Wt1衍生的hla-dr-结合抗原肽的制作方法

专利名称：Wt1衍生的hla-dr-结合抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及WTl衍生的HLA-DRBH405-结合抗原肽。
背景技术：
已鉴定WT1基因(Wilms，肿瘤基因1)是Wilms，肿瘤即小儿肾 肿瘤致病基因之一(Ce〃 60: 509， 1990， 7V"/"re 343: 774， 1990)。 WT1基因编码转录因子WT1，该因子在诸如细胞增殖、分化、凋亡 以及组织发育等诸多进程中起重要作用及ev. C>"/. 181:151,1998)。最初WT1基因被描述为是一种肿瘤抑制基因。但是， 后续研究揭示了 WT1基因在白血病及包括肺癌和乳腺癌的多种实体 瘤中高表达，表明WT1基因更确切地发挥着促进癌症生长的致癌作 用。另外，证实了当在体外用WTl-衍生的肽刺激HLA-A*0201或 HLA-A*2402阳性的外周血单核细胞时，诱导了肽-特异性细胞毒性 T-淋巴细胞(CTLs)并杀死内源性表达WT1的白血病和实体瘤细胞。 这些结果证实WT1是癌症免疫疗法期望的靶分子(/"/. /.好e附fl^/ 76: 127， 2002)。
业已报道了特异于癌抗原的辅助性T细胞的存在对于有效诱导 CTLs是必要的(Omcw.62: 6438,2002)。
当其识别抗原呈递细胞上MHC II类分子和抗原肽复合物时，诱 导(造成增殖)并活化辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)。所活化 的辅助性T细胞产生诸如IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6和/或干扰素的细 胞因子并介导B细胞的生长、分化和成熟。该活化的辅助性T细胞 也起作用以促进诸如Tc和TD细胞的其他T细胞亚型的生长、分化 和成熟。因此，该活化的辅助性T细胞能通过促进B和T细胞的生长和活化以活化免疫系统。因此，认为在MHCII类结合抗原肽(也 称为"辅助肽")的影响下，增强辅助性T细胞功能是有用的，籍此增 加了癌症免疫疗法(癌症疫苗疗法)中癌症疫苗的功效(效力)(/. 7w歸W/^r.， 24: 195， 2001)。
就WTl-衍生肽而论，仅已知有一种抗原肽能结合MHC II类分 子亚型，即HLA-DRBl*0401(C"wcw J顏,A细附 /^. 51:271， 2002)。没有能结合不同亚型的WTl-衍生肽的报道。

发明内容
本发明的目的是提供WT1衍生的HLA-DRB"0405-结合抗原 肽，以及该肽作为癌症疫苗功效增强剂(一种用于增强癌症疫苗功效 的试剂)的应用。
本发明人已对具有结合MHC II类抗原并在癌症免疫疗法中增强 癌症疫苗功效(效力)的活性的WTI-衍生的抗原肽("辅助肽")进 行了透彻的研究。结果，本发明人首次发现了 WT1含有抗原肽部分， 其具有与许多MHC II类亚类中的HLA-DRBl+0405结合并诱导辅助 性T细胞的活性。该发现推动了新治疗方法的发展，即由该方法在 HLA-DRB11405-阳性癌症患者中诱导并增强WTl-特异性辅助性T 细胞。
近来有研究揭示了存在着非种系选择性(promiscuous)辅助肽，其 是能与多种HLA II类分子结合并诱导辅助性CD4阳性T细胞的辅助 肽CB"7/W /, Cc， 85(10)， pl527-1534 (2001); /. /扁歸/" 169， p557-565 (2002))。为阐明\￥11332-347是否为潜在的非种系选择性辅助 肽，本发明人对作为上述的HLA-DRB"0405-结合抗原肽(辅助肽)
的该\￥11332_347进行了研究。结果，所述肽被证实为非种系选择性辅
助肽，其不但与HLA-DRB1*0405分子结合，还与HLA-DRB1*1502 分子结合。因此，本发明的WT1332_347肽是一种可应用于具有 HLA-DRB1*1502和HLA-DRB1*0405患者的辅助肽。本发明人也首 次发现了能与多种MHC II类亚类之一的HLA-DRB1*1502结合， 并诱导辅助性T细胞的WT1含有的抗原肽部分。 在这些发现的基础上建立了本发明
发明内容
本发明包括如下。
(1) 一种由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序列中10-25 个连续氨基酸组成的肽，其结合HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T细 胞。
(2) 上述(l)的肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基 酸序列。
(3) 上述(2)的肽，其包含如SEQIDNO:24所示的氨基酸序列。
(4) 一种10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一 所示的氨基酸序列的第1、 4、 6和/或9位的氨基酸残基被不同氨基 酸残基所取代所得的氨基酸序列，且其结合HLA-DRB1*0405并诱导 辅助性T细胞。
(5) 上述(4)的肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基 酸序列的第1、 4、 6和/或9位的氨基酸残基被选自如下氨基酸的氨 基酸残基所取代所得的氨基酸序列
对于第l位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸和曱硫氨酸；
对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、天冬氨酸 和谷氨酸；
对于第6位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和 天冬氨酸；以及
对于第9位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。
(6) 上述(5)的肽，其包含如SEQIDNO:24所示的氨基酸序列的 第3、 6、 8和/或ll位的氨基酸残基被选自如下氨基酸的氨基酸残基 所取代所得的氨基酸序列
对于第3位，苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和 曱石危氨酸；
对于第6位，缬氨酸、异亮氨酸、曱硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸； 对于第8位，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和 天冬氨酸；以及
对于第11位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。
(7) —种由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序列中10-25 个连续氨基酸组成的肽，其结合HLA-DRB1M502并诱导辅助性T细
5胞。
(8) 上述(7)的肽，其包含如SEQ ID NOS: 46-56任一所示的氨基 酸序列。
(9) 上述(7)的肽，其包含如SEQIDNO:24所示的氨基酸序列。
(10) —种包含如上述(l)-(9)任一所述的肽和癌抗原肽的肽。
(11) 一种编码如上述(1)-(10)任一所述的肽的多核苷酸。
(12) —种包含如上述(ll)所述的多核苷酸的表达载体。
(13) —种含有如上述(12)所述的表达载体的细胞。
(14) 一种生产如上述(1)-(10)任一所述的肽的方法，其包括在该 肽能表达的条件下培养如上述(13)所述的细胞。
(15) —种特异性结合如上述(l)-(9)任一所述的肽的抗体。
(16) —种药物组合物，其包含如上述(i)-(ioyf壬一所述的肽、如
上述(12)所述的表达载体，或如上述(13)所述的细胞，以及药学上可 接受的载体。
(17) 上述(16)的药物组合物，其是一种癌症治疗与预防剂。
