组合物储 存过程中多肽的聚集体形成。所述“氨基酸碱基”是指氨基酸或氨基酸组合，其中任何给定 的氨基酸都以其游离碱基形式或其盐形式存在。在使用氨基酸组合的情况下，所有的氨基 酸都可以它们的游离碱基形式存在，全部也可以它们的盐形式存在，或者一些可以它们的 游离碱基形式存在，而另一些以它们的盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明的 组合物的氨基酸是携带带电侧链的那些氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。 特定氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、 苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合可 以存在于本发明的药物组合物中，只要特定的氨基酸以其游离碱基形式或其盐形式存在。 在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可以用这些氨基酸的类似物配 制。所述“氨基酸类似物”是指天然氨基酸的衍生物，其在本发明的液体药物组合物的储存 过程中产生降低多肽的聚集体形成的预期作用。适宜的精氨酸类似物包括例如氨基胍、鸟 氨酸和N-单乙基L-精氨酸，适宜的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，适宜的半胱 氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸的情况一样，氨基酸类似物以它们 的游离碱基形式或它们的盐形式掺入到组合物中。在本发明的又一个实施方案中，氨基酸 或氨基酸类似物以足以预防或延迟蛋白质聚集的浓度使用。 在本发明的又一个实施方案中，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸 类似物)，以在用作治疗剂的多肽为包含至少一个甲硫氨酸残基的多肽时，抑制甲硫氨酸残 基氧化为甲硫氨酸亚砜，其中所述甲硫氨酸残基对所述氧化敏感。所述“抑制”是指甲硫氨 酸氧化物质随时间推移的最小累积。抑制甲硫氨酸氧化导致为其正确分子形式的多肽的更 大保留。可以使用任何甲硫氨酸立体异构体(L或D)或其组合。要加入的量应当为足以抑 制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸亚砜的量是管理机构可接受的。通常，这意味着
24组合物包含仅约10%至约30%的甲硫氨酸亚砜。一般而言，这可以通过加入甲硫氨酸实 现，使得加入的甲硫氨酸对甲硫氨酸残基的比率在约1 1至约1000 1的范围内，例如 10 1 至约 100 1。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含稳定剂，其选自高分子量聚合物 或低分子量化合物。在本发明的又一个实施方案中，所述稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚 乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基纤维素/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质(如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇)和不同 的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂中的每一种均构成了本发明的替代实施方案。所述药物组合物还可以包含其它的稳定剂，其进一步增强其中的治疗活性多肽的 稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽抗甲硫氨 酸氧化，以及非离子表面活性剂，其保护多肽抗与冻_融或机械剪切相关的聚集。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包含表面活性剂。在本发明的另一个 实施方案中，药物组合物包含两种不同的表面活性剂。本文使用的术语“表面活性剂”是指 包含水溶性(亲水性)部分、头和脂溶性(亲脂性)部分的任何分子或离子。表面活性剂 优选在交界面累积，其中亲水性部分朝向水(亲水相)，亲脂性部分朝向油相或疏水相(即 玻璃、空气、油等)。表面活性剂开始形成胶束的浓度被称为临界胶束浓度或CMC。而且，表 面活性剂降低液体的表面张力。表面活性剂还被称为两亲化合物。术语“变性剂”是一般 用于表面活性剂的同义词。阴离子表面活性剂可以选自鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、脱氢胆酸、脱氧 胆酸、脱氧胆酸甲酯、洋地黄皂甙、毛地黄毒苷配基、N, N-二甲基十二烷胺N-氧化物、多库 酯钠、甘氨鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸水合物、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘 氨脱氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-十二烷酰肌氨酸钠盐、 N-十二烷酰肌氨酸钠盐、N-十二烷酰肌氨酸、N-十二烷酰肌氨酸、十二烷基硫酸锂、Lugol、 1-辛烷磺酸钠盐、1"辛烷磺酸钠盐、1" 丁烷磺酸钠、1"癸烷磺酸钠、1"十二烷磺酸钠、1"庚 烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸 钠水合物、牛或羊胆汁、胆酸钠水合物、络胆酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基 硫酸钠、己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、牛磺脱 氧胆酸钠盐一水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛熊脱氧胆酸钠盐、丁rizma 十二烷基硫 酸盐、DSS (多库酯钠，CAS注册号[577-11-7]，多库酯钙，CAS注册号[128-49-4]，多库酯 钾，CAS注册号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、十二烷基磷酸胆碱 (F0S-胆碱-12)、癸基磷酸胆碱(F0S-胆碱-10)、壬基磷酸胆碱(F0S-胆碱-9)、二棕榈酰 磷脂酸、辛酸钠和/或乌索脱氧胆酸。阳离子表面活性剂可以选自烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基二甲 基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基双十八烷 基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、 乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧乙烯 (10)-N-牛油-1，3-二氨基丙烷、通佐溴胺和/或三甲基(十四基)溴化铵。
非离子表面活性剂可以选自BigCHAP、双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、嵌 段共聚物如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物例如泊洛沙姆、泊洛沙姆-188和泊 洛沙姆-407、Brij 35、Brij 56、Brij 72、Brij 76、Brij 92V、Brij 97、Brij 58P、 Cremophor EL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰-N-甲基葡糖胺、n-十二酰基-N-甲基 葡糖胺、烷基-多聚葡糖苷、乙氧化蓖麻油、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基醚、七 乙二醇单十四烷基醚、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷 基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Ig印alCA-630、Igepal CA-630、甲基-6_0-(N-庚基氨基甲 酰吡喃葡糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、N-壬酰-N-甲基 葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单 十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-D-吡喃葡糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二 醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五 乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧 乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、 聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二 醇硬脂酸酯、来自 Quillaja树皮的皂苷、Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、Span 85、Tergitol (15-S-12 型)、Tergitol (15-S-30 型)、Tergitol (15-S-5 型)、 Tergitol(15-S-7 型)、Tergitol(15-S-9 型)、Tergitol(NP-10 型)、Tergitol(NP-4 型)、 Tergitol (NP-40 型)、Tergitol (NP-7 型)、Tergitol (NP-9 型)、十四基-0 _D_ 麦芽苷、四乙 二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙 二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、 Triton CF-21、Triton CF-32、TritonDF_12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、 Triton QS-44,Triton X-100,Triton X-102,Triton X-15,Triton X_151、Triton X-200、 Triton x-207,Triton x-100,Triton x-l 14,Triton x-165 溶液、Triton x-305 溶液、 Triton x-405,Triton x-45,Triton X-705-70.TWEEN 20.XWEEN 40.TWEEN 60、TWEEN 6、TWEEN 65、TWEEN 80、TWEEN 81、TWEEN §5、四 丁酚醛、鞘 磷脂(神经鞘磷脂)和鞘糖脂类(神经酰胺、神经节苷脂)、磷脂和/或正十一烷基0 -D-批 喃葡糖苷。两性离子表面活性剂可以选自CHAPS、CHAPS0、3_(癸基二甲铵)丙磺酸内盐、 3_(十二烷基二甲铵)丙磺酸内盐、3-(十二烷基二甲铵)丙磺酸内盐、3-(N，N-二甲基 十四烷基铵)丙磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷铵)丙磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛铵)丙 磺酸内盐、3_(N，N-二甲基十六烷铵)丙磺酸盐、N-烷基-N，N-二甲铵-1-丙磺酸盐、 3-胆酰胺-1-丙基二甲铵-1-丙磺酸盐、十二烷基磷酸胆碱、肉豆蔻酰溶血磷脂酰胆碱、 Zwittergent 3-12 (N-十 二烷基 _N，N- 二甲基-3-铵基 丙磺酸盐)、Zwittergent 3-10 (3-(癸基-二甲铵)丙磺酸内盐)、Zwittergent 3-08 (3-(辛基二甲铵)丙磺酸盐)、 甘油磷脂类(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸)、甘油糖脂类(吡喃半乳糖苷)、溶血磷脂酰 胆碱和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰胆 碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，以及极性头基的修饰，所述头基为胆 碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸、
26酰基肉毒碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Ne_酰化衍生物，或者赖氨酸或精氨酸 的侧链酰化衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽 的Ne_酰化衍生物，包含中性氨基酸和两个带电荷氨基酸的任意组合的三肽的Ne_酰化衍 生物，或者表面活性剂可选自咪唑啉衍生物、长链脂肪酸及其盐C6_C12 (例如油酸和辛酸)、 N-十六烷基-N，N_ 二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、阴离子型(烷基_芳基-磺酸酯)单价 表面活性剂、棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸 的1-酰基_sn-甘油-3-磷酸酯)或其混合物。本文使用的术语“烷基_多聚葡糖苷”涉及经一个或多个糖苷部分(例如麦芽苷、 糖等)取代的直链或支链c5_2(l-烷基、-链烯基或_炔基链。这些烷基_多聚葡糖苷的实施 方案包括c6_18-烷基-多聚葡糖苷。这些烷基_多聚葡糖苷的具体实施方案包括偶数碳链， 例如c6、c8、c1(1、c12、c14、c16、c18和c2(1烷基链。糖苷部分的具体实施方案包括吡喃糖苷、吡喃 葡糖苷、麦芽苷、麦芽三糖苷和蔗糖。在本发明的多个实施方案中，少于6个的糖苷部分连 接至烷基基团。在本发明的多个实施方案中，少于5个的糖苷部分连接至烷基基团。在本发 明的多个实施方案中，少于4个的糖苷部分连接至烷基基团。在本发明的多个实施方案中， 少于3个的糖苷部分连接至烷基基团。在本发明的多个实施方案中，少于2个的糖苷部分连 接至烷基基团。烷基_多聚葡糖苷的具体实施方案是烷基葡糖苷，如正癸基0 -D-吡喃葡糖 苷、癸基3-D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基3-D吡喃葡糖苷、正十二烷基3-D-麦芽糖苷、正 十二烷基3-D-麦芽糖苷、正十二烷基3-D-麦芽糖苷、十四烷基3-D-吡喃葡萄糖苷、癸 基日-D-麦芽糖苷、十六烷基3-D-麦芽糖苷、癸基3-D-麦芽三糖苷、十二烷基3-D-麦 芽三糖苷、十四烷基3-D-麦芽三糖苷、十六烷基3-D-麦芽三糖苷、正十二烷基-蔗糖、正 癸基_蔗糖、蔗糖单葵酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单十四烷酸酯以及蔗糖单棕榈酸酯。表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员众所周知的。为方便起见，参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。在本发明的又一个实施方案中，所述制剂还包括蛋白酶抑制剂，例如EDTA(乙二 胺四乙酸)和苄脒HC1，但也可以使用其它可商购获得的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的使 用对含有蛋白酶酶原的药物组合物特别有用，以便抑制自动催化。在本发明的肽药物制剂中有可能存在其它成分。这些附加成分可以包括湿润剂、 乳化剂、抗氧化剂、填充剂、渗透压调节剂、螯合剂、金属离子、油质溶媒、蛋白质(例如人血 清白蛋白、明胶或蛋白质)以及两性离子(例如，氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨 酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些附加成分不应该不利地影响本发明药物制剂的整体稳定 性。含有本发明衍生物的药物组合物可以在若干位点给予需要这种治疗的患者，例如 在局部位点(例如皮肤和粘膜位点)、在不经过吸收的位点(例如在动脉、静脉、心脏给药) 以及在涉及吸收的位点(例如在皮肤、皮下、肌肉或腹部给药)。可以通过几种给药途径，例如舌、舌下、口颊、口中、经口、在胃和肠内、鼻、肺(例 如通过细支气管和肺泡或其组合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿 管和肠胃外，将本发明的药物组合物给予需要这种治疗的患者。本发明的组合物可以以几种剂型给予，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复 合型乳剂、泡沫剂、油膏剂、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、香口胶、冲洗剂、胶囊剂(例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)、栓剂、直肠用胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、 气雾齐IJ、吸入齐IJ、滴眼齐IJ、眼膏齐IJ、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏齐IJ、注射溶液、原 位转化溶液(例如原位凝胶化、原位固定、原位沉淀、原位结晶)、输注溶液和植入剂。本发明的组合物还可以例如通过共价、疏水性和静电相互作用混合进或连接至药 物载体、药物递送系统和高级药物递送系统，以便进一步增强本发明衍生物的稳定性、提高 生物利用率、增强溶解性、降低不利效应、达到本领域那些技术人员众所周知的时间治疗， 以及增强患者的顺应性或其任意组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包 括但不限于聚合物(例如纤维素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生 物)、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和丙烯酸甲酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚 乙二醇、载体蛋白(例如白蛋白)、凝胶(例如热凝胶系统，例如本领域技术人员众所周知 的嵌段共聚体系统)、胶束、脂质体、微球体、纳米微粒、液晶及其分散相、L2相及其分散相， 脂-水系统的相行为领域的技术人员熟知的高分子胶束、复合型乳剂、自乳化、自微乳化、 环糊精及其衍生物，以及树状分子。本发明的组合物可为用于肺部给予本发明衍生物的固体、半固体、粉末和溶液制 剂，使用例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，所有这些装置都是本领域技术人员众所周 知的。本发明的组合物尤其可用于控释、持续释放、延长释放、阻释和缓释药物递送系统 的制剂。更具体地说，但不作为限制，组合物可用于本领域技术人员众所周知的肠胃外控释 系统和持续释放系统的制剂(这两个系统都导致给药次数减少许多倍)。甚至更优选地，组 合物可为皮下给予的控释系统和持续释放系统。无意于限制本发明的范围，有用的控释系 统和组合物的实例是水凝胶、油性凝胶、液晶、高分子胶束、微球、纳米微粒。生产可用于本发明组合物的控释系统的方法包括但不限于结晶、缩合、共结 晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压勻化、囊化、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶 剂蒸发产生微球、挤出和超临界流体处理。一般参考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L.编辑，Marcel Dekker, New York,2000)禾口 Drug and thePharmaceutical Sciences 99 卷Protein Formulation and Delivery(MacNally, E. J.编辑，Marcel Dekker, New York，2000)。肠胃外给药可以用注射器(任选笔式注射器)通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注 射进行。备选地，肠胃外给药可以通过输注泵实施。进一步的选择是可以为溶液或混悬剂 或粉剂的组合物，用于以鼻或肺液体或粉末喷雾形式给予本发明的衍生物。作为更进一步 的选择，含有本发明衍生物的药物组合物也能够适合例如通过无针注射或通过药贴(任选 电离子导入药贴)透皮给予，或者经粘膜(例如口颊)给予。本发明的衍生物可以使用适合肺部药物递送的任何已知类型的装置，在溶媒中 作为溶液、混悬剂或干粉剂通过肺部途径给予。这些装置的实例包括但不限于用于肺 部药物递送的三种通用型气溶胶发生器，并且可以包括喷射雾化器或超声雾化器、定量 吸入器或干粉吸入器(参见 Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery physiologic andmechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997)395-453)。基于标准化的测试方法学，将粒子的气体动力学直径(da)定义为单位密度(lg/ cm3)的参考标准球形粒子的几何等效直径。在最简单的情形中，对于球形微粒，九作为密度比率的平方根函数与基准直径(d)相关，如下所述对非球形颗粒，该气体动力学直径关系需要修改(参见EdwardsDA，Ben-Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drugdelivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385)。术语 “MMAD” 禾口 “MMEAD” 是本领域 已充分描述并已知的(参见Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R，其提供了一种空气动 力学粒子直径分布的中值测量° Recent advances in pulmonary drugdelivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379—385)。质量中值 空气动力学直径(MMAD)和质量中值有效空气动力学直径(MMEAD)可以互换使用，是统计 参数，并且经验性地描述气溶胶粒子大小(该大小与它们在肺中的沉积潜力相关)，与实 际形状、大小或密度无关(参见 Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaledparticles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385)。MMAD通常由以碰撞器(一种测量空气中的粒子惯性行为的装置) 实施的测量计算。在进一步的实施方案中，所述制剂可以通过任何已知的气雾化技术(例如喷雾技 术)而气雾化，以达到气溶胶粒子的MMAD，其小于10 u m,更优选1-5 u m,最优选1-3 u m。优 选的粒子大小基于递送药物进肺深部(在那里蛋白质得以最佳吸收)的最有效大小(参见 EdwardsDA,Ben-Jebria A,Langer A,Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379—385)。含有本发明衍生物的肺用制剂在肺深部的沉积可任选地通过使用吸入技术的改 变形式进一步优化，所述吸入技术的改变形式例如但不限于缓慢吸入气流(例如30L/分 钟)、屏气和定时释放。术语“稳定制剂”是指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和 化学稳定性的制剂。本文使用的术语蛋白制剂的“物理稳定性”是指蛋白由于接触热_机械应力和/ 或与失稳的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成生物学上失活的和/或不可 溶的蛋白聚集物的倾向性。含水蛋白制剂的物理稳定性可通过在不同温度下将置于合适容 器(如药筒或小瓶)中的制剂接触机械/物理应力(如搅动)不同时间后通过视觉检查和 /或浊度测量来评估。制剂的视觉检查在具有黑色背景的精确聚焦光下进行。制剂的浊度 通过视觉打分评定混浊程度等级来表征，例如以0-3的等级来表征(未显示浊度的制剂对 应视觉打分0，而在日光下显示肉眼浊度的制剂对应视觉打分3)。当制剂在日光下显示肉 眼浊度时，将蛋白制剂分类为就蛋白聚集而言是物理不稳定的。备选地，制剂浊度可通过技 术人员众所周知的简单浊度测量法评估。含水蛋白制剂的物理稳定性还可以通过使用光谱 剂或蛋白质构象状态探针来评估。该探针优选为优先结合蛋白质的非天然构象异构体的小 分子。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫磺素T。硫磺素T是一种已广泛用于 检测淀粉样蛋白原纤维的荧光染料。在存在原纤维以及或许还存在其它蛋白质构象的情况 下，硫磺素T在结合原纤维蛋白质形式时在约450nm处产生新的激发极大值，并在约482nm 处发射增强。未结合的硫磺素T在这些波长下基本上是无荧光的。其它小分子可以用作蛋白质结构改变(从天然到非天然状态)的探针。例如，“疏 水补丁”(hydrophobic patch)探针优先结合蛋白质的暴露的疏水补丁。疏水补丁通常包埋
29于天然态蛋白的三级结构中，但当蛋白开始去折叠或变性时其变为暴露的。这些小分子光 谱探针的实例是芳香族疏水染料，例如蒽、吖啶、邻二氮杂菲等。其它光谱探针是金属-氨 基酸络合物，例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等的钴金 属络合物。本文使用的术语蛋白制剂的“化学稳定性”是指蛋白结构中的化学共价变化，其 导致形成与天然蛋白结构相比具有潜在较小的生物学效力和/或潜在增加的免疫原特性 的化学降解产物。可以形成多种化学降解产物，这取决于天然蛋白质的类型和性质以及该 蛋白质所暴露的环境。化学降解的消除几乎不可能完全避免，且在蛋白制剂的存储和使用 过程中经常可见化学降解产物的量增加，这是本领域技术人员众所周知的。大部分蛋白质 倾向于脱酰胺，脱酰胺是谷氨酰胺或天冬酰胺残基中的侧链酰胺基水解形成游离羧酸的过 程。其它降解途径包括形成高分子量的转化产物，其中两个或更多个蛋白分子通过转酰胺 作用和/或二硫化物相互作用彼此共价结合，导致形成共价结合的二聚体、寡聚体和多聚 j^Mr^ (Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern. T. J. Manning M. C. ,Plenum Press, New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)可被认为是化学降解的另一种 变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过在其接触不同的环境条件(降解产物的形成经常可通 过例如增加温度来加速)后在多个时间点测量化学降解产物的量来评估。每种单独的降解 产物的量经常可根据分子大小和/或电荷使用多种不同的色谱技术(例如SEC-HPLC和/ 或RP-HPLC)通过分离降解产物来测定。因此，如上概述，“稳定的制剂”是指具有增强的物理学稳定性、增强的化学稳定性 或增强的物理和化学稳定性的制剂。一般而言，制剂在使用和存储过程中(依照建议的使 用和存储条件)必须是稳定的，直到达到有效期。在本发明的一个实施方案中，含有本发明衍生物的药物制剂在6周以上的使用和 3年以上的存储中是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，含有本发明衍生物的药物制剂在4周以上的使用 和3年以上的存储中是稳定的。在本发明的又一个实施方案中，含有本发明衍生物的药物制剂在4周以上的使用 和2年以上的存储中是稳定的。在本发明的再一个实施方案中，含有本发明衍生物的药物制剂在2周以上的使用 和2年以上的存储中是稳定的。另一方面，本发明涉及本发明的衍生物制备药物的用途。在一个实施方案中，本发明的衍生物用于制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、 葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌 梗塞、中风、冠心病和其它心血管疾病、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的药物。在另一个实施方案中，本发明的衍生物用于制备延缓或预防2型糖尿病的疾病发 展的药物。在另一个实施方案中，本发明的衍生物用于制备减少食物摄取、减少细胞凋 亡、增强0"细胞功能和0"细胞量和/或恢复0"细胞的葡萄糖敏感性的药物。用本发明的衍生物的治疗还可以与第二种或更多种药理活性物质组合，所述药理 活性物质例如选自抗糖尿病药、减肥药、食欲调节剂、抗高血压药、用于治疗和/或预防由
30糖尿病引发或与其相关的并发症的药物以及用于治疗和/或预防由肥胖症引发或与其相 关的并发症和障碍的药物。这些药理活性物质的实例是胰岛素、磺脲类、双胍、美格列奈 类、葡糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、涉及刺激糖异 生和/或糖原分解的肝酶抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、调节脂类代谢的化合物如抗高血脂 药剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、 RXR激动剂和作用于细胞的ATP依赖性钾通道的制剂；考来烯胺、考来替泊、安妥明、 吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、那格列奈、瑞格列奈； 阻滞剂，例如烯丙心安、氨酰心安、噻吗心安、吲哚洛尔、普萘洛尔和美托洛尔；ACE(血 管紧张素转化酶)抑制剂，例如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、法西 多曲(alatriopril)、喹那普利和雷米普利；钙通道阻滞剂，例如硝苯吡啶、非洛地平、尼卡 地平、依拉地平、尼莫地平、地尔硫卓和维拉帕米；以及a “阻滞剂，例如多沙唑嗪、乌拉地 尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明调节的转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮 抗剂、PYY激动剂、Y2受体激动剂、Y4受体激动剂、混合的Y2/Y4受体激动剂、MC4(黑皮 质素4)激动剂、阿立新拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促皮质素释放因子) 激动剂、CRF BP(促皮质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素激动剂、03激动剂、胃 泌酸调节素和类似物、MSH(黑素细胞-刺激激素)激动剂、MCH(黑素细胞-浓缩激素， melanocyte-concentrating hormone)拮抗剂、CCK (胆囊收缩素)激动剂、血清素重吸收抑 制剂、血清素和去甲肾上腺素重吸收抑制剂、混合的血清素和去甲肾上腺素化合物、5HT (血 清素)激动剂、蛙皮素激动剂、神经节肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲 状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3 (解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动 剂(溴隐停、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(视黄醇类X受体)调节剂、TR0激动 剂；组胺H3拮抗剂、胃抑制性多肽激动剂或拮抗剂(GIP类似物)、胃泌素和胃泌素类似物。用本发明的衍生物治疗还可以与外科手术(即影响葡萄糖水平和/或脂质内稳态 的外科手术)例如胃束带术或胃旁路术联合。应该理解的是，本发明的衍生物与一种或多种上文提及的化合物以及任选的一种 或多种其它药理活性物质的任意适宜组合被认为属于本发明的范围。制备方法根据序列，可以通过以下方法生产本发明的类似物所述方法包括培养宿主细胞， 所述宿主细胞包含编码多肽的DNA序列，并能够在允许表达所述肽的条件下在适宜的营养 培养基中表达所述多肽，之后由培养物回收所获得的肽。用于培养细胞的培养基可以是任何适于培育宿主细胞的常规培养基，例如包含适 当添加物的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可从商业供应商处获得，或者可根据 公开的处方(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。细胞产生的肽然后可通过 常规方法从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，利用盐如硫酸 铵沉淀上清液或滤过液的蛋白质组分，通过多种色谱方法纯化，如离子交换色谱、凝胶过滤 色谱、亲和色谱等，这取决于所述肽的类型。编码治疗性多肽的DNA序列可适当地为基因组或cDNA来源，例如根据标准技术 (参见例如 Sambrook, J, Fritsch, EF 禾口 Maniatis, T, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York，1989)，通过制备基因组或cDNA文库并用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码全长或部分多肽的DNA序列而获 得。编码多肽的DNA序列也可通过已建立的标准方法合成制备，所述标准方法例如由 Beaucage 禾口 Caruthers，Tetrahedron Letters 22 (1981)，1859-1869 描述的亚磷酰胺 (phosphoamidite)方法或由 Matthes 等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805 描述的方法。 所述DNA序列也可使用特异性引物通过聚合酶链式反应制备，例如按在US 4，683，202或 Saiki 等人，Science 239 (1988)，487-491 中所述。所述DNA序列可插入至任何可方便地接受重组DNA操作的载体中，载体的选择经 常取决于其将被引入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实 体存在的载体，所述载体的复制不依赖于染色体复制，例如质粒。备选地，所述载体可以是 当将其引入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组中并与其已经整合入的染色体一起复制的 载体。所述载体优选为表达载体，其中编码所述肽的DNA序列有效连接至DNA转录所需 的其它片段如启动子上。启动子可以是在选定宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 并可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。适于在多种宿主细胞中引导编码本 发明肽的DNA转录的启动子的实例在本领域是众所周知的，参见例如Sambrook等人，如前 所述。如果需要，也可将编码所述肽的DNA序列有效连接至合适的终止子、多腺苷酸化 信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体还可以包含能使该载体在所 述宿主细胞中复制的DNA序列。所述载体还可包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因或赋予对下列 药物抗性的基因如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。为了引导本发明的亲本肽进入宿主细胞的分泌路径，可在重组载体中提供分泌信 号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。在正确的读框内将分泌信号序列连接至 编码肽的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5'端。分泌信号序列 可以是通常与该肽相关的分泌信号序列，或者可以来自编码另一种分泌蛋白的基因。用于 分别连接编码本发明肽的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列并将它们 插入至含有复制所需信息的合适载体中的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如 Sambrook等人，如前所述)。引入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能产生本发明肽的任何细胞，包括细 菌、酵母、真菌和高等真核细胞。本领域熟知并使用的合适宿主细胞的实例是但不限于大肠 杆菌(E. coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳动物BHK或CH0细胞系。本发明的实施方案1. 一种包含修饰的GLP-1序列7_37(SEQ ID No 1)的GLP-1衍生物，所述修饰的 GLP-1序列7-37具有i)与SEQ ID No 1的序列7-37相比总共2、3、4、5或6个氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg残基；ii)任选1个氨基酸残基的C末端延长，iii)任选在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基酸可以不存在，和
iv)任选C末端酰胺基团，而且其在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。2.实施方案1的GLP-1衍生物，其包含修饰的GLP-1序列7-37 (SEQ ID No 1)，所 述修饰的GLP-1序列7-37具有i)与SEQ ID No 1的序列7-37相比总共2、3、4、5或6个氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg残基；而且其在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。3.实施方案1的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQ ID No 1的37位的位置没有氨 基酸，所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、23、31、34 或 36 位的位置，且其中GLP-1类似物的总长度为30个氨基酸。4.实施方案1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有长1个氨基酸残基的C末 端延伸，其中所述GLP-1类似物的总长度为32个氨基酸。5.实施方案1-4中任一项的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有C_末端酰胺基团。6.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(I)的序 列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-G lu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe_I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-X
一 一 一 R式(I)(SEQ ID No 2)，优选具有除了在20位具有Leu之外与式⑴相同的式(I’ )的序列，其中，Xaa7-Xaa8为L_组氨酸_Aib、去氨基-组氨酸-丙氨酸或去氨基-组氨酸_Aib ；Xaa9为Glu或Glu衍生物，例如a，a 二甲基-GluXaa16 为 Val 或 Leu ；Xaa18 为 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 为 Leu 或 LysXaa23 为 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 为 Ala 或 AsnXaa25 为 Ala 或 Val ;Xaa27 为 Glu、Ala 或 Leu ;Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg，优选为 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa31 为 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 为 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Cys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 为 Gly 或 Aib ;Xaa36 为 Arg 或 Lys，Xaa37 为 Gly、Aib、Cys、Lys 或不存在，Xaa38 为 Lys、Glu 或不存在；R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37不存在，则Xaa38也不存在，所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、 34、36 或 37 位。7.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(II)的序 列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln -Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa3o_Trp-Leu-Xaa33_Xaa34_Xaa35_Xaa36-Xaa37-Xaa38-R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7为L_组氨酸、D_组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、0 -羟基-组氨 酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、a-氟甲基-组氨酸、a-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Xaa8 为 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)甲酸、(1_ 氨基环丁 基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨 基环辛基)甲酸；Xaa18 为 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 为 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 为 Val 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 为 Gly 或 Aib ；Xaa36 为 Arg 或 Lys,Xaa37 为 Gly、Aib、Lys 或不存在，
Xaa38 为 Lys、Glu 或不存在，R为酰胺或不存在，所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、 34、36 或 37 位。8.实施方案1-7中任一项的GLP-1衍生物，其中至少一个氨基酸残基被 A-B-C-D-衍生化，其中A-选自
34 其中n 选自 14、15、16、17、18 和 19，p 选自 10、11、12、13 和 14，d 选自 0、1、2、3、4 和5，-B-选自
和其中x 选自 0、1、2、3 和 4，y 选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12，-C-选自 其中b和e各自独立地选自0、1和2，c和f各自独立地选自0、1和2，条件是当c 为0时b为1或2，或者当c为1或2时b为0，且当f 为0时e为1或2，或者f 为1或2 时e为0，和-D-连接至所述氨基酸残基，并为接头。9.实施方案52-55中任一项的GLP-1衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基为赖氨酸。10. 一种药物组合物，其包含实施方案1-9中任一项的衍生物和药学上可接受的 赋形剂。11.实施方案1-9中任一项的衍生物，所述衍生物用于治疗或预防高血糖症、2型 糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬 化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。