(18) 上述(16)的药物组合物，其是一种辅助性T细胞诱导物，且 其包含如上述(l)-(9)任一所述的肽；与如上述(l)-(9)任一所述的肽有 关的(12)所述的表达载体；或与如上述(l)-(9)任一所述的肽有关的(13) 所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
(19) 上述(16)的药物组合物，其是一种癌症疫苗功效增强剂，且 其包含如上述(l)-(9)任一所述的肽；与如上述(l)-(9)任一所述的肽有 关的(12)所述的表达载体；或与如上述(l)-(9)任一所述的肽有关的(13) 所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
(20) 上述(16)的药物组合物，其是一种癌症治疗或预防剂，且其 包含如上述(10)所述的肽；与如上述(10)所述的肽有关的(12)所述的表 达载体；或与如上述(10)所述的肽有关的(13)所述的细胞，以及药学 上可接受的载体。
(21) 如上述(1)-(10)任一所述的肽、如上述(12)所述的表达载体或 如上述(13)所述的细胞在制造癌症治疗或预防剂中的应用。
(22) —种治疗或预防癌症的方法，其包括对所需患者施用如上述 (1)-(10)任一所述的肽、如上述(12)所述的表达载体或如上述(13)所述 的细胞。(23) —种药物组合物，其是由如上述(l)-(9)任一所述的肽和一种 癌抗原肽组合而成的。
(24) 上述(23)的药物组合物，其用于治疗或预防癌症。
(25) —种用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含一种包含如上述 (1)-(9)任一所述的肽以及药学上可接受的载体的药物组合物，和一种 包含癌抗原肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
(26) 如上述(l)-(9)任一所述的肽与癌抗原肽的组合在制造癌症 治疗或预防剂中的应用。
(27) —种治疗或预防癌症的方法，其包括对所需患者施用如上述 (1)-(9)任 一 所述的肽以及癌抗原肽。
本发明提供了一种WT1衍生的HLA-DRBH405-结合抗原肽、 编码该肽的多核苷酸、包含所述肽或多核香酸的辅助性T细胞诱导物 ("辅助性T细胞诱导物，，)等等。本发明的辅助性T细胞诱导物用 作为癌症疫苗功效增强剂。本发明的癌症疫苗功效增强剂适用于许多 HLA-DRBH405-阳性患者，且特别有益于增强WT1疫苗的功效。


图l显示了 WTl-衍生的\￥11332_347肽刺激的CD4阳性T细胞(辅 助性T细胞)与各种树突细胞应答的试验结果。在该图中，"未处理 的"表示对不使用肽进行刺激的树突细胞的应答；"PHA"表示其中用 PHA取代树突细胞处理CD4阳性T细胞的试验结果。"\￥11172_186刺
激"表示对WTln;M86肽刺激的树突细胞的应答，"WTl225-243刺激"表 示对WT1225_243肽刺激的树突细胞的应答，以及"WTl33W47刺激"表 示对WTl332.347肽刺激的树突细胞的应答。纵轴表示CD4阳性T细
胞所摄入的[3H-胸苷的量(cpm)。
图2显示了 G2细胞系对WTl-衍生的>￥11332_347肽刺激的树突细
胞应答的试验结果。在该图中，"未处理的"表示使用未进行肽刺激的
树突细胞所获得的结果；以及"WTl332.347脉冲，，表示使用WT1332_347
刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示G2细胞系所摄入的卩H卜胸 苷的量(cpm)。
图3显示了 G2细胞系对表达WT1基因的B-LCL(+)细胞应答的 试验结果。在该图中，"B-LCL(-)"表示使用不表达WT1基因的
7B-LCL(-)细胞所获得的结果，"B-LCL(+)，，表示使用表达WT1基因的 B-LCL(+)细胞所获得的结果，以及"B-LCL(+) +抗-HLA-DR抗体" 表示使用抗-HLA-DR抗体处理的B-LCL(+)细胞所获得的结果。纵轴 表示G2细胞系所摄入的pH]-胸苷的量(cpm)。
图4显示了 E04.1细胞系对WTl-衍生的\￥11332_347肽刺激的树 突细胞应答的试验结果。在该图中，"-"表示使用不进行肽刺激的树 突细胞所获得的结果，以及"332"表示使用WT1332_347肽刺激的树突 细胞所获得的结果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的卩H卜胸苷的量 (cpm)。
图5显示了 E04.1细胞系对先用WTl-衍生的WTl332-347肽刺激
再用各种抗-HLA抑制性抗体处理的刺激细胞(stimulated cells)应答 的试验结果。所使用的刺激细胞是B-LCL(-)细胞，其是一种建立自 对HLA-DRB1*0405阳性的健康志愿者血液的B细胞系，如本文中以 下实施例3所示。在该图中，"-"表示使用不进行肽刺激的刺激细胞 所获得的结果，以及"332"表示使用WT1332.347肽刺激的刺激细胞所 获得的结果。此外，"332+a-I类"表示使用\￥11332_347肽和抗-111^画1 类抗体处理的刺激细胞所获得的结果，"332+a-DR"表示使用 WT1332_347肽和抗-HLA-DR抗体处理的刺激细胞所获得的结果， "332+a-DQ"表示使用WT1332_347肽和抗-HLA-DQ抗体处理的刺激细 胞所获得的结果。另外，"332+mlgG"表示使用WT1332.347肽和作为 抑制性抗体阴性对照的抗-小鼠-IgG抗体处理的刺激细胞所获得的结 果。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的pH-胸苷的量(cpm)。
图6显示了 E04.1细胞系对用WTl-衍生的\￥11332.347肽刺激的 HLA-DRBP0405-阳性或阴性PBMC应答的试验结果。在该图中，"-" 表示使用未进行肽刺激的PBMC所获得的结果，以及"332"表示使用 11332_347刺激的PBMC所获得的结果。各种供体的HLA-DRB1基 因型如下。供体 l(HLA-DRBl*0405/0803)， 供体 2(HLA-DRB1*0405/0101),供体3(HLA-DRB1*0101/1001)，以及供体 4(HLA-DRBl*1201/0802)。纵轴表示E04.1细胞系所摄入的[311-胸普 的量(cpm)。
图7显示了 E04.1细胞系对表达WT1基因的B-LCL(+)细胞应答 的试验结果。在该图中，"B-LCL(-)"表示使用不表达WT1基因的B-LCL(-)基因作为刺激细胞所获得的结果，以及"B-LCL(+)"表示使 用表达WT1基因的B-LCL(+)基因作为刺激细胞所获得的结果。纵轴 表示E04.1细胞系所摄入的[3H]-胸苷的量(cpm)。
图8显示了 E04.1细胞系对用已诱导凋亡的B-LCL(+)细胞刺激 的树突细胞应答的试验结果。在该图中，"凋亡的B-LCL(+)"表示使 用表达WT1基因并已诱导凋亡的B-LCL(+)细胞刺激的树突细胞所 获得的结果，以及"凋亡的B-LCL(-)"表示使用不表达WT1基因并已 诱导凋亡的B-LCL(-)细胞刺激的树突细胞所获得的结果。此外， "E04.1+"表示通过共培养E04.1细胞和树突细胞所获得的结果，以及 "E04.1-"表示通过不与E04.1细胞共培养所获得的结果。纵轴表示 E04.1细胞系所摄入的[3H-胸苷的量(cpm)。
图9显示了 E04.1细胞系对用WTl-衍生的\￥11332.347肽刺激的 树突细胞应答中细胞因子产生的试验结果。在该图中，"-"表示使用 未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及"332"表示使用
WTl332，347肽刺激的树突细胞所获得的结果。纵轴表示显示产生IL-4
(空白条)或IFN-y (填充条)的e04.1细胞的百分比(％)。
图10显示了通过流式细胞仪分析用抗-CD4抗体和抗-CXCR3抗 体染色的E04.1细胞系的结果。在该图中，横轴和纵轴分别表示对 CD4和CXCR3阳性的细胞。对CD4和CXCR3阳性的细胞百分比为 90.1%.。