人GLP-1(7_37)的氨基酸序列作为SEQ ID No 1包括在序列表中，SEQ ID No :2和 3为依据本发明的衍生物。在序列表中，编号以第1号氨基酸残基开始。因此，例如，SEQ ID No 1 的 1 位等同于 GLP-1 (7-37)的 7 位(His)，SEQ ID No 1 的 16 位等同于 GLP-1 (7-37) 的22位(Gly)，SEQ ID No 1的20位等同于GLP-1 (7-37)的26位(Lys)，其它位和其它序 列反之亦然。因此，本发明还在优先权申请的权利要求1中提供包含修饰的GLP-1(7_37)序列 的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有i)与SEQ ID No 1的序列相比总共2、3、4、5或6个氨基酸的取代，包括a)在等同于GLP-1 (7-37)的22位(SEQ ID No 1的16位)的位置的Glu残基，和b)在等同于GLP-1 (7-37)的26位(SEQ ID No 1的20位)的位置的Arg残基；ii)任选地1个氨基酸残基的C末端延长，iii)任选地在等同于GLP-1 (7-37)的37位(SEQ ID No 1的31位)的位置的氨 基酸可以不存在，和iv)任选地C末端酰胺基团，所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37)的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位(分别为 SEQ ID No 1 的 12、14、17、24、25、 28、30或31位)的位置；本发明另外提供GLP-1衍生物、其方法和用途，以及其内容物对应于本发明的任 一项权利要求和具体的实施方案的药物组合物，其中相应的位置编号修正已如上所述解 释，并在上文针对优先权申请的权利要求1的GLP-1衍生物显示。本发明的其它实施方案1. 一种包含修饰的GLP-1序列7_37(SEQ ID No 1)的GLP-1衍生物，所述修饰的 GLP-1序列7-37具有i)与SEQ ID No 1的序列7-37相比总共2、3、4、5或6个氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg残基；ii)任选1个氨基酸残基的C末端延长，iii)任选在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基酸可不存在，和iv)任选C末端酰胺基团，而且其在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。在本发明的实施方案中，已修饰最多6个氨基酸。在本发明的实施方案中，已修饰 最多5个氨基酸。在本发明的实施方案中，已修饰最多4个氨基酸。在本发明的实施方案 中，已修饰最多3个氨基酸。在本发明的实施方案中，已修饰最多2个氨基酸。在本发明的 实施方案中，已修饰1个氨基酸。在本发明的实施方案中，已在C-末端加入1个氨基酸。在 本发明的实施方案中，已在C-末端缺失1个氨基酸。在本发明的实施方案中，存在C-末端 酰胺基团。2.实施方案1的GLP-1衍生物，其包含修饰的GLP-1序列7-37 (SEQ ID No 1)，所
36述修饰的GLP-1序列7-37具有i)与SEQ ID No 1的序列7-37相比总共2、3、4、5或6个氨基酸的取代，包括a)在等同于SEQ ID No 1的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于SEQ ID No 1的26位的位置的Arg残基；而且其在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34、36 或 37位。3.实施方案1的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQ ID No 1的37位的位置的氨基 酸不存在，所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 SEQ ID No 1 的 18、23、31、34 或 36 位的位置，且其中GLP-1类似物的总长度为30个氨基酸。4.实施方案1的GLP-1衍生物，其具有长度为1个氨基酸残基的C末端延长，其中 GLP-1类似物的总长度为32个氨基酸。5.实施方案1-4中任一项的GLP-1衍生物，其具有C_末端酰胺基团。6.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ ID NO 1的序列7_37相比具 有3个氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。7.实施方案1-6中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ ID NO 1的序列7_37相比在 选自以下的位置具有取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37位。8.实施方案7的GLP-1衍生物，其具有选自以下的取代去氨基His7、Aib8、 Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、 Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 和 Lys37。9.实施方案7-8中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的取代去氨基His7、 Aib8、Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34 禾口 Lys37。10.实施方案7-9中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的取代去氨基His7 和 Aib8。11.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ ID NO 1的序列7_37相比 具有4个氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。12.实施方案1-5和11中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ IDN0 1的序列7_37 相比在选自以下的位置具有两个取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37位。13.实施方案11-12中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的两个取代去 MS His7、Aib8、Lysl8> Cysl8、Lys20> Cys20、Lys23> Cys23>Asn24> Val25> Ala27> Leu27> Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 和 Lys37。14.实施方案11-13中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代 去氨基His7和Aib8，并具有选自以下的氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。15.实施方案11-14中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代 去氨基His7和Aib8，并具有选自以下的氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。16.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ ID NO 1的序列7-37相比具有5个氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。17.实施方案1-5和16中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ IDN0 1的序列7_37 相比在选自以下的位置具有3个氨基酸取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34和37。18.实施方案16-17中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的3个氨基酸取 代去氨基 His7、Aib8、Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、 Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 禾口 Lys37。19.实施方案16-18中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有选自以下的两个氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。20.实施方案16-19中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有选自以下的两个氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。21.实施方案1-5中任一项的GLP-1衍生物，其与SEQ ID NO 1的序列7-37相比 具有6个氨基酸取代，包括在22位和26位的取代。22.实施方案1-5和21中任一项的GLP-1衍生物，其在选自以下的位置具有4个 氨基酸取代:7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34 和 37。23.实施方案21-22中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的4个氨基酸取 代去氨基 His7、Aib8、Lysl8、Cysl8、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、 Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37 禾口 Lys37。24.实施方案21-23中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有选自以下的三个氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。25.实施方案21-24中任一项的GLP-1衍生物，其具有选自以下的氨基酸取代去 氨基His7和Aib8，并具有选自以下的三个氨基酸取代Lysl8、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、 Lys33、Lys34 和 Lys37。26.实施方案1-25中任一项的GLP-1衍生物，其已在18位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。27.实施方案1-26中任一项的GLP-1衍生物，其已在23位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。28.实施方案1-26中任一项的GLP-1衍生物，其已在31位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。29.实施方案1-26中任一项的GLP-1衍生物，其已在34位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。30.实施方案1-26中任一项的GLP-1衍生物，其已在36位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。31.实施方案1-26中任一项的GLP-1衍生物，其已在37位被PEG化或被白蛋白结
合残基衍生化。32.实施方案1-31中任一项的GLP-1衍生物，其已被PEG化。33.实施方案1-32中任一项的GLP-1衍生物，其中在等同于SEQID No 1的37位的位置的氨基酸已被Lys取代，所述Lys残基被PEG化或被白蛋白结合残基衍生化。34.实施方案1-33中任一项的GLP-1衍生物，其已被白蛋白结合残基衍生化。35.实施方案1-34中任一项的GLP-1衍生物，其具有下式(I)的序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-G lu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe_I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-X
一一 一 R式(I)(SEQ ID No :2)，优选具有除在20位具有Leu之外与式⑴相同的式(I’)，其中，Xaa7-Xaa8为L_组氨酸_Aib、去氨基-组氨酸-丙氨酸或去氨基-组氨酸_Aib ；Xaa9为Glu或Glu衍生物，例如a，a 二甲基-Glu ；Xaa16 为 Val 或 Leu ；Xaa18 为 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 为 Leu 或 LysXaa23 为 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 为 Ala 或 AsnXaa25 为 Ala 或 Val ；Xaa27 为 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg，优选为 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa31 为 Trp、Cys 或 Lys ；Xaa33 为 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Cys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 为 Gly 或 Aib ；Xaa36 为 Arg 或 Lys ；Xaa37 为 Gly、Aib、Cys、Lys 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu 或不存在；R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37不存在，则Xaa38也不存在，且所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 SEQID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、 31、34、36 或 37 位。36.实施方案1-35中任一项的GLP-1衍生物，其具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln -Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa3o_Trp-Leu-Xaa33_Xaa34_Xaa35_Xaa36-Xaa37-Xaa38-R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7为L_组氨酸、D_组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、0 -羟基-组氨 酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、a-氟甲基-组氨酸、a-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；
Xaa8 为 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)甲酸、(1_ 氨基环丁 基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨 基环辛基)甲酸；Xaa18 为 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 为 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 为 Val 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 为 Gly 或 Aib ；Xaa36 为 Arg 或 Lys，Xaa37 为 Gly、Aib、Lys 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu 或不存在；R为酰胺或不存在且所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 SEQ ID No 1 的 18、20、23、30、31、34、36 或 37 位的位置，优选在 SEQ ID No 1 的 18、23、 31、34、36 或 37 位。37.实施方案35-36中任一项的GLP-1衍生物，其中Xaa38不存在。38.实施方案35-37中任一项的GLP-1衍生物，Xaa37和Xaa38均不存在。39.实施方案35-38中任一项的GLP-1衍生物，其中Xaa37和Xaa38均不存在，而 Xaa36 为 Xaa36-酰胺。40.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中3个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7为去氨基-组氨酸。41.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中4个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7为去氨基-组氨酸。42.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中5个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7为去氨基-组氨酸。43.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中6个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa7为去氨基-组氨酸。44.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中3个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8为Aib。45.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中4个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8为Aib。46.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中5个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8为Aib。47.实施方案35-39中任一项的GLP-1衍生物，其中6个氨基酸相比于SEQ ID NO 1的序列7-37被取代，其中Xaa8为Aib。48.实施方案35-47中任一项的GLP-1衍生物，其中Xaa7为去氨基-组氨酸。49.实施方案1-48中任一项的GLP-1衍生物，其在修饰的GLP-1序列和一个或多 个白蛋白结合残基之间含有亲水间隔基。50.实施方案49的GLP-1衍生物，其中所述亲水间隔基为在两个末端具有合适的
40官能团的未分支的寡乙二醇部分，其在修饰的GLP-1序列的氨基和白蛋白结合残基的官能 团之间形成桥。51.实施方案1-59中任一项的GLP-1衍生物，其已被白蛋白结合残基衍生化。52.实施方案1-51中任一项的GLP-1衍生物，其中至少一个氨基酸残基被 A-B-C-D-衍生化，
其中A-选自 和5，
和无磺酰胺的四唑，
其中 n 选自 14、15、16、17、18 和 19，p 选自 10、11、12、13 和 14，d 选自 0、1、2、3、4
-B-选自
和 其中x 选自 0、1、2、3 和 4，y 选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12，-C-选自 其中b和e各自独立地选自0、1和2，c和f各自独立地选自0、1和2，条件是当c 为0时b为1或2，或者当c为1或2时b为0，且当f 为0时e为1或2，或者当f 为1或2时e为0，和-D-连接至所述氨基酸残基，并为接头。53.实施方案52的GLP-1衍生物，其中一个氨基酸残基被A-B-C-D-衍生化。54.实施方案52-53中任一项的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸残基包含氨基。55.实施方案52-54中任一项的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸残基在侧链包
含伯氨基。56.实施方案52-55中任一项的GLP-1衍生物，其中衍生化的氨基酸残基为赖氨酸。57.实施方案52-56中任一项的GLP-1衍生物，其中仅一个氨基酸残基被衍生化。58.实施方案52-57中任一项的GLP-1衍生物，其中A-为 59.实施方案52-58中任一项的GLP-1衍生物，其中n选自15和17，更优选17。60.实施方案52-57中任一项的GLP-1衍生物，其中A-为 61.实施方案52-57和60中任一项的GLP-1衍生物，其中p选自12、13和14，更 优选为13。62.实施方案52-57和60-61中任一项的GLP-1衍生物，其中d选自0、1、2、3和 4，更优选为0、1和2，最优选为1。63.实施方案52-57和52-62中任一项的GLP-1衍生物，其中d选自0、1和2，p选 自12、13或14，更优选地d选自1和2，p选自13和14，最优选地d为l，p为13。64.实施方案52-63中任一项的GLP-1衍生物，其中_B_为 65.实施方案52-63中任一项的GLP-1衍生物，其中_B_为 66.实施方案52-63中任一项的GLP-1衍生物，其中_B_为 67.实施方案52-63中任一项的GLP-1衍生物，其中_B_为 68.实施方案67的GLP-1衍生物，其中x选自0、1和2，更优选地x选自0和1，最 优选地x为0或1，优选为0。69.实施方案52-63中任一项的GLP-1衍生物，其中_B_为 70.实施方案69的GLP-1衍生物，其中y选自2、3、4、5、6、7、8、9和10，更优选地 y 选自 2、3、4、5、6、7 和 8。71.实施方案52-70中任一项的GLP-1衍生物，其中_C_为 72.实施方案71的GLP-1衍生物，其中c选自0和l，b选自1和2，更优选地b为 1或2，优选为2;c为0。73.实施方案52-70中任一项的GLP-1衍生物，其中_C_为 74.实施方案73的GLP－1衍生物，其中F选自0和1，e选自1和2，更优选的e为1，f为0
75.实施方案52-70中任一项的GLP-1衍生物，其中_C_为 76.实施方案52-70中任一项的GLP-1衍生物，其中D选自 其中k 选自 0、1、2、3、4、5、11 和 27，m 选自 0、1、2、3、4、5 和 6。77.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 78.实施方案77的GLP-1衍生物，其中k选自1、2、3、11和27，更优选的k为1。79.实施方案77-78中任一项的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选 的m选自0、1和2。80.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 81.实施方案80的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选的m选自0、1 和2。82.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 83.实施方案82的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选的m选自0、1 和2。84.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 85.实施方案84的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选的m选自0、1 和2。86.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 87.实施方案86的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选的m选自0、1 和2。88.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中_D_为 89.实施方案88的GLP-1衍生物，其中m选自0、1、2、3和4，更优选的m选自0、1 和2。90.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-选自以下并由以下
组合
45 91.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-选自以下并由以下 组合 92.实施方案52-76中任一项的GLP-1衍生物，其中A-B-C-D-选自
93.以上实施方案中任一项的衍生物，其选自
N-e 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l (7-37)酰胺，N-e 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-e 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((1 )-3-[1-(17-羧基十七酰基)哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-1- (7-37)酰胺，N-e 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys30] GLP-1-(7-37)，N-e 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys31] GLP-1-(7-37)，N-￡31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(⑶-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九酰基)哌 啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基) [Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-1-(7-37)，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)， N- e 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)，N-￡ 20-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16-(lH_ 四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-￡ 37-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16-(lH_ 四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺，N-￡ 37-[2-(2-{2-[(S)_4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(lH-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺，
[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-1-(7-37) Lys [2-(2-{2-[4-羧 基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]丁酰基 氨基}丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]，N- e 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺，N- e 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙酰基)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺，N- e 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六酰基氨基)_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六酰基氨基)_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺，N-e 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺， N- e 36- (2_ (2_ (2_ ((2_ [2_ (2_ (17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36]GLP-l-(7-37)Glu-酰 胺，N-e 37-[4-(16_(lH-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，N- e 37_ [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ (19_ 羧基十九酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)，和N- e 31_[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基-4_(17_ 羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-1-(7-37)。94. 一种增加GLP-1类似物在患者中的作用时间的方法，其特征在于修饰的GLP-1 序列7-37(SEQ ID No 1)被衍生化或PEG化，如在前述实施方案的任一项中所公开的。95. 一种用于将GLP-1衍生物在患者中的作用时间增加至约40小时以上的方法， 其特征在于修饰的GLP-1序列7-37(SEQ ID No 1)被衍生化或PEG化，如在前述实施方案 的任一项中所公开的。96. 一种药物组合物，其包含实施方案1-93中的任一项的衍生物和药学上可接受 的赋形剂。97.实施方案96的药物组合物，其适于胃肠外给药。98.实施方案1-93中的任一项的衍生物用于制备药物的用途。99.实施方案1-93中任一项的衍生物在制备用于治疗或预防下列疾病的药物中 的用途高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂 异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。100.实施方案1-93中任一项的衍生物在制备用于延迟或预防2型糖尿病的疾病 发展的药物中的用途。101.实施方案1-93中任一项的衍生物在制备用于减少食物摄取、减少0 _细胞凋 亡、增强细胞功能和细胞量和/或恢复细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。102.实施方案1-93中任一项的衍生物，其用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、 葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌 梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。本发明进一步的具体实施方案1. 一种包含修饰的GLP-1 (7-37)序列的GLP-1衍生物，所述修饰的GLP-1 (7-37) 序列具有i)与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相比总共2-12个氨基酸修饰，包括a)在等同于GLP-1 (7-37)的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于GLP-1 (7-37)的26位的位置的Arg残基；和ii)其在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于GLP-1 (7-37) 的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。2.实施方案1的GLP-1衍生物，其包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸修 饰；优选4-12个修饰，例如4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸修饰；或者例如4、5、6、7、8、
9或12个氨基酸修饰；更优选5-11个氨基酸修饰；甚至更优选6-10个氨基酸修饰；最优选 7-9个氨基酸修饰。3.实施方案1-2中任一项的GLP-1衍生物，其与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相 比，包含2-8个氨基酸取代，优选2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。4.实施方案3的GLP-1衍生物，其包含3_8个氨基酸取代，优选4_8个氨基酸取 代，更优选5-8个氨基酸取代，甚至更优选6-8个氨基酸取代，最优选7-8个氨基酸取代。5.实施方案3的61^-1衍生物，其包含1)4、^)5、^1)6、^)7或力8个氨基酸取 代。6.实施方案 3-5 中任一项的 GLP-1 衍生物，其在 7、8、20、25、28、30、31、34、35、36 或37位中的一个或多个、优选在7位和/或8位被取代。7.实施方案1-6中任一项的GLP-1衍生物，其在7位或8位包含非天然氨基酸。8.实施方案7的GLP-1衍生物，其包含7_去氨基-组氨酸或8_Aib。9.实施方案1-7中任一项的GLP-1衍生物，其包含7-去氨基-组氨酸、8_Aib、20K、 25V、28F(m-CF3)、30E、30K、31K、34-Dap、34R、35-Aib、35K、35R、36K、37K、37K- e、37P 和 / 或 37R中的一个或多个。10.实施方案1-9中任一项的GLP-1衍生物，其与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相 比，包含1-3个氨基酸缺失，优选1、2或3个氨基酸缺失。11.实施方案10的GLP-1衍生物，其中所述缺失处于C-末端。12.实施方案 11 的 GLP-1 衍生物，其为 GLP-l(7-36)、GLP-l(7-35)或 GLP_1(7_34) 衍生物。13.实施方案1-9中任一项的GLP-1衍生物，其与GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)相
53比，包含1-4个氨基酸添加，优选1、2、3或4个氨基酸添加。14.实施方案13的GLP-I衍生物，其中所述添加处于C-末端。15.实施方案 14 的 GLP-I 衍生物，其为 GLP-1 (7-38)、GLP-I (7-39)、GLP-I (7-40) 或GLP-I (7-41)衍生物。16.实施方案1-15中任一项的GLP-I衍生物，其具有(i)C_末端酰胺基团；或(ii) C-末端羧基，优选游离羧基(-C00H)，或其盐。17.优选实施方案1-16中任一项的GLP-I衍生物，其具有下式(I)的序列Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-X&&23_Xa￡l24_Xa￡l25_Arg_X￡l￡l27_Xa￡l28_I 1
38 _Xclclgg __X&&41_R式(I)(SEQ ID No 2)其中，(Xaa7-Xaa8)为(L_组氨酸-Aib)、(去氨基-组氨酸-丙氨酸)或(去氨基-组 氨酸-Aib)；Xaa9为Glu或Glu衍生物，例如α，α 二甲基-Glu ；Xaa16 为 Val 或 Leu ；Xaa18 为 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 为 Leu 或 Lys ；Xaa23 为 Gin、Glu、Lys> Cys 或 Arg ；Xaa24 为 Ala 或 Asn ；Xaa25 为 Ala 或 Val ；Xaa27 为 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28 为 Phe 或 Phe 衍生物，例如 m-CF3_Phe ；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Trp、Cys 或 Lys ；
Xaa33 为 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg, Lys, Aib 或不存在；Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Cys, Lys, ε -氨基-Lys, Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在； 前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，那么其下游的氨基酸残基也不存 在；且所述GLP-I衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。
18.实施方案17的GLP-I衍生物，其中，(Xaa7-Xaa8)为(L_组氨酸-Aib)或(去氨基-组氨酸-丙氨酸)；Xaa9 为 Glu ；Xaa16 为 Val ；Xaa18 为 Ser ；Xaa20 为 Leu 或 Lys ；Xaa23 为 Gln ；Xaa24 % Ala ；Xaa25 为 Ala 或 Val ；Xaa27 为 Glu ；Xaa28 为 Phe 或 Phe 衍生物，例如 m-CF3_Phe ；Xaa30 为 Ala、Glu 或 Lys ；Xaa31 为 Trp 或 Lys ；Xaa33 为 Val ；Xaa34 为 Lys、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg, Lys, Aib 或不存在；Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在；且所述GLP-I衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。19.优选实施方案1-18中任一项的GLP-I衍生物，其具有下式(II)的序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Gl u_G ln_A la_Ala_Arg-G Iu-Phe-1 Ie-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xa
已38 ___X&&41_R式(II)(SEQ ID No 3)其中，Xaa7为L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、β -羟基-组氨酸、高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨 酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Xaa8 为 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、(1_ 氨基环丙基)甲酸、(1_ 氨基环丁 基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨 基环辛基)甲酸；
Xaa18 为 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Lys 或 Trp ；Xaa33 为 Val 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；
Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys > Glu、Arg 或不存在； Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在；且所述GLP-I衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I(7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。20.实施方案19的GLP-I衍生物，其中，Xaa7为L-组氨酸或去氨基_组氨酸；Xaa8 为 Ala 或 Aib ；Xaa18 为 Ser ；Xaa30 为 Ala、Glu 或 Lys ；Xaa31 为 Lys 或 Trp ；Xaa33 为 Val ；Xaa34 为 Lys > Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36 为 Arg、Lys 或不存在；Xaa37 为 Gly、Lys、ε -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys> Glu、Arg 或不存在；Xaa39 为 Lys、Arg 或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在；且所述GLP-I衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同 于 GLP-I(7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37、38 或 39 位的位置。21.实施方案1-20中任一项的GLP-I衍生物，其在一个位置被衍生化。22.实施方案1-20中任一项的GLP-I衍生物，其在一个或多个位置、优选在两个位 置、在三个位置或在四个位置被衍生化。
23.实施方案1-22中任一项的GLP-I衍生物，其在以下位置被衍生化i) 18位、 土土)20位、^丨)23位、&)30位^)31 位、vi) 34 位、vii) 36 位、viii) 37 位、ix) 38 位和 / 或 χ) 39 位。24.实施方案1-23中任一项的GLP-I衍生物，其在以下位置被衍生化i)20位、 ii)30 位、iii)31 位、iv) 36 位、ν) 37 位、vi)38 位或 vii) 39 位。25.实施方案1-24中任一项的GLP-1衍生物，其被PEG化。26.实施方案1-24中任一项的GLP-I衍生物，其中白蛋白结合残基选自i)直链 烷基，优选C15烷基；ii)式CH3 (CH2)rCO-的酰基，其中优选r为14或16。27.实施方案1-24和26中任一项的GLP-I衍生物，其包括在白蛋白结合残基和 GLP-I部分之间的接头，其中所述接头包含、优选为i) 一个或多个烷撑二醇单元，例如1-10个，优选5-8个，更优选6个；ii)式X的化合物C，其中c为0，b为2;iii)式XVI的化合物，其中q为1或2 ；或iv)i)-iii)的任意组合，例如ii)和iii)的组合。28.优选依据实施方案1-27中任一项的GLP-I衍生物，其中至少一个氨基酸残基 被A-B-C-D-衍生化，其中A-选自 其中四唑环任选为N-取代的，和其中η 选自 14、15、16、17、18 和 19，ρ 选自 10、11、12、13 和 14，d 选自 0、1、2、3、4 和5，-B-选自
(式 VI)， H
(式 VII)，
(式 VIII)，和
(式 IX)，
其中χ 选自 0、1、2、3 和 4，y 选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12， 其中b和e各自独立地选自0、1和2，c和f各自独立地选自O、1和2，条件是当c 为O时b为1或2，或者当C为1或2时b为0，当f为O时e为1或2，或者当f为1或2 时e为0，和-D-连接至所述氨基酸残基并为接头。29.实施方案1-28中任一项的GLP-I衍生物，其中衍生化的氨基酸残基为赖氨酸， 其优选通过ε氨基衍生化。30.优选依据实施方案1-29中任一项的GLP-I衍生物，其选自以下物质Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[1-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I (7-37)酰胺；Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37)酰胺；Ν-ε 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-羧基十七酰基)哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-I- (7-37)酰胺；Ν-ε 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys30]GLP-I-(7-37)；Ν-ε 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys31]GLP-I-(7-37)；N-ε 31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九酰基)哌
啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-I-(7-37)；
N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基圯87，611122，六『826，六『834，1^837]61^-1-(7-37)；N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)；N-ε 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺；N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4-((S)_4-羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8, Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰 胺；[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-1-(7-37) Lys [2_ (2_ {2_ [4_ 羧
基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]丁酰基 氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]；N- ε 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺；N- ε 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙酰基)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺；N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六酰基氨基)_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六酰基氨基)_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺；Ν-ε 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1 (7-37)酰胺