图11显示了 WTl-衍生的\￥11332_347肽对WTl-特异性CTLs诱
导影响的试验结果。在(A) WTl235-2"肽、(B) wt1235_243肽+ WTl332-347 肽、(C) WTl235-2"肽+E04.1细胞和(D) \￥11235-243肽+ WTl332.347肽十
E04.1细胞刺激条件下，培养来自健康志愿者(HLA-A*2402/1101, DRBl*0405-0803)的PBMCs7天。然后，用流式细胞仪对一半的回 收细胞分析以获得WTl235，243-特异性CTL前体的百分比。横轴和纵
轴分别表示对CD8和WT123S_243肽/HLA-AA2402阳性细胞的百分比。 图12显示了 WTl-衍生的WTl332-347肽对WTl-特异性CTLs活
化影响的试验结果。用WTl235-243肽刺激在图ll提及的试验中另一
半的回收细胞6小时，且胞内IFN-y被染色。纵轴和横轴分别表示对 胞内IFN-y和抗-小鼠IgG抗体阳性的细胞。该图显示了用(E)
WTl235-2"肽、(F) \￥11235.243肽+ WTl332-347肽、(G) WT1235_243肽+E04.1细胞和(H) \￥11235.243肽+ \￥11332_347肽+ E04.1细胞刺激的结果
图13显示了 WTl-衍生的WTl332-347肽刺激的CD4阳性T细胞 与各种树突细胞应答的试验结果。在该图中，"-"表示使用未进行肽 刺激的树突细胞所获得的结果，"332"表示使用wt1332.347肽刺激的 树突细胞所获得的结果，"172"表示使用wt1172_186肽刺激的树突细 胞所获得的结果，以及"225"表示使用wt1225_243肽刺激的树突细胞 所获得的结果。纵轴表示cd4阳性T细胞所摄入的fH]-胸苷的量 (cpm)。符号"""和"n.s."分别表示测试组中差异是统计学显著或不显 著的。
图14显示了用WTl-衍生的\￥11332_347肽刺激CD4阳性T细胞 的T细胞反应谦(repertoire)分析的结果。用特异于TCR各种V卩链 的不同抗体染色细胞并通过流式细胞仪进行分析。在上一行图中，在
四分区域右下部分中的细胞群代表Vp3-阳性细胞。在下一行图中， 在四分区域右下部分中的细胞群代表V(320-阳性细胞。
图15显示了 E15.1细胞系或E15.2细胞系对用WTl-衍生的 WT1332-347肽刺激的自体PBMCs应答的试验结果。在该图中，"-" 表示使用未进行肽刺激的自体PBMCs所获得的结果，以及"332"表 示使用\￥11332_347肽刺激的自体PBMCs所获得的结果。纵轴表示不 同细胞系所摄入的卩H]-胸苷的量(cpm)。 A)和B)分别显示了使用 e15.1细胞系和e15.2细胞系所获得的结果。符号"**"表示测试组中 差异是统计学显著的。
图16显示了 E15.2细胞系对用WTl-衍生的WT1332-347肽刺激 的自体PBMCs应答中细胞因子产生的试验结果。在该图中，"-"表示 使用未进行肽刺激的树突细胞所获得的结果，以及"332"表示使用 11332.347肽刺激的自体PBMCs所获得的结果。纵轴表示显示产生 IL-4 (空白条)或IFN-y (填充条)的e15.2细胞的百分比(。/。)。
图17显示了 WTl-衍生的WT1332-347肽刺激的自体PBMCs浓 度和e15.2细胞系应答之间关系的试验结果。纵轴表示e15.1细胞系 所摄入的pH-胸苷的量(cpm)。横轴表示WT1332-347肽刺激的自体 PBMC的浓度。
图18显示了 E15.2细胞系对用WTl-衍生的WT1332-347肽刺激 的HLA-DRB1*1502阳性或阴性的PBMCs应答的试验结果。在该图中，"-"表示使用未进行WT1332-347肽刺激的PBMCs所获得的结果，
以及"332"表示使用该肽刺激的PBMCs所获得的结果。A)显示了使
用来自HLA-DRBlH502-阳性健康志愿者的PBMCs所获得的结果以
及B)显示了使用来自HLA-DRBlM502-阴性健康志愿者的PBMCs
所获得的结果。纵轴表示E15.2细胞系所摄入的卩H-胸苷的量(cpm)。 符号"w，和"n.s."分别表示测试组中差异是统计学显著或不显著的。
具体实施例方式
本发明提供了 一种由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序列 中10-25个连续氨基酸组成的肽，所述肽结合HLA-DRBl+0405并诱 导辅助性T细胞。本发明包括其中N-末端和/或C-末端氨基酸残基被 修饰的肽或其中特定氨基酸残基被改变的那些肽。
在下文中，"i秀导辅助性T细胞的肽(或i秀导CD4阳性T细胞的 肽)"可称为"辅助肽"。
如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序列是已知的序列，描述 于Ce〃， 60:509， 1990和NCBI数据库(登录号XPJB4418和P19544 ) 中。
本发明的肽是一种由存在于如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基 酸序列中的10-25个连续氨基酸组成的部分(partial)肽。该"10-25个 氨基酸"的定义是基于通常由10-25个氨基酸所组成的肽具有结合 MHC II类活性这一事实 (/附附nwoge/ie"'cs， 41: 178-228, 1995， 5/oc/r/附/cfl C丑/o/ /y;s/cflr JcZfl 1316， 85-101 (1996)， /附附"w0/0^y， 96， 1-9 (1999)， i^p"'&s， Vol. 19， 179-198 (1998)，细m謝編ogy，第5版， 116-117， Garland Publishing (2001))。优选的肽是那些由人WT1氨基 酸序列中13-17个连续氨基酸所组成的。
本发明的肽通过合成由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序 列中的10-25个连续氨基酸组成的肽(候选肽)，并测定所述肽是否 能与HLA-DRB1*0405结合并诱导辅助性T细胞而得到鉴定。
可根据肽化学领域中通常所用的方法进行肽的合成。这样的方法 可见于文献中,包括尸印"V/e 5"戸/te/s， Interscience， New York, 1966; 77re /VoZe/ws1, Vol.2 Academic Press Inc.， New York, 1976; P印"V/e 5"戸/A^s7s1， Maruzen， Inc., 1975;户印,"V/e-(7ose/ A7so ,oMaruzen， Inc. 1985;以及冊 JTflZ/rfl&M (Zoku)， Vol. 14， Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991。
使用描述于，例如，CViwcc J附附ww0/. /附歸wo/Z^r. 51: 271 (2002) 中的方法、描述于实施例中的方法或如下所述的方法，可以检测候选 肽是否能结合HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T细胞。
具体来说，通过从HLA-DRB1*0405阳性的人对象中分离外周血 单核细胞(PBMCs)并除去不贴壁细胞，制备树突细胞(贴壁细胞)。 分别地，通过使用菲可帕克(FicolI-Paque)进行密度梯度离心等从相同 的HLA-DRBP0405-阳性对象中制备辅助性T细胞(CD4阳性T细 胞)。
在添加了候选肽后培养上述树突细胞，并与上述辅助性T细胞进 行进一步的培养。然后回收辅助性T细胞并用候选肽刺激的树突细胞 以类似方式刺激几次。通过测定，例如，(1)辅助性T细胞的生长活 性或(2)辅助性T细胞的细胞因子产生活性，有可能评估辅助性T细 胞在应答肽刺激中是否被诱导(活化)。具体来说，生长活性(l)可通 过测定辅助性T细胞所摄入的[3H-胸苷的量得到检验。细胞因子产