N- ε 36- (2_ (2_ (2_ ((2_ [2_ (2_ (17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36] GLP-I-(7-37) Glu-酰 胺；N-ε 37-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 31-[2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基 _4-(17_ 羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-I-(7-37)；N- ε 20- (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [2_ ((S) _4_ 羧基 _4_ 十六酰基氨基-丁酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙酰基)[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30， Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺；N- ε 37- (2_ {2_ [2~ ((S) ~4~ 羧基 _4_ {(S) ~4~ 羧基 _4_ [ (S) ~4~ 羧基-4-(19-羧 基_十九酰氨基)丁酰基氨基]丁酰基氨基} 丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[去 氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N-ε 37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-叔 丁 基-2H-四 唑-5-基)-十六酰基氨磺酰基]丁酰基氨基}十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基]-4-羧 基丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}[去氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I(7-37)；N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37).N- α 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, ε-Lys37]GLP-I-(7-37)肽；N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 36- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (15-羧基-十五酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys 肽；[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys (2- (2- {2-[2-(2- {2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙 酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基)肽； N- ε 37- [2~ (2~ {2_ [2~ (2~ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基十九酰基氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I-(7-37)；
N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基]_[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Aib35, Lys37]GLP-I-(7-37)；N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[ (S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37] GLP-I-(7-37)；Ν-ε 31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4_(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-仏让8，611122，￥￡1125^印26， Lys31，Arg34，Arg35，Arg37)] GLP-I (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41]；N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[ (S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Lys35, Lys36]GLP-l-(7_36)酰胺；N- ε 31-{2_ (2_ {2_[2_ (2_ {2_[4_ 羧基 _4-(17_ 羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}_Ν-β34-(2-(双-羧基甲基 氨基)乙酰基)[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-I (7-34)酰胺；和^￡-37-[(5)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17_羧基十七酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁酰基][Aib8，Glu22，Arg26，34， Lys37]GLP-I(7-37)。31. 一种药物组合物，其包含实施方案1-30中任一项的衍生物或其药学上可接受 的盐、酰胺、烷基或酯等，以及药学上可接受的赋形剂。32.实施方案1-30中任一项的衍生物或实施方案31的药物组合物，其用作药物。33.实施方案1-30中任一项的衍生物或实施方案31的药物组合物，其用于治疗 或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异 常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不 良和胃溃疡。34.实施方案33的衍生物或药物组合物，其用于治疗或预防2型糖尿病。35.实施方案1-30中任一项的衍生物或实施方案31的药物组合物在制备用于治 疗或预防下列疾病的药物中的用途高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、 肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾 病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。36.实施方案35的用于治疗或预防2型糖尿病的用途。37. 一种通过给予药物活性量的实施方案1-30中任一项的衍生物或实施方案31 的药物组合物治疗或预防下列疾病的方法高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖 尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血 管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。38.用于治疗或预防2型糖尿病的实施方案37的方法。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都通过引用结合到本文 中，其程度如同每个参考文献都单独地并具体地被指出通过引用结合到本文中并全文阐 述。
本文所使用的所有标题和子标题仅是为了方便起见使用，不应被视为以任何方式 限制本发明。
除非本文中另行指明或除非明显与本文相抵触，否则本发明包括在其所有可行变 体中的上述要素的任何组合。除非本文中另行指明或明显与本文相抵触，否则用于描述本发明的术语“一个”、 “一种”、“所述”和“该”和类似对象被视为既包括单数又包括复数。除非另行指明，否则本文对数值范围的记载仅为简化记载方法，其包括落在该范 围内的每个独立数值，且每个独立数值都加入本说明书，就像其在本文中被逐一列举一样。 除非另行指明，否则本文提供的所有精确数值是相应近似值的代表(例如，关于特定因素 或测量值提供的所有精确示例性数值可以被视为也提供在适当时用“大约”修饰的相应近 似测量值)。除非本文中另行指明或明显与本文相抵触，否则本文所述的所有方法可以以任何 合适的次序进行。除非另行指明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性用语(例如“如”)的使 用仅用于更好地阐述本发明，而非对本发明的范围施加限制。除非明确指明，否则本说明书 中的用语都不应被视为表明任何要素对本发明的实践是必要的。本文中专利文献的引用和结合仅为方便起见，并且不反映对这些专利文献的有效 性、可专利性和/或法律可执行性的任何看法。关于一种或多种要素，本文中使用“包含”、“具有”、“包括”或“含有”之类的术语 对本发明的任何方面或实施方案的描述旨在提供对“由该特定要素构成”、“基本由该特定 要素构成”或“基本包含该特定要素”的本发明的类似方面或实施方案的支持，除非本文中 另行指明或明显与本文相抵触(例如，除非本文中另行指明或明显与本文相抵触，否则本 文中被描述为包含特定要素的制剂应该被理解为也描述了由该要素构成的制剂)。本发明包括适用法律最大程度允许的本文提供的实施方案、方面和权利要求中所 提及的主题的所有修饰和等同物。以下述代表性方法和实施例进一步阐述本发明，但是，所述代表性方法和实施例 无意以任何方式限制本发明的范围。在前述和以下实施例中公开的特征可以既独立地又以其组合地为以其多种不同 形式实现本发明的材料。
实施例使用的缩写r. t 室温DIPEA 二异丙基乙胺H2O :7jCCH3CN 乙腈DMF NN 二甲基甲酰胺HBTU :2-(1Η-苯并三唑-1-基_) -1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸盐Fmoc :9H_芴_9_基甲氧基羰基
Boc 叔丁氧羰基OtBu 叔丁酯tBu 叔丁基Trt:三苯甲基 Pmc :2，2，5，7，8-五甲基-色烷-6-磺酰基Dde (4，4-二甲基-2，6-二氧环亚己基)乙基ivDde 1_(4，4_ 二甲基 _2，6_ 二氧环亚己基)_3_ 甲基丁基Mtt 4-甲基三苯甲基Mmt 4-甲氧基三苯甲基DCM: 二氯甲烷TIS 三异丙基硅烷TFA:三氟乙酸Et2O:乙醚NMP 1-甲基-吡咯烷-2-酮DIPEA 二异丙基乙胺 HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑HOBt 1-羟基苯并三唑DIC: 二异丙基碳二亚胺MW:分子量A 结合树脂的肽的合成SPPS 方法 A使用制造商提供的FastMoc UV方法，在Applied Biosystems 433肽合成仪上根 据Fmoc策略合成0. 25mmol或1. Ommol量级的经保护的肽基树脂，所述FastMoc UV方法采 用在NMP (N-甲基吡咯烷酮)中冊1^(2-(1!1-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鐺六氟 磷酸盐)或HATU(0-(7_氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸盐)介导 的偶联，并且UV监测Fmoc保护基团的去保护。用于合成肽酰胺的初始树脂是Rink-Amide 树脂，并将Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的肽。除了非天然的氨基酸 如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基异丁酸)以外，所用的经保护的氨基酸衍生物是在适合用于 ABI433A合成仪的预称量筒中提供的标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem 提供)。N末端氨基酸在α氨基处Boc保护(例如将Boc-His (Boc) OH用于N末端具有His 的肽)。26位的赖氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，这取决于连接白蛋 白结合部分和间隔基的路线。肽的合成在某些情况下可以利用在二肽酰胺键上用酸性条件 下能够被切割的基团保护的二肽来改善，所述基团例如是但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧 基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况中，可以使用假脯氨酸 二肽(参见例如 Novobiochem 2002/2003 或更新版的目录，或 W. R. Sampson (1999)，J. Pep. Sci. 5，403)。SPPS 方法 B:一种替代的肽合成方法(方法B)是在基于微波的Liberty肽合成仪(CEM Corp.， North Carolina)上进行Fmoc化学。树脂为载量为0. 24mmol/g的Tentagel S RAM。偶联化学为DIC/HOAt的NMP溶液，使用在NMP中的0. 3M氨基酸溶液，摩尔过量8_10倍。偶联 条件为最高70°C、5分钟。去保护采用最高70°C、5%哌啶的NMP溶液。当需要化学修饰赖 氨酸侧链时，赖氨酸作为Lys(Mtt)掺入。如下除去Mtt基团将树脂在纯六氟异丙醇中悬 浮20分钟，之后用DCM和NMP洗涤。通过人工合成或在Liberty上的一个或多个自动化步 骤，之后人工偶联，进行赖氨酸的化学修饰。另一个肽合成方法是在ABI 433上采用HBTU 偶联的Fmoc化学。在合成后，用DCM洗涤树脂，并干燥，用TFA/TIS/水(92. 5/5/2. 5)处理 2小时，之后用二乙醚沉淀，由树脂裂解肽。将所述肽溶解在30%乙酸或相似的溶剂中，并 通过标准RP-HPLC在C18柱上使用乙腈/TFA纯化。肽的身份通过MALDI-MS证实。SPPS 方法 C使用制造商提供的方法，在Advanced ChemTech Synthesiser (APEX 348)上根据 Fmoc策略合成0. 25mmol量级的经保护的肽基树脂，所述方法采用在NMP (N-甲基吡咯烷 酮)中DIC(二环己基碳二亚胺)和HOBtd-羟基苯并三唑)介导的偶联。用于合成肽酰 胺的初始树脂是Rink-Amide树脂，并将Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的 肽。所用的经保护的氨基酸衍生物是标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem 提供)。N末端氨基酸在α氨基处Boc保护(例如将Boc-His (Boc) OH用于N末端具有His 的肽)。26位的赖氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，这取决于连接白蛋 白结合部分和间隔基的路线。肽的合成在某些情况下可以利用二肽来改善，所述二肽例如 得自 Novabiochem 的假脯氨酸、Fmoc-Ser (tbu) - Ψ Ser (Me，Me)_0H，参见例如 Novobiochem 2002/2003 或更新版的目录，或 W. R. Sampson (1999)，J. Pep. Sci. 5，403。除去ivDde或Dde-保护的方法 将树脂(0.25mmol)置于一个手动振荡器/过滤装置中，并用在N-甲基吡咯烷 酮中的2%胼(20ml，2xl2分钟)处理，以除去Dde或ivDde基团，并用N-甲基吡咯烷酮 (4x20ml)洗涤。除去Mtt或Mmt-保护的方法将树脂(0.25mmol)置于手动振荡器/过滤装置中，并用在DCM中的2 % TFA和 2-3 % TIS处理(20ml，5-10分钟，重复6-12次)，以除去Mtt或Mmt基团，并用DCM (2x20ml)、 10% MeOH和5% DIPEA的DCM(2x20ml)溶液和N-甲基吡咯烷酮(4x20ml)洗涤。除去Mtt-保护的替代方法将树脂置于注射器中，并用六氟异丙醇处理2X10分钟，以除去Mtt基团。然后如 上所述用DCM和NMP洗涤树脂。将侧链连接至赖氨酸残基的方法白蛋白结合残基(式I的B-U-侧链)可以使用标准酰化试剂(例如但不限于DIC、 H0Bt/DIC、H0At/DIC或HBTU)酰化至结合树脂的肽上或在溶液中酰化至未受保护的肽上而 连接至所述肽。连接至结合树脂的肽路径I将活化的(活化酯或对称酸酐)白蛋白结合残基(式I的A-B)-侧链)例如十八 烷二酸单_(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等人，EP511600，相对于结合树脂的 肽4摩尔当量)溶解于NMP(25mL)中，在室温下加入至树脂并摇动过夜。过滤反应混合物，并用NMP、二氯甲烷、2-丙醇、甲醇和二乙醚仔细洗涤树脂。路径II将白蛋白结合残基(式I的A-(B)-侧链)溶解于N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷 (1 1,10ml)中。加入活化试剂例如羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂4摩尔当量)和二 异丙基碳二亚胺(相对于树脂4摩尔当量)，并搅拌溶液15分钟。将该溶液加入至树脂中， 并加入二异丙基乙胺(相对于树脂4摩尔当量)。将树脂在室温下摇动2-24小时。用N-甲 基吡咯烷酮(2x20ml)、N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷(1 1) (2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml) 洗涤树脂。路径III将活化的(活化酯或对称酸酐)白蛋白结合残基(式I的A-B-侧链)例如十八 烷二酸单_(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等人，EP511600，相对于结合树脂的 肽1-1. 5摩尔当量)溶解于有机溶剂(例如乙腈、THF、DMF、DMS0)或水/有机溶剂混合物 (l-2ml)中，并连同10摩尔当量DIPEA—起加入所述肽的水溶液(10-20ml)。就白蛋白结 合残基上的保护基团例如叔丁基的情况而言，冻干反应混合物过夜(0/N)，并将分离的粗肽 产物去保护，随后就叔丁基的情况而言，将所述肽溶解于三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的混 合物(90 5 5)中。在30分钟后，真空蒸发混合物，并通过制备级HPLC纯化最终的肽。除去Fmoc-保护的方法将树脂(0. 25mmol)置于手动振荡器装置的滤瓶中，并用N-甲基吡咯烷酮/ 二氯 甲烷(1 1) (2x20ml)和N-甲基吡咯烷酮(1x20ml)、20 %哌啶的N-甲基吡咯烷酮溶液 (3x20ml，每次10分钟)处理。用N-甲基吡咯烷酮(2x20ml)、N_甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷 (1 1) (2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml)洗涤树脂。用于将肽从树脂裂解开的方法用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的混合物(95 2.5 2. 5至92 4 4)在室 温下搅拌180分钟将肽从树脂裂解。过滤裂解混合物，并将滤过液通过氮气流浓缩为油状 物。用45ml乙醚从该油状物中沉淀出粗肽，并用45ml乙醚洗涤1至3次。将粗肽在装填有5 μ或7 μ C_18 二氧化硅的20mmX250mm柱上通过半制备 HPLC纯化。根据所述肽使用一个或两个纯化系统。TFA:干燥后，将所述粗肽溶解于5ml 50%乙酸H2O中，用H2O稀释至20ml，并将其 注射至柱上，随后将该柱在40°C下于50分钟内用40-60% CH3CN的0. TFA梯度以IOml/ 分钟洗脱。收集含有所述肽的级分。用水稀释洗脱物后冻干纯化的肽。硫酸铵该柱用经浓H2SO4调节至pH 2. 5的40 % CH3CN的0. 05M (NH4) 2S04溶液平 衡。干燥后，将粗肽溶解于5ml 50%乙酸H2O中，用H2O稀释至20ml，并注射至柱上，随后在 40°C下于50分钟内用40-60% CH3CN的0. 05M(NH4)2SO4梯度，pH 2. 5以IOml/分钟洗脱。收
集含有所述肽的级分，并用3倍体积的H2O稀释，使其通过已用ο. ι% TFA平衡的Sep-Pak
C18柱(Waters件号51910)。随后用含有0. 1% TFA的70% CH3CN将其洗脱，并在用水稀 释洗脱物后通过冷冻干燥来分离纯化的肽。获得的终产物通过分析型RP-HPLC(保留时间)和LCMS鉴定。RP-HPLC分析可以用 214nm下的 UV检测和例如 Vydac218TP544. 6mmx250mm5 μ C-18 二氧化硅柱(The Separations Group,Hesperia,USA)进行，并在 42°C下以例如 lml/分钟洗脱。最经常使用以下的具体条件之一方法03_A1_1HPLC (方法03_A1_1)使用配有Waters 996 二极管阵列检测器的Waters 2690系 统进行 RP-分析。在 218TP544. 6mmx250mm5 μ C-18 二氧化硅柱(The S印erations Group, Hesperia)上于214、254、276和301nm收集UV检测，所述柱于42°C以Iml/分钟洗脱。所 述柱用以4M硫酸调节至pH 2. 5的10% 0. 5M硫酸铵平衡。在注射后，以0% -60%乙腈在 相同水性缓冲液中的梯度在50分钟内洗脱样品。方法03_B1_2HPLC (方法03_B1_2)使用配有Waters 996 二极管阵列检测器的Waters 2690系统进行 RP-分析。在 Zorbax 300SB C-18 (4，5x150mm，5 μ )上于 214、254、276 和 301nm 收 集UV检测，所述ZorbaX300SBC-18柱于42 V以0. 5ml/分钟洗脱。所述柱用TFA的水溶液 (0. 1% )平衡。在注射后，以0% -60%乙腈(+0. 1% TFA)在TFA水溶液(0. 1 % )中的梯 度在50分钟内洗脱样品。方法02_B1_1HPLC(方法 02_B1_1)使用配有 Waters 2487 双频带检测器的 Alliance Waters 2695 系统进行 RP-分析。使用 Vydac 218TP53, C18,300A, 5um, 3. 2mmx250mm 柱于 42°C于 214nm和254nm收集UV检测。以0-60%乙腈、95-35%水和5%三氟乙酸(1. 0% )的水溶 液的线性梯度在50分钟内以0. 50ml/分钟的流速洗脱。方法01_B4_2HPLC (方法01_B4_2)使用配有Waters 996 二极管阵列检测器的Waters 600S系 统进行 RP-分析。使用 Symmetry300C18，5um, 3. 9mmx 150mm 柱于 42°C于 214nm 和 254nm 收 集UV检测。以5-95%乙腈、90-0%水和5%三氟乙酸(1.0% )的水溶液的线性梯度在15 分钟内以1. Oml/分钟的流速洗脱。方法02_B4_4HPLC(方法 02_B4_4)使用配有 Waters 2487 双频带检测器的 Alliance Waters 2695 系统进行 RP-分析。使用 Symmetry300C18，5um，3. 9mmxl50mm 柱于 42°C 于 214nm 和 254nm收集UV检测。以5-95%乙腈、90-0%水和5%三氟乙酸(1. 0% )的水溶液的线性梯 度在15分钟内以1. Oml/分钟的流速洗脱。方法02_B6_1HPLC(方法 02_B6_1)使用配有 Waters 2487 双频带检测器的 Alliance Waters 2695 系统进行 RP-分析。使用 Vydac 218TP53, C18,300A, 5um, 3. 2mmx250mm 柱于 42°C于 214nm和254nm收集UV检测。以0-90%乙腈、95-5%水和5%三氟乙酸(1.0%)的水溶液 的线性梯度在50分钟内以0. 50ml/分钟的流速洗脱。方法03_B6_1HPLC (方法03_B1_1)使用配有Waters 996 二极管阵列检测器的Waters 2690系 统进行 RP-分析。在 218TP544. 6mmx250mm 5 μ C-18 二氧化硅柱(The S印erations Group, Hesperia)上于214、254、276和301nm收集UV检测，所述柱于42°C以Iml/分钟洗脱。所 述柱用5%乙腈(+0. 1% TFA)的TFA水溶液(0. 1 % )平衡。在注射后，以0% -90%乙腈 (+0. 1% TFA)的TFA水溶液(0. )梯度在50分钟内洗脱样品。