辅助性T 二胞所产生的诸:^ IFN-y的细胞因4的量而得到检验。
结合MHC I类或MHC II类分子并呈递的抗原肽的氨基酸序列 遵循某一规则(结合基序)。其为与MHC I类分子结合中起重要作 用的在结合MHC I类分子的肽的两末端处的末端氨基酸残基；但是， 在结合MHC II类分子的肽的任一末端并不存在这样的氨基酸，且该 末端氨基酸并不与MHCII类分子结合。这样的肽更适合并纵向固定 于(固定在)肽结合沟槽中。在肽结合沟槽中肽的固定可通过结合构 成该肽的氨基酸的側链与肽结合沟槽并结合该肽主链与在MHC II类 分子完整的肽结合沟槽中保存良好的氨基酸的侧链以获得。肽结合沟 槽具有小或大的口袋，且取决于MHCII类分子在构成该口袋的氨基 酸残基中所具有的氨基酸多态性。
迄今为止所获得的X-射线结晶学揭示了在与这些结合口袋搭合 的最小的MHC II类-结合肽的第1、 4、 6和9位处氨基酸残基的侧 链。
通过分析常见于来自不同等位基因的MHC II类分子各自结合的
12肽中的氨基酸残基模式，可评估与肽结合沟槽的口袋结合的肽的氨基
酸基序。考虑到，因为约9个氨基酸的肽具有适合肽结合沟槽的上述 基序，该适合是以这样方式进行的，即两末端从沟槽的两位点上伸展 出，基本上不限制能与MHCII类分子结合的肽的长度。但是，在许 多情况下，通过肽酶将长肽切割为13-17个氨基酸长的肽 (/画羅淑，第5版，116-117， Garland Publishing (2001》。
就具有HLA-DRB1*0405结合活性的肽而论，在由9个氨基酸组 成的HLA(MHC)-结合域的第1、 4、 6和9位处的氨基酸预计具有如 下规贝'J性(基序)(/附腦，騰//"， 41: 178-228， 1995，倫cA/附/ca " 5/一戸c""a 1316， 85-101 (1996))。
第l位苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)、异 亮氨酸(I)、亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)
第4位缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、 天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
第6位天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、 赖氨酸(K)和天冬氨酸(D)
第9位天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)。
近来，使用MHC II类结合肽的软件^1 (^^^5/0,71/0/7 "//" 17: 1236， 2001)有可能搜索到预期与MHC II类抗原结合的肽序列。
本发明是基于首次发现WT1(SEQ ID NO: 1)含有结合 HLA-DRB1*0405 ( —种MHC II类)并诱导辅助性T细胞的抗原肽 部分。在所述WTl氨基酸序列中推定的HLA-DRBP0405-结合9氨 基酸部分的例子包括WTl衍生的9氨基酸部分，如SEQ ID NOS: 2-23 所示。因此，作为本发明肽的特定实施方案，本发明提供了一种包含 如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列，结合HLA-DRB1*0405 并诱导辅助性T细胞的肽。
在所述肽是WT1的部分肽且包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示 的氨基酸序列，结合HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T细胞的肽条件 下，并不限制上述肽的长度。如上所述的，具有结合基序的约9个氨 基酸的肽可适合于肽结合沟槽，其两端从沟槽的两侧伸展出，因此基 本上不限制能与MHCII类分子结合的肽的长度。但是，长肽通常为 肽酶所切割，且迄今为止已报道MHCII类结合肽长度约为10-25个氨基酸(/附附wrtogewC/cs， 41: 178-228, 1995，丑/oc/r/附/ca eZ丑/o/;/^sicfl j"fl 1316， 85-101 (1996)， /画,/柳，96， 1-9 (1999),尸一to， Vol. 19， 179-198 (1998)， /附附"wM/o/ogj，笫5版，116-117， Garland Publishing (2001))。考虑到这一点，本发明的肽优选由约10-25个氨 基酸组成，更优选由约13-17个氨基酸组成。
因此，包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列的本发 明的肽的优选实施方案的例子包括由10-25个氨基酸组成的(优选地， 由13-17个氨基酸组成的)WT1衍生的部分肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1*0405并诱导辅 助性T细胞的活性。
更优选的实施方案的例子包括由10-25个氨基酸组成的(优选地， 由13-17个氨基酸组成的)WTl衍生的部分肽，其包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T 细胞的活性。仍优选的实施方案的例子包括由16-25个氨基酸组成的 (优选地，由16-17个氨基酸组成的)WT1衍生的部分肽，其包含 如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1*0405 并i秀导辅助性T细胞的活性。如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列 表示WT1衍生的16氨基酸的部分肽，并包括如SEQ ID NO: 12所示 的氨基酸序列。
最优选的实施方案是由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组 成的肽。
本发明的肽可在保持活性的范围内进行适当的改变。在此使用的 氨基酸残基的"改变"指氨基酸残基的取代、缺失和/或添加(所述添 加包括在肽的N-和/或C-末端处氨基酸的添加)。氨基酸残基的取代 是优选的。当改变涉及氨基酸残基取代时，在辅助肽活性保持的条件 下，任何位置的任意数目的氨基酸残基可被取代。但是，因为结合 HLA II类分子的肽通常长约10-25个氨基酸，所以改变优选涉及1 个至几个氨基酸。
当通过取代改变氨基酸残基时，优选具有HLA-DRB1*0405结合 基序结构的9氨基酸肽的第1、 4、 6和/或9位处的氨基酸残基被取 代。
本发明有关取代的肽的具体例子包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列的第1、 4、 6和/或9 位处氨基酸残基为不同氨基酸残基所取代，且与HLA-DRB1*0405结 合并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。
优选的例子包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列的第1、 4、 6和/或9位处氨基酸残基为 选自如下氨基酸对于笫l位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸；对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮 氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第6位，天冬酰胺、丝氨 酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于第9位，天冬 氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代，且结合 HLA-DRB1*0405并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。