或者，可以如上所示进行制备型梯度洗脱，并指示其中洗脱化合物的乙腈百分率。 身份通过MALDI证实。使用下列仪器LCMS 在由 Sciex API IOOSingle quadropole Mif Perkin Elmer200 % ^lJ Quard 泵、Perkin Elmer 200 系列自动采样器、AppliedBiosystems 785A UV 检测器、Sedex 75蒸发光散射检测器组成的装置上进行。仪器控制和数据采集由在Windows 2000计算机上运行的SciexSample控制软件 完成。HPLC泵连接至两个洗脱液贮液器，贮液器含有A :0. 05%三氟乙酸的水溶液B 0. 05%三氟乙酸的乙腈溶液 在室温下，通过注射适宜量样品(优选20 μ 1)至经乙腈梯度洗脱的柱上进行分 析。使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。柱=Waters Xterra MS C-18X 3mm，直径 5μπι梯度 在7. 5分钟内以1. 5ml/分钟进行的5% -90%乙腈线性梯度检测 210nm(从DAD模拟输出)ELS (从 ELS 模拟输出)，40°CMS离子化模式API-ES备选地，LCMS在由HewlettPackard 1100系列G1312A BinPump,Hewlett Packard 1100 系列柱室、Hewlett Packard 1100 系列 G1315A DAD 二极管阵列检测器、Hewlett Packard 1100系列MSD和经HP Chemstation软件控制的Sedere 75蒸发光散射检测器组 成的装置中实施。HPLC泵连接至两个洗脱液贮液器，该贮液器含有A IOmMNH4OH 的水溶液B =IOmM NH4OH 的 90 % 乙腈溶液该分析在23°C下通过将适当体积的样品(优选20 μ 1)注射至以A和B梯度洗脱 的柱上进行。使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。柱 Waters Xterra MS C-18X 3mm，直径 5μπι梯度 在6. 5分钟内以1. 5ml/分钟进行的5% -100%乙腈线性梯度
检测 210nm(从DAD模拟输出)ELS (从ELS模拟输出)MS 离子化模式 API-ES。扫描 lOO-lOOOamu，步长为 0. IamuMALDI-MS 所述肽的分子量使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-MS)测定，并 记录在Microflex (Bruker)上。使用基质α -氰基-4-羟基肉桂酸。分析型HPLC条件(方法I)用0. 1 % TFA/H20 平衡柱子(Xterra TM MS C18，5 μ m，4，6x150mm 柱，P7N 1860 00490)，并在 25 分钟内以 0% CH3CN/0. 1 % TFA/H20-60% CH3CN/0. 1 % TFA/H20 的梯度洗脱，之后在5分钟内以60% -100%的梯度洗脱。在本发明的实施例中，命名和结构图解释如下对天然氨基酸使用单字母符号，例如H为L-组氨酸，A为L-丙氨酸等。还可以对 氨基酸使用三字母缩写，例如His为L-组氨酸，Ala为L-丙氨酸等。对于非天然氨基酸， 使用三字母缩写，例如Aib为氨基异丁酸。氨基酸的位置可以氨基酸符号之后的上标数字 表示，例如Lys37，或者为Lys37。N-末端氨基可以用符号NH2或H表示。C-末端羧基可以 用符号-OH或-COOH表示。C-末端酰胺基以符号-NH2表示。亚结构 均是指His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe。赖氨酸的ε氨基可以希腊字母“ ε ”或拼写“印silon”描述。在以下实施例中的结构在几种情况下为用于天然氨基酸的单字母符号和用于氨 基异丁酸的三字母缩写Aib的组合。在几种情况下，某些氨基酸以扩展的完整结构显示。因 此，已被衍生化的赖氨酸可以显示为实施例1中的扩展的完整结构，其中在37位的赖氨酸 是扩展的。在36位的精氨酸和37位的扩展的赖氨酸之间的氮(带有指示的H)因此是实 施例1中连接两个氨基酸的肽键的氮。按照以上方法，制备以下的衍生物，作为本发明的非限制性实施例实施例1Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I (7-37)酰胺 制备方法AHPLC 方法 B6 RT = 35，49 分钟LCMS :m/z = 1096，2 (M+3H)3+理论分子量=4380，0实施例2Ν-ε 37{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37)酰胺
—Η—Hn^Le gtftsdvssyleeqaaref I AWLVRG R-口 H3C^CH3制备方法Β所述肽以66 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。
理论分子量=4409. 1实施例3Ν-ε 37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-羧基十七酰基)哌啶 _4_ 基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-I- (7-37)酰胺 制备方法AHPLC (方法 B)RT =11. 92 分钟LCMS :m/z = 1474. 8 (M+3H)3+理论分子量=4420. 0实施例4Ν-ε 30{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys30] GLP-I-(7-37) 制备方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制备，使用 8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基团用六氟异丙醇去保护。终产 物通过分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I RT = 27，6 分钟MALDI-MS :4367，9实施例5Ν-ε 31{2-[2-(2-{2-[2-((S)_3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶-4-羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22， Arg26, Lys31] GLP-I-(7-37) 制备方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制备，使用 8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基团用六氟异丙醇去保护。终产 物通过分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I RT = 28，4 分钟MALDI-MS :4252，5实施例6N-ε 31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[1-(19-羧基-十九酰基)哌 啶-4-羰基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基) [Aib8, Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-I-(7-37) 制备方法B
所述肽以66 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4280. 9 实施例7 N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以67 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4451. 1实施例8N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B 所述肽以68 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4422. 1实施例9N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制备方法B所述肽以69 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4423. 1实施例10N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基-十九酰氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制备方法B所述肽以68 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4481. 1实施例11N-ε 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8, Lys20, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以62 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4638. 3实施例12N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8, Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以69 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4624. 3实施例13N-ε 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基 _4_(⑶_4_ 羧基-4-{12-[4-(16_(1Η-四 唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基} 丁酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基圯87，611122^印26^印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以65 %乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4595. 3实施例14[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37] GLP-I-(7-37) Lys [2-(2-{2-[4-羧 基-4-(4-羧基-4-{4-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]丁酰基 氨基}丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基] 制备方法所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制备，硫代酰胺接头的连接 以两步实现。首先使用DIC和H0At/H0Bt(l 1)使4-氨磺酰基丁酸偶联树脂。然后，将 与羰基二咪唑的NMP溶液混合的16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸加入树脂，随后加入DBU。 要不然为实施例章节开始时描述的相同方案。理论分子量=4640. 2实施例15N- ε 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37) 酰胺 制备方法路径IIIHPLC (方法 Al)RT = 40. 88 分钟LCMS :m/z =异质但对应于起始物质+平均2000理论(M+H)+=5519实施例16N- ε 37 (3_ ((2_ (2_ (2_ (2_ (2_十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 氧基))丙酰基)[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP_l (7-37)-酰胺 制备方法路径IIIHPLC (方法 B6)RT = 42. 3 分钟LCMS :m/z = 1353. 3 (M+3H)3+理论(M+H)+4055.7实施例17Ν-ε 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26，611130^印34， Lys37] (GLP-l-(7-37)酰胺 制备方法AHPLC (方法 B6)RT = 36. 1 分钟LCMS :m/z = 1419. 0 (M+3H)3+理论(M+H)+= 4254. 8实施例18N- ε 37- {2_ (2_ (2_ (2_ [2_ (2_ (4_ (十六酰基氨基)_4_羧基丁酰基氨基)乙氧基) 乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122^印26^印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺 制备方法AHPLC (方法 B6)RT = 36. 06 分钟LCMS :m/z = 1399 (M+3H)3+理论(M+H)+= 4196. 8实施例19Ν-ε 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙 酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I (7-37)酰胺 制备方法AHPLC (方法 B6)RT = 40. 1 分钟LCMS :m/z = 1414. 6 (M+3H)3+理论(M+H)+= 4240. 9实施例20N- ε 36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Arg26，Glu30，Lys36] GLP-I-(7-37) Glu-酰 胺 制备方法B所述肽以68%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4069. 6[1041]实施例21N-ε 37-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以64%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=3994. 6实施例22N- ε 37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37) 制备方法B所述肽以67%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4283. 9实施例23N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基 _4-(17_ 羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-I-(7-37) 制备方法方法A，只是所述肽在Advanced Chemtech的Apex396上制备，使用 8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和H0At/H0Bt(l 1)，Mtt基团用六氟异丙醇去保护。终产物通过分析型HPLC和MALDI-MS表征。HPLC 方法 I:RT = 27，2 分钟MALDI-MS 4127, 9实施例24N- ε 20- (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [2_ ((S) _4_ 羧基 _4_ 十六酰基氨基-丁酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙酰基)[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30， Pro37] GLP-I-(7-37)酰胺 制备方法B所述肽以66%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4239. 8实施例25N- ε 37-(2-{2-[2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(19-羧 基_十九酰氨基)丁酰基氨基]丁酰基氨基} 丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[去 氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) ο 制备方法B所述肽以65%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4397. O实施例26N-ε 37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-叔 丁 基-2H-四 唑-5-基)-十六酰基氨磺酰基]丁酰基氨基}十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基]-4-羧 基丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}[去氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37] GLP-I (7-37) 制备方法B所述肽以74%乙腈洗脱。结构通过MALDI-MS证实。理论分子量=4652. 4实施例27N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-I-(7-37). 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 02_Β6_1 RT = 34. 27 分钟LCMS :m/z = 1072 (M+4H)4+理论分子量=4284. 9实施例28N- α 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, ε -Lys37]GLP-I-(7-37)肽 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 10. 19 分钟LCMS :m/z = 1072 (M+4H)4+理论分子量=4284. 9实施例29N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 9. 96 分钟LCMS :m/z = 1064 (M+4H)4+理论分子量=4255. 8实施例30N- ε 36- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [⑶ _4_ 羧基 _4_ (15-羧基-十五酰基氨基)-丁酰 基氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰氨基]“乙氧基}“乙氧基)“乙酰基][去氨基His7， Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-I- (7-37) -Glu-Lys 肽 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 6. 40 分钟LCMS :m/z = 1111 (M+4H)4+理论分子量=4444. O实施例31[去氨基 His7，Glu22，Arg26，Glu30，Arg34]GLP-I-(7-37)-Glu-Lys (2-(2-{2-[2-(2- {2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙 酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基)肽 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 I_BDSB2 RT = 6. 52 分钟LCMS :m/z = 1119 (M+4H)4+理论分子量=4472实施例32N- ε 37- [2_ (2_ {2_ [2_ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基 _4_ ({反式 _4_ [ (19-羧基十九酰基氨 基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧 基)乙酰基][Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-I-(7-37) 制备类似于SPPS方法B。HPLC 方法 02_B6_1 RT = 33. 58 分钟[1129]LCMS :m/z = 1114 (M+4H)4+理论分子量=4451.1实施例33N- ε 37- [2~ (2_ {2_ [2~ (2_ {2_ [ (S) _4_ 羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)_ 丁酰 基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基]_[Aib8，Glu22， Arg26, Arg34, Aib35, Lys37]GLP-I-(7-37) 制备类似于SPPS方法B。UPLC 方法 04_A3_1 RT = 9.81 分钟LCMS :m/z = 1079 (M+4H)4+理论分子量=4312. 