例如，可进行第1、 4、 6和/或9位处氨基酸残基的取代，用于 改良HLA-DRB1*0405结合活性或增强上述提及的由WT1的部分序 列组成的本发明天然型辅助肽的活性的目的。非肽第1、 4、 6和/或9 位处取代的氨基酸的部分可保持天然型序列(即，保持具有WT1的 部分序列)，或只要活性保持就可进一步改变。
更优选的实施例包括10-25个氨基酸的肽，其包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的第1、 4、 6和/或9位处氨基酸残基被选自如 下氨基酸对于第l位，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸；对于第4位，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 曱硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第6位，天冬酰胺、丝氨酸、苏 氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于第9位，天冬氨酸、 谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代，且与HLA-DRB1*0405结合 并诱导辅助性T细胞的氨基酸序列。
仍更优选的实施例包括如SEQ ID NO: 24所示的WT1衍生的16 氨基酸部分肽，其包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，的第3、 6、 8和/或ll位处氨基酸残基为选自如下氨基酸对于第3位，苯丙 氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸；对于第6位， 缬氨酸、异亮氨酸、曱硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；对于第8位，天 冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和天冬氨酸；以及对于 第11位，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基所取代的肽。 优选的例子可包括16-25个氨基酸的肽，其包含来自SEQIDNO:24的改变的氨基酸序列。
本发明也提供了一种包含本发明辅助肽(天然或改变的肽)以及 癌抗原肽的肽(所谓之表位肽)。
近来，业已报道了一种表位肽，其中癌抗原肽(也称为"CTL表 位")和辅助肽(也称为"辅助表位")相连，能有效诱导CTLs。也就 是说，辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)为具有多种活性的辅助肽 所活化，所述活性包括诱导CTLs分化和维持，以及活化诸如巨噬细 胞等的效应物，因此被认为通过癌症抗原增强了 CTL-诱导。作为其 中辅助肽和癌抗原肽相连的肽的具体例子，报道了编码由HBV-来源 的HLA-A2-限制性抗原肽(6肽)、HLA-All-限制性抗原肽(3肽) 和体内有效抗各种表位的CTLs诱导的辅助肽组成的表位肽的DNA (小基因)(/。《譜/< //扁,/柳1999， 162: 3915-3925)。实际上， 其中CTL表位(相应于黑色素瘤抗原gp100第280-288位的肿瘤抗 原肽)和辅助肽(破伤风毒素来源的T辅助表位)相连的肽已进行了 临床试验(C7,7i/ca/ C"療r及d， 2001， 7: 3012-3024)。
因此，作为特定的实施方案，本发明的肽也包括包含本发明辅助 肽和癌抗原肽的表位肽。
就癌抗原肽而言，任何已知的癌抗原肽均可使用；但是，优选使 用WT1衍生的癌抗原肽(天然或改变的肽)。具体的例子包括限制 HLA-A1、 -A0201、 -A0204、 -A0205、 -A0206、 -A0206、 -A0207、 -All、 -A24、 -A31、 -A6801、 -B7、 -B8、 -B2705、 -B37、 -Cw0401、 -Cw0602 等的WTl-衍生肽。
WTl-衍生的癌抗原肽的例子包括列于WO2000/18795表II-表 XLVI的那些及其具有作为癌抗原肽活性(结合HLA抗原和诱导 CTLs活性)的改变的肽。
WTl-衍生的癌抗原肽更具体的例子包括如下
16Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (seq id no: 27) Cys Tyr Thr Tip Asn Gin Met Asn Leu (seq id no: 28)
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(seqidno:29)
Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe(seqidno:30)
Ser Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu(seqidno:31)
Ala Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu(seqidi no:32)
Abu Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu(sbqidno:33)
Arg Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu(seqidno:34)
Lys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu(seqidn0:35)
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (seq id no: 36) Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (seq id no: 37) Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (seq id no: 38) Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (seq id no: 39) Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (sbq id no: 40) Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Lys Lys Phe (seq id no: 41) Arg Tyr Pro Ser Ala Gin Lys Lys Phe (sbq id no: 42) Arg Tyr Pro Ser Abu Gin Lys Lys Phe (sbq id no: 43) Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val (seq id no: 44) Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (seq id no: 45)
上文中，"Abu"指"a-氨基乙酸"。
其中，如SEQ ID NOS: 27和29所示的肽是HLA-A24抗原和 HLA-A2抗原结合肽，以及如SEQ ID NOS: 44和45所示的肽是 HLA-A2抗原结合肽。其他的肽是HLA-A24抗原结合肽。
优选的癌抗原肽是如SEQ ID NO: 27， 28， 29， 30， 44或45所示的 之一。