9实施例34N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37] GLP-I-(7-37) 制备方法所述肽通过SPPS方法C制备，终产物通过分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B4-4) :RT = 7，9 分钟HPLC(中性，16 分钟内 30-60% ) :RT = 5，6 分钟MALDI-MS 4395理论分子量=4397实施例35Ν-ε 31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4_ 羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-仏让8，611122，￥￡1125^印26， Lys31, Arg34, Arg35, Arg37)] GLP-I (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41] 制备方法所述肽通过SPPS方法C制备，终产物通过分析型HPLC和LC-MS表征。HPLC (02-B4-4) :RT = 7，36 分钟HPLC(中性):RT = 17，5 分钟MALDI-MS 5022理论分子量=5021，8实施例36N- ε 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26， Lys31, Lys35, Lys36]GLP-l-(7_36)酰胺 制备方法所述肽通过SPPS方法C制备，终产物通过分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B4-2) :RT = 8，4 分钟HPLC (04-A3-1) :RT = 7，8 分钟MALDI-MS 4141理论分子量=4140，8实施例37 N-ε 31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨 基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}_Ν-β34-(2-(双-羧基甲基 氨基)乙酰基)[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-I (7-34)酰胺制备方法所述肽通过SPPS方法C制备，终产物通过分析型HPLC和MALDI-MS表 征。HPLC (02-B6-1) :RT = 36，7 分钟HPLC (A4-A3-1) :RT = 8，9 分钟[1169]MALDI-MS 4015, 9理论分子量=4015，5实施例38^￡-37-[(5)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17_羧基十七酰基氨基)乙氧 基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁酰基][Aib8，Glu22，Arg26，34， Lys37]GLP-I(7-37) 制备类似于SPPS方法B。UPLC 方法 04_A3_1 RT=IO. 26 分钟LCMS :m/z = 1071. 7 (M+4H)4+理论分子量=4284. 9生物学发现GLP-I衍生物在静脉内或皮下给药后的延长情况使用下文描述的方法，监测本发明的多种GLP-I衍生物在皮下给予健康猪后在血 浆中的浓度，来测定它们的延长效果。为了比较，还跟踪GLP-I (7-37)在皮下给予后在血浆 中的浓度。可以以相同方式测定本发明的其它GLP-I衍生物的延长情况。实施例39 在小种猪中的药代动力学测试在小种猪中对本发明的多种GLP-I衍生物(实施例1、4、5、7、8、9、13和22的化合 物)进行药代动力学测试。为比较目的将利拉鲁肽纳入测试中。还包括第二种比较性化合 物，即具有取代(22E+26R)的GLP-I衍生物，其描述于WO 2005/027978的实施例63。一般来说，将测试物质溶解在适于皮下或静脉内给药的溶媒中。调节浓度，使得给 药体积为约lml。在本研究中，皮下给予测试物质。研究在12 只雄性Gdttingen小种猪(EllegaardGSttingenMinipigsApS)中进行。 在动物进入研究前容许约10天的适应期。在适应期开始时，小种猪约5月龄，体重8-10kg。研究在合适的动物房中进行，室温设为21_23°C，相对湿度彡50%。房间照明循环 为12小时光照和12小时黑暗。光照为06:00至18:00。使动物生活在以草为垫的围栏中， 每栏共六只。在研究过程中，动物可以自由获取家用品质的饮用水，但是在给药前一天约16 时开始禁食，直至给药后约12小时。在动物到达时和给药日称重。动物接受一次皮下注射。皮下注射在颈右侧进行，距离耳朵大约5-7cm，距离颈中部7-9cm。给予注射，在针上带有档位，容许插入0. 5cm的针。将每种测试物注射三只动物。 每只动物接受2nmol/kg体重的剂量。每周给六只动物服药，而其余六只动物休息。由每只动物获得完整血浆浓度-时间曲线。依照如下时间表采集血样静脉内给药后(不适用于本研究) 给药前(0)、注射后0. 17(10 分钟)、0· 5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 和 120 小时。皮下给药后给药前(0)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120 小时。每次取样时，由每只动物采集2ml血液。血样由颈静脉采集。将血样收集到装有用于稳定的缓冲液的试管中，以预防GLP-I衍生物的酶促降解。立即将血浆转移到Micronic管，每只管装入约200 μ 1血浆。将血浆保存于_20°C， 直至测定。使用免疫测定法测定血浆样品的GLP-I衍生物含量。通过非房室药代动力学分析来分析血浆浓度-时间曲线。对每种情况计算下列药 代动力学参数=AUC, AUC/ 剂量、AUC% Ertrap、Cmax、tmax、λ z、t1/2、CL、CL/f、Vz、Yjf 和 MRT。所有测试的本发明GLP-I衍生物在皮下给予小种猪后具有40-100小时的半衰期 范围。比较化合物利拉鲁肽和化合物135的半衰期分别为18小时和28小时。选定的本发明衍生物在丹麦兰德瑞斯(Danish Landrace)猪中测试。GLP-I衍牛物在猪中的药代动力学测试猪(50%杜洛克猪、25%约克夏猪、25%丹麦兰德瑞斯猪、约40kg)自实验开始时 禁食。对每头猪给予在50 μ M等渗液(5mM磷酸盐，pH7. 4,0.02%Tween -20 (Merck), 45mg/ml甘露醇(无热原，NovoNordisk))中的0. 5nmol测试化合物/kg体重。由颈静脉中 的导管采集血样。将5ml血样倒入含175 μ 1如下溶液的冷玻璃杯中0. 18MEDTA、15000ΚΙΕ/ ml 抑肽酶(Novo Nordisk)和 0. 30mM 缬氨酸-吡咯烷胺(Valine-Pyrrolidide) (Novo Nordisk),pH 7.4。在30分钟内，将样品以5_6000*g离心10分钟。将温度保持于4°C。将 上清液吸取到不同的玻璃杯中，并保存于-20°C，直至使用。以夹心ELISA或通过RIA使用不同的单克隆抗体或多克隆抗体测定所述肽的血浆 浓度。抗体的选择取决于GLP-I衍生物。根据选定的具体GLP-I衍生物，达到血浆峰值浓 度的时间在宽限内变化。在96孔微量滴定板中进行夹心ELISA的通用测定方案包被缓冲液(PBS)磷酸盐缓冲盐水pH7. 2清洗缓冲液(PBS-清洗液) 磷酸盐缓冲盐水、0.05% (体积/体积) 吐温 20，pH 7. 2测定缓冲液(BSA-缓冲液) 磷酸盐缓冲盐水、10g/l牛血清白蛋白 (Fluka 05477) ,0. 05% (体积 / 体积)吐温 20，pH 7. 2链霉抗生物素蛋白缓冲液 磷酸盐缓冲盐水、0.5M NaCl、0.05% (体 积/体积)吐温20，pH 7. 2标准品血浆基质中的各种衍生物A-TNP:Nonsens 抗体AMDEX链霉抗生物素蛋白-辣根-过氧化物酶(Amersham RPN4401V)TMB-底物3，3’，5，5’四甲基联苯胺(< 0.02% )、过氧 化氢如下进行测定(体积/孔)1.)用100 μ 1溶于PBS-缓冲液的5 μ g/ml捕获抗体进行包被· 4°C温育过夜(ο/η).SxPBS-清洗 ·用最后一次清洗液封闭至少30分钟 然后将板倒空2.) 20 μ 1 样品 +100 μ 1 生物素化检测抗体(1 μ g/ml，在含 10 μ g/mlA-TNP 的 BSA 缓冲液中)·在摇床上于室温温育2小时· 5xPBS-清洗，然后将板倒空3.)在链霉抗生物素蛋白-缓冲液中的100 μ 1 AMDEX 1 8000·在摇床上于室温温育45-60分钟· 5xPBS-清洗，然后将板倒空4. ) 100 μ 1 TMB-底物·在摇床上于室温温育χ分钟 用 100 μ 1 4Μ H3PO4 终止反应读取450nm的吸光度，以620nm作为参照。由标准曲线计算样品的浓度。RIA的通用测定方案DB-缓冲液80mM磷酸盐缓冲液、0. 1 %人血清白蛋白、IOmM EDTA、0. 6mM 硫柳汞，pH 7. 5FAM-缓冲液 40mM磷酸盐缓冲液、0. 1 %人血清白蛋白、0. 6mM 硫柳汞，PH 7. 5活性炭40mM磷酸盐缓冲液、0. 6mM硫柳汞、16. 7%牛血 浆、15g/l活性炭，pH 7. 5 (使用前将悬浮液于4°C 混合至少1小时)标准品血浆基质中的各种衍生物如下在minisorp管12x75mm中进行测定(体积/管) 混合-于4°C温育30分钟-以3000rpm离心30分钟-将上清液转移到新管中后， 立即用塞子封上，并用Y _计数器计数1分钟。由各条标准曲线计算样品的浓度。GLP-I放射性受体测定(RRA)该方法是使用LEADseeker成像颗粒的放射性-配体结合测定。该测定由包含 GLP-I受体的膜碎片、未标记的GLP-I类似物、用125I标记的人GLP-I和用小麦胚芽凝集 素(WGA)包被的PS LEADseeker颗粒组成。冷的125I标记GLP-I将竞争结合受体。在加入 LEADseeker颗粒时，它们将经由WGA-残基结合膜碎片上的碳水化合物残基。125I-分子与 LEADseeker颗粒之间的接近引起颗粒发光。LEADseeker将发出的光成像，而且它与样品中 存在的GLP-I类似物的数量成反比。试剂和材料动物血浆的预处理将动物血浆于56°C热处理4小时，并以10. OOOrpm离心10分 钟。然后，加入 Val-Pyr(IOyM)和抑肽酶(aprotenin) (500KIE/mL)，并保存于<-18°C，直 至使用。GLP-I类似物校准物将GLP-I类似物掺入经过热处理的血浆，以产生范围约1 μ M 至IpM的稀释系列。GLP-IRRA 测定缓冲液:25mM Na-HEPES (pH = 7. 5)，2. 5mMCaCl2, ImM MgCl2, 50mM NaCl，0. 卵清蛋白，0. 003%吐温 20,0. 005%杆菌肽，0. 05% NaN3。GLP-I受体悬浮液由稳定表达人胰腺GLP-I受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞纯化 GLP-I受体膜碎片。保存于<-80°C，直至使用。WGA-偶联的聚苯乙烯 LEADseeker 成像珠(RPNQ0260, Amersham)将珠用 GLP-IRRA测定缓冲液重构至13. 3mg/mL的浓度。然后加入GLP-I受体膜悬浮液，并低温 (2-8 0C )温育至少1小时备用。Γ-Ι1-GLP-I (7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)保存于< _18°C，直至使用。[1247]99. 9% (体积)乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)保存于< _18°C ,直至使用。Multiscreen Solvinert 0. 45μπι 疏 7k 件 PTFE 板(MSRPN0450, Millipore Corp.)聚丙烯板(目录号650201，Greiner Bio-One)白饩聚苯乙烯384孔板(目录号781075，Greiner Bio-One)装置水平板混合仪装配标准翻斗微量滴定板转子组件的离心机UltraVap-Drydown 样品浓缩器(Porvair)LEADseeker 多模态成像系统(Amersham)测定程序样品制备将Multiscreen Solvinert滤板安装在化学相容的接收板(即聚丙烯板)上，以收集滤过液。向Multiscreen Solvinert滤板的空孔中加入150 μ L冰冷的99. 9%乙醇，随后 加入50 μ L校准物或血浆样品。将贮藏盖盖到滤板上。在水平板混合仪上于18_22°C温育15分钟。将装配好的滤板和接收板连同盖子放到标准翻斗微量滴定板转子组件中。然后以 1500rpm离心2分钟，将滤过液收集在接收板的空孔中。使用UltraVap用热(40°C)N2干燥滤过液15分钟。向每个孔中加入IOOyL GLP-IRRA测定缓冲液，使干物质重构。在水平混合仪上温育5分钟。GLP-I放射性受体测定使用以下移液流程和白色聚苯乙烯384孔板· 35 μ L GLP-IRRA 测定缓冲液·5μ 重构的滤过液· 10 μ L[125I]-GLP-I (7-36)酰胺。使用前用GLP-1RRA测定缓冲液将母液稀释至 20. OOOcpm/ 孑L ο·预包被至WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0. 2mg/孔)的15 μ L GLP-I受体 ( 0. 5 μ g/ 孔)将板密封，并于18_22°C温育过夜。使用LEADseeker 多模态成像系统检测每个孔的发光，持续10分钟。实施例40 在表达克隆的人GLP-I受体的细胞系中刺激cAMP形成如下所述测定本发明的众多GLP-I衍生物的效力，即在含人GLP-I受体的培养基 中刺激环AMP(cAMP)的形成。为了比较，还测定了两种已知的GLP-I衍生物的效力，即利拉 鲁肽的效力和化合物135的效力，化合物135是一种具有取代(22E+26R)的GLP-I衍生物， 描述于WO 2005/027978的实施例63。用所述GLP-I衍生物刺激来自表达人GLP-I受体的稳定转染细胞系 BHK467-12A(tk-tsl3)的纯化质膜，并使用 Perkin Elmer Life Sciences 的 AScreen cAMP测定试剂盒检测cAMP生产效力。稳定转染细胞系已在NN A/S，Denmark制备，并选择高表达克隆用于筛选。在DMEM,5% FCSU % Pen/Str印(青霉素/链霉素)和0. 5mg/ml选择标记G418中于5% CO2 培养细胞。用PBS(磷酸缓冲盐水)将约80%汇合的细胞清洗2次，并用Versene(乙二胺四乙 酸四钠盐的水溶液)收获细胞，以IOOOrpm离心5分钟，并除去上清液。其它步骤都在冰上 进行。将细胞沉淀在 IOml 缓冲液 l(20mM Na-HEPES, IOmM EDTA，pH = 7. 4)中用 Ultrathurax 勻浆20-30秒，以20. OOOrpm离心15分钟，并将沉淀重悬于IOml缓冲液2 (20mM Na-HEPES, 0. ImM EDTA, pH = 7. 4)中。将悬浮液勻浆20-30秒，并以20. OOOrpm离心15分钟。将悬 浮于缓冲液2、勻浆和离心重复一次，并将膜重悬浮于缓冲液2中，准备进行进一步的分析 或保存于_80°C。通过The AScreen Technology测量由所述肽诱导的cAMP产量进行功能受体测 定。The AScreen Technology的基本原理是内源cAMP与外源加入的生物素-cAMP之间的 竞争。使用缀合在受体珠上的特异性抗体实现对CAMP的捕获。以AFusion微板分析仪对 形成的cAMP进行计数和测量。使用Graph-Pad Prisme软件(第5版)计算EC5tl值。表1 :GLP_1衍牛物的效力 由表1显而易见，非常多的GLP-I衍生物比先有技术的GLP-I衍生物利拉鲁肽更 有效(EC5tl值越低越好)。所有的本发明GLP-I衍生物都远比化合物135有效。实施例41 白蛋白结合亲和力如下所述通过竞争闪烁邻近测定(SPA)检测本发明的众多GLP-I衍生物对人血清 白蛋白(HSA)的亲和力。将链霉抗生物素蛋白-SPA珠(GE Healthcare RPNQ0009)与生物素化HAS温育5 小时。所述珠用缓冲液洗涤，以除去未结合的HAS。将所述珠与在含IOOmM HepesUOOmM NaClUOmM MgS04、0. 025%吐温20的缓冲液，pH 7. 4中的125I-标记的酰化GLP-1类似物(N -ε 37- [2- (2- [2- ((S) _4_ ((S) -4-(12- [4- (16- (1Η-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰 基氨基]十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙 酰基][Aib8，125I-Tyrl9，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-I (7-37)-NH2)混合。将混合物移 取入Perkin Elmer 0ptiplate-966005290的孔中(100 μ 1/孔)，加入在相同缓冲液中的要检测的100 u 1连续稀释的GLP-1衍生物。于室温温和振摇20小时后，离心所述板，并用 TopCounter计数。结合的cpm作为GLP-1衍生物浓度的函数作图，竞争曲线的EC5(1值用作 衍生物对HSA的亲和力的量度。本发明的多种GLP-1衍生物的白蛋白结合亲和力(EC5Q，nM)示于下表2。表2泊舶齢麵力 由表2显而易见，本发明的几种GLP-1衍生物具有对应于2000nM以下的EC5(1的高 白蛋白结合亲和力(EC5Q越低，白蛋白结合亲和力越高)。实施例42 结合GLP-1受体的胞外结构域对于本发明的众多GLP-1 衍生物(实施例 1、3、4、5、6、14、15、16、17、18、19、21、22、 23和24的化合物)，如下所述检测结合孤立的N-末端的GLP-1R受体(nGLP-lR)胞外结构 域的亲和力。纳入利拉鲁肽用于比较。亲和力是所述GLP-1衍生物取代1251_毒蜥外泌肽-4 (9-39)结合nGLP_lR 的能力的量度，以下列测定检测与nGLP-lR的结合蛋白nGLP-lR如Runge等人 2007 (Biochemistry, 46卷，5830-5840页)所述制备，生物素化，并固定在包被链霉抗生物 素蛋白的SPA珠上。使用75 ii g BNHS (Sigma H1759)将在0. 1M NaHC03中的nGLPIR生物素化 至lmg蛋白。随后将生物素化的nGLPIR对PBS透析。所有的试剂和衍生物以含0. 05% (体 积 / 体积)吐温 20 的 PBS 稀释。在 96 孔 OptiPlates(PerkinElmer 6005290)中以 200 ii 1 终 体积进行结合测定。每个孔含2mg链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠(PerkinElmerRPNQ007)、 0. lpmol生物素化的nGLPlR、50pCi 125I-毒蜥外泌肽(9-39)和终浓度在lOOOnM-O. 064nM 范围内的测试肽。将所述板于摇床上于室温温育3小时。通过以1500rpm离心10分钟沉 淀 SPA 颗粒，用 TopCount-NXT(PerkinElmer)计数所述板。以取代50%的125I-毒蜥外泌肽-4 (9-39)结合nGLP-lR的所述GLP-1衍生物的浓 度由相应的曲线读取IC5Q值。利拉鲁肽对nGLP-lR的亲和力(IC5Q)经测定为1500nM。测试的本发明GLP-1衍 生物具有在2. 0-276 (nM)范围内的亲和力，6种化合物在2. 0-10. OnM的范围内。因此，相对 于利拉鲁肽，所有的测试的本发明GLP-1衍生物都表现出对N-末端GLP-1受体的改善的结 合亲和力(IC5Q值越低，结合越好)。实施例43 在db/db小鼠中的剂量_反应研究[1294]如下所述，以肥胖的糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)在剂量_反应研究中测试众多 本发明的GLP-1衍生物(实施例1、7、8、9、11、12、13、20、22和27的化合物)。按照Novo Nordisk的标准动物福利法规圈养50只10_12周龄的db/db小鼠 (Taconic, Denmark)，这些小鼠自由获取标准词料(例如 Altromin 1324，Brogaarden, Gentofte, Denmark)和自来水，并保持于24°C。在适应环境1周后，评价基础血糖2次。基 于平均血糖值，选择42只小鼠进行进一步的实验，并分配为具有匹配血糖水平的7组(n = 6)。小鼠在3-6天长度的实验中使用至多4次，此后使它们安乐死。7组接受如下的治疗1:溶媒，皮下给予2 :GLP-1 衍生物，0. 3nmol/kg，皮下给予3 :GLP-1 衍生物，lnmol/kg，皮下给予4 :GLP-1 衍生物，3nmol/kg，皮下给予5 :GLP-1 衍生物，10nmol/kg，皮下给予6 :GLP-1 衍生物，30nmol/kg,皮下给予7 :GLP-1 衍生物，100nmol/kg，皮下给予溶媒50mM磷酸盐，0. 05%吐温80，pH 8。将GLP-1衍生物溶解在溶媒中，例如至 0. 05,0. 17、0. 5、1. 7、5和17nmol/ml的浓度，每只称重50g的小鼠皮下给予300 yl (6ml/ kg)。在给药当天，于约上午9点给药所述化合物(0小时)。在」/2小时(上午8:30) 评价血糖，之后称重小鼠。在给药当天评价血糖几次，通常于1、3和6小时(上午10点、12 点和下午3点)。在第二天，在给药后24、48、72和96小时(即在第2、3、4、5天的上午9点)评价 血糖，之后称重。此外，在某些研究中，在给药后120小时(第6天)评价血糖和体重。在数字称上单独地称重小鼠。由清醒小鼠的尾尖毛细血管获得用于检测血糖的样品。将10iU血液收集入肝 素化毛细管中，并转移至500 ill葡萄糖缓冲液(EBI0缓冲溶液，Eppendorf, Germany)中。 使用葡萄糖氧化酶方法(葡萄糖分析仪Biosen 5040，EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Germany)检测葡萄糖浓度。最终分析之前样品于室温保持至多1小时。如果分析不得不延 迟，则样品于4°C保持最多24小时。依据以下的数学模型计算半衰期(T72)假定(1)化合物由血浆中消失为单指数的；(2)对血糖的作用(8 BG)可以标准S型剂量-反应曲线描述；(3)忽略前6个小时的吸收和分布，仅拟合葡萄糖由底部回到基线(最小值至0)；然后可以通过以下等式描述葡萄糖响应(Y)(例如SBG)Y =底部 + (顶部-底部)/ (1+ 剂量 *exp (_ln2*t/T72) /ED50)，其中变量ED50和了72如下定义ED50是产生对BG的半最大作用的剂量(nmol/kg)172为半衰期(小时)；以下为全局常量[1319]顶部(在回到基线葡萄糖后的反应)和底部(于最大葡萄糖下降时的反应)；以 下为每个数据组的常数(每个剂量)剂量(给药剂量(nmol/kg))。所有的数据组都同时拟合。所有测试化合物都具有10-30小时的半衰期(T72)。实施例44 a -螺旋含量如下所述使用圆二色性(⑶)光谱评估众多本发明的GLP-1衍生物(实施例3、4、 5、7、8、9、11、12、13、14、21、22和24的化合物)的a -螺旋(a -螺旋)结构的含量。为了 比较目的，在测试中纳入利拉鲁肽。用Jasco J-715 分光旋光仪对在 10mM Tris/C104pH 8. 0 中的 5 y M( y M，u mol)肽 记录远_UV圆二色性光谱。原始数据扣除缓冲液背景，并对基于肽键浓度的以M—icnT1为单 位的克分子椭圆率标准化，求出222nm的密度值。222nm的密度用作a _螺旋含量的检测，即信号与a-螺旋含量成比例，使 得-lM—cnT1 的值对应于 10% 的 a -螺旋结构(Venyaminov 和 Yang 1996 ^‘Determination of protein secondary structure",载于 CircularDichroism and conformational analysis of biomolecules (Fasman GD 编辑，Plenum Press NY), 69-108 页)。由光谱得出克分子椭圆率的值(A e或delta印silon)，并评价相应的a -螺旋 含量。GLP-1衍生物在200-250nm范围内的总体光谱特征分别由最低在206nm和222nm的 两条带描述。这与具有显著a-螺旋骨架的二级结构相符。5 u M浓度的利拉鲁肽于222nm的A e值低于-3. 6，对应于利拉鲁肽的a -螺旋 含量低于36%。5iiM浓度的实施例4、5、11和14的化合物于222nm的A e值在-2. 0至_3. 6的 范围内，对应于在20-36%范围内的a-螺旋含量。5iiM浓度的实施例3、7、8、9、12、13、21、22和24的化合物于222nm的A e值 在-3. 7至-6.0的范围内，对应于在37-60%范围内的a-螺旋含量。
9权利要求
一种包含修饰的GLP-1(7-37)序列的GLP-1衍生物，所述修饰的GLP-1(7-37)序列具有i)与GLP-1(7-37)(SEQ ID No1)相比总共2-12个氨基酸修饰，包括a)在等同于GLP-1(7-37)的22位的位置的Glu残基，和b)在等同于GLP-1(7-37)的26位的位置的Arg残基；和ii)在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于GLP-1(7-37)的18、20、23、30、31、34、36、37或39位的位置。
2.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物与GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含2-8个氨基酸取代。
3.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物与GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含1-3个氨基酸缺失。
4.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物与GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)相 比包含1-4个氨基酸添加。
5.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物在等同于GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)的7位或8位的位置包含非天然氨基酸。
6.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有游离的C-末端羧酸基团。
7.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(I)的序列 Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa233<39 一 Xa3<4o 一 一R式(I) (SEQ ID No 2) 其中，(Xaa7-Xaa8)为(L_组氨酸_Aib)、(去氨基-组氨酸-丙氨酸)或(去氨基-组氨 酸-Aib)；Xaa9为Glu或Glu衍生物；Xaa16 为 Val 或 Leu ；Xaa18 为 Ser、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa20 为 Leu 或 Lys ；Xaa23 为 Gin、Glu、Lys、Cys 或 Arg ；Xaa24 为 Ala 或 Asn ；Xaa25 为 Ala 或 Val ；Xaa27 为 Glu、Ala 或 Leu ；Xaa28为Phe或Phe衍生物；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Trp、Cys 或 Lys ；Xaa33 为 Val、Cys 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Cys、Glu、Asn、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36为Arg、Lys或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Cys、Lys、e -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39为Lys、Arg或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在； 并且所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。
8.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物具有下式(II)的序列 Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe—I le-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-X式(II) (SEQ ID No 3) 其中，Xaa7为L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2_氨基-组氨酸、0 -羟基-组氨酸、 高组氨酸、Na-乙酰基-组氨酸、a-氟甲基-组氨酸、a-甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨酸、 2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁基)甲 酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛 基)甲酸；Xaa18 为 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa30 为 Ala、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa31 为 Lys 或 Trp ；Xaa33 为 Val 或 Lys ；Xaa34 为 Lys、Glu、Dap 或 Arg ；Xaa35 为 Gly、Arg、Lys、Aib 或不存在；Xaa36为Arg、Lys或不存在；Xaa37 为 Gly、Aib、Lys、e -氨基-Lys、Pro、Arg 或不存在；Xaa38 为 Lys、Glu、Arg 或不存在；Xaa39为Lys、Arg或不存在；Xaa40为Arg或不存在；Xaa41为Arg或不存在；禾口R为酰胺或不存在；前提是如果Xaa37、Xaa38> Xaa39或Xaa40不存在，则其下游的氨基酸残基也不存在； 并且所述GLP-1衍生物在选自以下的位置被白蛋白结合残基衍生化或PEG化等同于 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 18、20、23、30、31、34、36、37 或 39 位的位置。
9.权利要求1的GLP-1衍生物，所述GLP-1衍生物选自以下物质N-￡37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[去氨基His7， Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l (7-37)酰胺；N-￡37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-l-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- [2_ (2_ [2_ (2- ((R) -3- [ 1- (17-羧基十七酰基)哌啶-4-基羰基氨 基]3-羧基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Phe (m-CF3) 28]GLP-1- (7-37)酰胺；N-￡30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l-(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22, Arg26, Lys30]GLP-1-(7-37)；N- e 31 {2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-羧基-3-{[l_(19-羧基十九酰基)哌啶 _4_ 羰基] 氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基[Aib8，Glu22, Arg26, Lys31]GLP-1-(7-37)；N- e 31-(2- {2- [2- (2_ {2_ [2_ (⑶-3-羧基-3- {[1_ (19-羧基-十九酰基)哌啶 _4_ 羰 基]氨基}丙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[Aib8， Glu22, Arg26, Lys31, Arg34]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][Aib8, Glu22，Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) -4-羧基-4- ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2-[⑶-4-羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基-十九酰氨基) 甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 20-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基}丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙 氧基)乙酰基][Aib8, Lys20, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基}丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙 氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-{12-[4-(16-(1H-四唑 _5_ 基) 十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二酰基氨基}丁酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙 氧基)乙酰基][去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1-(7-37)酰胺；[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-羧基 ~4~(4-羧 基-4-{4-[4-(16-lH-四唑-5-基-十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]丁酰基氨基} 丁酰 基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]；N- e 37 (聚乙二醇 2000)[去氨基 His7，Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺；N-￡ 37 (3-((2-(2-(2-(2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧 基))丙酰基)[去氨基圯87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)-酰胺；N-￡ 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙 氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基附87，611122，4印26，611130，4印34， Lys37] (GLP-1-(7-37)酰胺；N-￡ 37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙 氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基见87，611122，4印26，4印34，1^837] (GLP-l-(7-37)酰胺；N-￡ 37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨 基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[去氨基见87，611122^印26， Arg34, Lys37]GLP-1 (7-37)酰胺N-￡ 36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基) 乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8, Glu22, Arg26, Glu30, Lys36]GLP-l-(7_37)Glu-酰胺； N-e 37-[4-(16-(lH-四唑-5-基)十六酰基氨磺酰基)丁酰基][去氨基His7，Glu22， Arg26, Arg34, Lys37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~羧基-4- (19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4_(17_羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26，Lys31] GLP-1-(7-37)；N- e 20- (2- {2- [2_ (2_ {2_ [2- ((S) ~4~羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)乙氧基] 乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}_乙酰基)[Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30，Pro37] GLP-1-(7-37)酰胺；N- e 37-(2-{2-[2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九 酰氨基)丁酰基氨基]丁酰基氨基} 丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- {2- [2- (2_ {(S) ~4~ [ (S) -4-(12- {4- [16- (2-叔 丁 基-2H-四唑 _5_ 基)-十六 酰基氨磺酰基]丁酰基氨基}十二酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基]-4-羧基丁酰基氨基} 乙氧基)乙氧基]乙酰基}[去氨基见87，611122，六印26，六印34，1^837]61^-1(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨 基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- a 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰氨基]-乙氧基}_乙氧基)_乙酰基][Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, e-Lys37]GLP-l-(7-37)肽；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨 基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基][去氨基His7，Glu22， Arg26，Arg34，Lys37]GLP-l-(7-37)；N- e 36- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) -4-羧基-4- (15-羧基-十五酰基氨基)~ 丁酰基氨 基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基][去氨基His7，Glu22， Arg26, Glu30, Arg34, Lys36]GLP-1-(7-37) -Glu-Lys 肽；[去氨基 His7, Glu22, Arg26, Glu30, Arg34]GLP-1- (7-37) -Glu-Lys (2- (2- {2-[2- (2-{2- [ (S) -4-羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰 氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基)肽；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基 _4_ ({反式-4- [ (19-羧基十九酰基氨基) 甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基) 乙酰基][Aib8, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37)；N- e 37- [2- (2- {2_ [2_ (2_ {2- [ (S) ~4~ 羧基-4- (17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨 基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基]-[Aib8，Glu22，Arg26， Arg34, Aib35, Lys37]GLP-1-(7-37)；N-e31-[2-(2-{2-[2_(2_{2_[ (S) ~4~羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31， Arg34，Arg35，Arg37] GLP-1-(7-37)；N-￡31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙 氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-仏让8，611122^￡1125^印26，1^831， Arg34, Arg35, Arg37)]GLP-1 (7-37)基[Arg39, Arg40, Arg41]；N-e31-[2-(2-{2-[2_(2_{2_[ (S) ~4~羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基] 乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31， Lys35, Lys36]GLP-1-(7-36)酰胺；N-￡31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙 氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-N-0 34-(2-(双-羧基甲基氨基) 乙酰基)[Aib8, Glu22, Val25, Arg26, Lys31, Dap34]GLP-1 (7-34)酰胺；和N-e-37-[(S)-4-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙 氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)丁酰基][Aib8，Glu22，Arg26，34，Lys37] GLP-1 (7-37)。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-9中任一项的衍生物或其药学 上可接受的盐、酰胺、烷基或酯，以及药学上可接受的赋形剂。
11.权利要求1-9中任一项的衍生物或权利要求10的药物组合物，所述衍生物或药物 组合物用作药物。
12.权利要求1-9中任一项的衍生物或权利要求10的药物组合物，所述衍生物或药物 组合物用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高血压、 X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。
13.权利要求1-9中任一项的衍生物或权利要求10的药物组合物在制备用于治疗或预 防下列疾病的药物中的用途高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、肥胖、高 血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、 炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。
14.一种通过给予药物活性量的权利要求1-9中任一项的衍生物或权利要求10的药物 组合物治疗或预防下列疾病的方法高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受受损、1型糖尿病、 肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾 病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。
全文摘要
本发明涉及延长的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)衍生物及其治疗用途。本发明的GLP-1衍生物包含修饰的GLP-1(7-37)序列，其具有总共2-12个氨基酸修饰，包括Glu22和Arg26，在18、20、23、30、31、34、36、37或39位被白蛋白结合残基衍生化或PEG化。这些化合物可用于治疗或预防2型糖尿病和相关疾病。所述化合物是有效的、稳定的，具有长半衰期、结合白蛋白的高亲和力和/或结合GLP-1受体(GLP-1R)的胞外结构域的高亲和力，所有这些都与获得长效的、稳定的且有活性的并有可能每周给予1次的GLP-1衍生物的总体目标潜在相关。
文档编号C07K14/605GK101868476SQ200880106356
公开日2010年10月20日 申请日期2008年9月5日 优先权日2007年9月5日
发明者H·索格森, I·彼得森, J·刘, J·斯佩茨勒, L·沙弗, P·W·加里贝, S·伦奇, T·克鲁斯 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司