本发明表位肽更具体的例子包括包含辅助肽，即包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1*0405和诱 导辅助性T细胞活性的10-25个氨基酸的WTl-衍生的部分肽，以及 如上述SEQ ID NOS: 27-45任一所示的癌抗原肽的那些。表位肽优选包含由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列組成的 辅助肽以及如SEQ ID NOS: 27-45任一所示的癌抗原肽。
更优选地，表位肽包含由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组 成的辅助肽以及如SEQ ID NOS: 27-30， 44和45任一所示的癌抗原 肽。
表位肽可通过前述肽合成的常用方法制备。也可通过用于DNA 合成的常用方法以及基于编码其中多表位连接的表位肽的多核苷酸 的序列信息的遗传工程制备。具体来说，其中多表位连接的表位肽可 通过插入编码该肽的多核苷酸到已知表达载体中，用所产生的重组表 达载体转化宿主细胞，培养转化体，并从培养物中回收目标肽而得到 制备。这些过禾呈可依据，例如，描述于文献(A^/eci//^ C7ow/rtg， T. Maniatis等，GSH Laboratory (1983)， Z)A^ C7麵Vig， DM. Glover, IRL PRESS (1985))中的方法，或在下文中所描述的方法来进行。
所述作为辅助肽的表位肽的活性可依据前述方法得到证实。此 外，所述作为癌抗原肽的表位肽的活性可通过将该肽给予人的模型动 物得到证实，该模型动物描述于WO02/47474或/. Omcc 100， 565-570， 2002中。
本发明的表位肽被认为能用于建立更有效的癌症治疗或预防，因 为在该辅助表位肽中辅助肽部分可活化辅助性T细胞(CD4阳性T 细胞)以提供具有多种活性的活化的辅助性T细胞，所述活性包括诱 导CTLs分化和维持，以及活化诸如巨噬细胞的效应物，籍此通过癌 抗原肽进一步增强了 CTL-诱导。
可以修饰本发明上述肽(天然的、改变的或表位肽)的N-末端 氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基。其中N-末端和/或C-末端氨 基酸残基被修饰的肽落入本发明肽的范围中。
可用于N-末端氨基酸的氨基修饰的基团的例子包括选自 烷基、苯基、环烷基和酰基的l-3种基团。酰基包括C^烷酰基、苯 基取代的C^6烷酰基、<:5.7环烷基取代的羰基、Ch6烷基磺酰基、苯
基磺酰基、<:2.6烷氧羰基、苯基取代的烷氧羰基、Cw环烷氧基取代 的羰基、苯氧基羰基等等。
在C-末端氨基酸的羧基处修饰的肽的例子包括酯类和酰胺类。
酯类具体包括d-6烷基酯、苯基取代的C。-6烷基酯、C5-7环烷基酯等等。酰胺类具体包括酰胺、为1或2个d-6烷基取代的酰胺、为1或
2个苯基取代的C。-6烷基取代的酰胺，形成包含酰胺基团氮原子的5 至7元氮杂环烷的酰胺等等。
本发明也提供了一种编码上述提及的本发明肽(天然的、改变的 或表位肽)的多核苷酸。该编码本发明肽的多核苷酸可以DNA或RNA 的形式存在。基于关于本发明肽的氨基酸序列或编码其DNA的多核 普酸序列的信息，本发明的多核苷酸可容易地得到制备。具体来说， 使用DNA合成的常用方法或通过PCR扩增可进行合成。
多核苷酸的具体例子包括编码上述提及的表位肽的那些。更具体 地说，多核苷酸的例子包括编码包含辅助肽，即包含如SEQIDNOS: 2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1*0405和诱导辅助 性T细胞活性的10-25个氨基酸的WTl-衍生的部分肽，以及如上述 SEQ ID NOS: 27-45 4壬一所述的癌抗原肽的表位肽的那些。
优选的例子包括编码包含由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序 列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS: 27-45任一所述的癌抗原肽的 表位肽的多核苷酸。
更优选的例子包括编码包含由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸 序列组成的辅助肽以及如SEQ ID NOS: 27-30， 44和45 4壬一所述的癌 抗原肽的表位肽的多核苷酸。
该"编码本发明肽的多核苷酸"包括能在严禁条件下与所述多核
酸。关于"在严禁条件下i交"，k此使二用的"杂交"可依:据描述于，'例
如，Sambrook J.， Frisch E. F.， Maniatis T.编，Afo/ecw/"/* CYow/wg第 2版,Cold Spring Harbor Laboratory press,的常规方法进4亍。术语 "严禁条件"指杂交在含有6xSSC ( 10 x SSC=1.5 M NaCl， 1.5 M柠檬 酸三钠)，50。/。曱酰胺的溶液中于45°C下进行，接着在2xSSC溶液 中于50°C下洗涤(Afo/ec"/w丑/o/ogj;， John Wiley & Sons, N. Y. (1989)， 6丄1画6.3.6))等等。
可通过将上述制备的多核苷酸整合入表达载体中以构建用于表 达本发明肽的重组表达载体。
在此可用的表达载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等等。 当宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)时，载体的例子包括诸如
19pUC118， pUC119， pBR332， pCR3等的质粒载体；以及诸如XZAPII， Xgtll等的噬菌体载体。当宿主是酵母时，载体的例子包括pYES2， pYEUra3等。当宿主是昆虫细胞时，载体的例子包括pAcSGHisNT-A 等。当宿主是动物细胞时，载体的例子包括诸如pKCR， pCDM8， pGL2， pcDNA3.1， pRc/RSV， pRc/CMV等的质粒载体；以及诸如逆转录病毒 载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等的病毒载体。
表达载体可任选地含有诸如能诱导表达的启动子、编码信号序列 的基因、用于选择的标记基因、终止子等的因子。
此外，表达载体可含有容许肽与硫氧还蛋白、组氨酸(His)标签、 GST (谷胱甘肽S-转移酶)等作为融合蛋白表达以便促进分离和纯化 的附加序列。在这样的情况下可用的栽体包括含有在宿主细胞中起作 用的合适启动子(lac， tac， trc， trp， CMV， SV40早期启动子等)的GST 融合蛋白栽体，例如pGEX4T;含有Tag序列(Myc， His等)的载 体，例如pcDNA3.1/Myc-His;以及能表达硫氧还蛋白和组氨酸标签 融合蛋白的栽体，例如pET32a。
可通过用上述所获得的表达载体转化宿主细胞制备含有本发明 栽体的转化细胞。
在此可用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。 大肠杆菌的例子包括诸如HB101, C600， JM109， DH5a和AD494(DE3) 的大肠杆菌K-12菌林。酵母的例子包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。动物细胞的例子包括L929， BALB/c3T3， C127， CHO， COS, Vero和Hela细胞。昆虫细胞的例子包括sf9。
可使用适合于上述各种宿主细胞的常规方法将表达载体导入宿 主细胞中。具体来说，可使用磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法 以及4吏用用于基因转移的脂质体法(Lipofectamine 、 Lipofectin; Gibco-BRL)进行导入。在导入后，在含有选择标记物的常规培养基 中培养细胞，籍此含有表达栽体的转化体可得到选择。
本发明的肽可通过在合适的条件下(在该肽能表达的条件下)培 养转化细胞产生。所产生的肽可依据标准的生化纯化程序进行进一步 的分离和纯化。该纯化程序包括盐析、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析、凝胶过滤层析等。如上所述，当本发明的多肽已作为与硫氧 还蛋白、组氨酸标签、GST等的融合蛋白表达时，该肽可通过适当的纯化程序进行分离和纯化，该程序利用了融合蛋白或标签的特性。 本发明提供了一种特异性结合本发明肽的抗体。该本发明的抗体 不限于任何形式，可以是抗作为抗原的本发明肽的多克隆或单克隆抗 体。
如上所述，在其特异性结合本发明肽的条件下，并不限制本发明
的抗体。优选的抗体的例子包括特异性结合辅助肽，即包含如SEQ ID NOS: 2-23任一所示的氨基酸序列并具有结合HLA-DRB1*0405和诱 导辅助性T细胞活性的10-25个氨基酸的WTl-衍生的部分肽，的那 些。更优选特异性结合由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组成的 辅助肽的抗体。
制备抗体的方法在本领域众所周知，且本发明的抗体可依据任一 常规方法得至!j帝J备(C" re"/尸rCoco/s Afo/ec"/flrr丑/0/og3;编辑 Ausubel等.(1987)出版商.John Wiley & Sons. 11.12-11.13节， Antibodies; J JLa60m"1j Afawwfl/, Lane, H， D.等编，Cold Spring Harber Laboratory Press, New York 1989)。
具体来说，本发明的抗体可通过使用本发明的肽作为抗原免疫诸
如兔的非人动物，并用常规方法从该免疫的动物血清中回收抗体以获 得。就单克隆抗体来说，它们可通过用本发明的肽免疫诸如小鼠的非 人动物，将所产生的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，并从所产生 的杂交瘤细胞中回收单克隆抗体以获得(Oz/rew/ /;ro,oco/s Mo/ecw/"r fi/o/ogy编辑Ausubel等.(1987)出版商.John Wiley & Sons. 11.4-11.11节)。
当取决于宿主使用不同佐剂增强免疫应答时，抗本发明肽的抗体 也可产生。佐剂的例子包括弗氏(Freund)佐剂；诸如氢氧化铝的矿物 凝胶；诸如溶血卵磷脂、Pluronic⑧多元醇的表面活性剂、聚阴离子、 肽、油乳剂、钥孔血蓝素和二硝基苯酚；诸如BCG(Bacille de Calmette-Guerin)或棒状杆菌的人佐剂等。
如上所述，识别本发明肽的抗体和中和其活性的抗体可通过以常 规方式免疫动物而容易地得到制备。抗体可用于亲和层析、免疫诊断 方法等等。免疫诊断方法可适当地选自免疫印迹、放射免疫测定 (RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等等。该免疫诊 断方法在诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、皮肤癌、膀
21胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌等的表达WT1基因的癌 症诊断中是有效的。
本发明提供了一种药物组合物，包含本发明肽(天然的、改变的 和表位型肽)、含有本发明多核苷酸的表达栽体或含有本发明表达栽 体的细胞，以及药学上可接受载体。该药物组合物可有效地用作为辅 助性T细胞的诱导物或癌症疫苗功效的增强剂，如下所详述。
(1) 一种包含作为有效成分的本发明肽的辅助性T细胞诱导物 (癌症疫苗功效的增强剂)
本发明的肽具有诱导辅助性T细胞的活性，且诱导的辅助性T 细胞又能增强CTL-诱导的活性，其通过诱导CTLs的分化和维持并 活化诸如巨噬细胞的效应物而作用于癌症疫苗。因此，本发明提供了 一种包含作为有效成分的本发明的肽的癌症疫苗功效的增强剂(作为 用于增强癌症疫苗功效试剂的药物组合物)。当本发明的增强剂给予 HLA-DRB"0405-阳性和WTl-阳性的患者时，该肽被呈递至抗原呈 递细胞的HLA-DRB1*0405抗原；诱导并活化识别该肽与 HLA-DRB1*0405抗原复合物的特异性辅助性T细胞(CD4阳性T 细胞)；该活化的辅助性T细胞可发挥涉及诱导CTLs分化和维持并 活化诸如巨噬细胞的效应物的活性。在该方式中，作为癌症疫苗效应 的活化并诱导的CTLs的活性得到增强。
本发明的癌症疫苗功效增强剂可用于预防或治疗伴有升高的 WT1基因表达水平的癌症，例如，诸如白血病、脊髓发育异常综合 征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的血癌，以及诸如胃癌、结肠癌、肺 癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、 宫颈癌和卵巢癌的实体癌。
本发明的癌症疫苗功效增强剂可在癌症疫苗给予前或给予后同 时给予。
该包含作为有效成分得本发明的肽的癌症疫苗功效增强剂可含 有作为有效成分的辅助肽或表位肽，其中所述肽与癌抗原肽(CTL 表位)连接。如上所述，近来已显示表位肽中癌抗原肽(CTL表位) 和辅助肽(辅助表位)能有效地诱导CTLs。当给予该形式的表位肽 时，所述肽插入抗原呈递细胞中；在胞内降解所产生的抗原肽中，辅 助肽与MHC 1I类抗原(HLA-DRBP0405)结合，而癌抗原肽与MHC I类抗原结合；因此所形成的相应的复合物以高密度呈递至抗原呈递细 胞表面。当辅助性T细胞识别HLA-DRB1*0405抗原和辅助肽复合物 时，CTL-诱导的活性，即癌症疫苗的效应，作为诱导CTLs分化和 维持及活化诸如巨噬细胞的效应物结果得到进一步增强。另一方面， 当CTLs识别癌抗原肽和MHCI类抗原的复合物时，CTLs增殖并破 坏癌细胞。因此，包含作为有效成分的本发明表位肽的本发明的药物 组合物本身可用作为癌症疫苗，以及癌症疫苗功效的增强剂。
该包含作为有效成分的本发明的肽的癌症疫苗功效增强剂可与 药学上可接受的载体，例如，合适的佐剂， 一起给予，或以颗粒的形 式使得细胞免疫性能有效地建立。关于佐剂，那些描述于文献(C7/ai. M/ctoWo/. Z ev.， 7:277-289， 1994)等中的是可用的。具体的例子包括微 生物来源的成分、细胞因子、植物来源的成分、海洋生物来源的成分、 诸如氢氧化铝的矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂和Pluronic⑧多元醇的表 面活性剂、聚阴离子、肽、油乳剂(乳剂制剂)等等。也包括脂质体 制剂、其中成分结合至具有几微米直径的珠子上的微粒制剂、其中成 分附于脂质的制剂等.
可进行例如，皮内、皮下、肌内或静脉内给药。虽然在制剂中本 发明肽的剂量可取决于，例如所要治疗的疾病、患者的年龄和体重进 行适当调节，其通常在0.0001 mg-1000 mg范围内，优选0.001 mg-1000 mg,更优选0.1 mg-10 mg,优选每几天至每几月给予一次。
本发明也提供一种包含本发明肽与癌抗原肽组合的药物组合物。 依据本发明的组合应用，作为癌症疫苗的癌抗原肽效应(即诱导并活 化CTLs活性)为本发明的肽所增强，且能更有效地进行癌症的治疗 和预防。
术语"組合"包括两种形式，即本发明的肽和癌抗原肽以混合形式 或分离形式给予。
可使用先前制备的含有作为混合物的肽的制剂，或在使用前将先 前制备的分别包含相应肽的制剂组合以进行混合形式的肽的给予。
在肽以分离形式给予的情况下，该分离制剂可以时间间隔依次给 予，或同时给予。当以时间间隔进行给药时，本发明的肽(癌症疫苗 功效增强剂)和癌抗原肽(癌症疫苗)可依该顺序给予或以相反的顺 序给予。本发明的肽和癌抗原肽的组合的例子包括试剂盒。
就可与本发明的肽组合使用的癌抗原肽而言，任何通常所知的癌
抗原肽都可以使用，例子包括WTl-衍生的癌抗原肽(天然型、改变 型)。具体的例子包括如SEQ ID NOS: 27-45任一所示的癌抗原肽， 优选为SEQ ID NOS: 27-30， 44和45任一所示的癌抗原肽.
(2)包含作为有效成分的本发明的表达载体的辅助性T细胞诱导
物(癌症疫苗功效的增强剂)
含有编码本发明的肽，类似于上述本发明的肽的多核苷酸的表达 载体，具有诱导辅助性T细胞的活性，并可用作为本发明癌症疫苗功 效增强剂的有效成分。因此，本发明提供了一种包含含有编码本发明 的肽的多核苷酸的表达载体作为有效成分的癌症疫苗功效增强剂(即 作为增强癌症疫苗功效试剂的药物组合物)。
近来，已显示编码其中癌抗原肽(CTL表位)和辅助肽(辅助 表位)相连的表位肽的多核苷酸具有体内有效诱导CTLs的活性。例 如，报道了编码其中HBV-来源的HLA-A2-限制性抗原肽(6肽)、 HLA-All-限制性抗原肽(3肽)和辅助肽连接的表位肽的DNA (小 基因)体内诱导有效针对各种表位的CTLs(/owr/ifl/ 1999， 162: 3915-3925)。
因此，癌症疫苗功效增强剂的有效成分可通过将编码上述本发明 的表位肽的多核苷酸整合入合适的表达载体中而获得。
当给予含有作为癌症疫苗功效增强剂有效成分的本发明的多核 苷酸的表达栽体时，如下方法可以使用。
就用于将含有本发明多核苷酸的表达载体导入细胞中的方法而 言，包括那些利用病毒载体的任何方法或其他方法都可以使用 (纖&/-&/騰《，1994年4月，p20-45; (^tow-y"A:"/7， 36(1)， p23-48 (1994); J7Me"-/gflA:"-Z0A^"， 12(15)， 1994，以及其中所引证的文献)。
利用病毒载体方法的例子包括其中将本发明DNA整合入诸如逆 转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱渗病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊 髓灰质炎病毒或辛德毕斯(Sindbis)病毒的DNA或RNA病毒，然后导 入细胞中的那些。尤其是，利用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或 牛痘病毒等等的方法是特别优选的。
其他方法的例子包括其中表达载体直接肌内注射(DNA接种)、
24脂质体法、脂转染(Lipofectin)法、微注射、磷酸钙法以及电穿孔。 DNA接种和脂质体法是特别优选的。
至于在实践中将本发明表达载体作为药物应用的方法，存在着其
某些离体细胞中，然后将细胞再导入体内的先体外后体内方法 (層A:"-5Wc, 1994年4月，20-45; GeA:to-;F"A:"乂/, 36(1)， 23-48 (1994); /ZA7^"-/gflA:"-Z0A:""， 12(15)， 1994，以及其中所引证的文献)。 体内方法是更优选的。
就体内方法而言，取决于所要治疗的疾病和症状，可通过任何合 适的途径完成给药。例如，可通过静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌 内途径等给药。当通过体内方法进行给药时，组合物可以各种形式进 行给药，例如溶液，特别是配制的，例如，以含有作为有效成分的本 发明的表达载体的注射液形式，如果需要的话，也可添加常规载体。 至于含有本发明的表达载体的脂质体或膜融合的脂质体(例如仙台病
毒(HVJ)-脂质体)，它们可以诸如悬液、冷冻药物、离心浓缩的冷冻 药物等的脂质体制剂形式存在。
尽管取决于，例如，所要治疗的疾病、患者的年龄和体重，制剂 中表达载体的含量可进行适当调节，但通常0.0001 mg-100mg，优选 0.001 mg-10 mg的本发明的表达载体可每几天至每几月给予一次。
当上述本发明的表达载体给予HLA-DRBH405-阳性和WTl-阳 性患者时，本发明的肽呈递至抗原呈递细胞的HLA-DRB1*0405抗 原；诱导并活化了识别该肽和HLA-DRB1*0405抗原复合物的特异性 辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)；该活化的辅助性T细胞可发挥 涉及诱导CTLs分化和维持并活化诸如巨噬细胞的效应物的活性。在 该方式中，作为癌症疫苗效应的诱导CTLs的活性得到增强。包含作 为有效成分的含有本发明多核苷酸的表达载体的癌症疫苗功效增强 剂可用于预防或治疗伴有升高的WT1基因表达水平的癌症，例如， 诸如白血病、脊髓发育异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的血 癌，以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤 癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌的实体癌。
在上述给予含有编码表位肽的多核普酸的表达载体情况下，抗原 呈递细胞整合了该表达栽体并通过胞内降解产生抗原肽，其中辅助肽
25和癌抗原肽分别与MHC II类抗原(HLA-DRB11405)和MHC I类抗 原结合，形成复合物。所形成的复合物以高密度呈递至抗原呈递细胞 表面。当辅助性T细胞识别HLA-DRB"0405抗原和辅助肽复合物时， CTL-诱导活性，即癌症疫苗效应，通过诱导CTLs分化和维持及活 化诸如巨噬细胞的效应物而得到进一步增强。另一方面，当CTLs识 别癌抗原肽和MHCI类抗原复合物时，CTLs增殖并破坏癌细胞。因 此，包含作为有效成分的含有编码本发明表位肽的多核苷酸的表达载 体的本发明药物组合物本身可用作为癌症疫苗，以及癌症疫苗功效的 增强剂。
本发明也提供了 一种由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序 列中10-25个连续氨基酸組成的肽，所述肽结合HLA-DRB*1502并 诱导辅助性T细胞。本发明包含其中氨基酸残基的N-末端和/或C-末端被修饰的结合HLA-DRB1*1502的抗原肽或其中个别氨基酸残 基被改变的那些。
可以类似于上述结合HLA-DRB1*0405的本发明抗原肽的方法合 成结合HLA-DRB1*1502的抗原肽并测定其活性。
本发明的HLA-DRBl"502-结合抗原肽是一种由如SEQ ID NO: 1所示的人WT1氨基酸序列中10-25个连续氨基酸组成的部分肽。优 选的肽是那些由人WT1氨基酸序列中13-17个连续氨基酸组成的。
本发明是基于发现人WT1含有具有结合HLA-DRB1*1502并诱 导辅助性T细胞活性的抗原肽部分的。使用用于预测MHC II类结合 肽的软件(Propred， B/o/rt/b/TMflZ/cs 17: 1236， 2001)进行可能与 HLA-DRB1*1502结合的9氨基酸部分(能适合于MHC II类分子肽 结合沟槽的9氨基酸部分)的搜索。所鉴定的WT1的9氨基酸部分 的例子示于SEQ ID NOS: 46-56中。因此，本发明的HLA-DRB1*1502 结合抗原肽的具体例子包括包含如SEQ ID NOS: 46-56任一所示的 氨基酸序列，结合HLA-DRB1*1502并诱导辅助性T细胞的肽。
所述的肽优选由约10-25个氨基酸组成，更优选由约13-17个氨 基酸组成。更优选的实施方案的例子包括WT1衍生的由10-25个氨 基酸(优选由13-17个氨基酸)组成的部分肽，其包含如SEQ ID NO: 50所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1*1502和i秀导辅助性T 细胞的活性。仍更优选的实施方案的例子包括WT1衍生的由16-25个氨基酸(优选由16-17个氨基酸)组成的部分肽，其包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，且具有结合HLA-DRB1M502和诱导辅 助性T细胞的活性。如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列表示WT1 衍生的16氨基酸的部分肽，并包括如SEQ ID NO: 50所示的氨基酸 序列。
更优选的实施方案是由如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列组
成的\￥11332_347肽。
所述WT1332.347肽是一种非种系选择性辅助肽，其不但与 HLA-DRB1*0405分子结合，还与HLA-DRB1*1502分子结合。因此， \￥11332.347是一种可应用于具有HLA-DRB1*0405患者以及同样具有 HLA-DRB1*1502患者的辅助肽，因此从患者广泛应用范围的，见点来 看是有用的。
本发明HLA-DRB"1502-结合抗原肽相关的表位肽、多核苷酸、 抗体和药物组合物可以类似于上述本发明HLA-DRB"0405-结合抗 原肽的方法制备及使用。
实施例
本发明通过如下实施例进一步举例说明，但不应解释为本发明受 限于此。
实施例1
1. 制备树突细胞
通过密度梯度离心使用菲可帕克(Ficoll-Paque)从 HLA-DRB1*0405-阳性健康志愿者血液中分离外周血单核细胞 (PBMCs)。将所得到的8xl()6个PBMCs悬浮在含1% AB血清的2 ml X-VIVO 15TM培养基(Camblex)中，接种在6孔培养平板中，培养2 小时。培养后，除去不贴壁细胞，用Hanks溶液洗涤贴壁细胞。在 含1% AB血清、1000 U/ml IL國4和1000 U/ml GM國CSF的X画VIVO 15TM培养基中培养贴壁细胞。在培养的第2和4天，将一半的培养 基置换为新鲜培养基。在第6天，添加TNF-a使其终浓度为100 U/ml。 在第7天存活的细胞用作为试验用树突细胞。
2. 制备CD4阳性T细胞(辅助性T细胞) 如上述(l)中所述，使用获得自同一健康志愿者的血液。用RPMI
培养基将血液稀释2倍。将约100 ml稀释的血液添加到用于分离CD4
27阳性T细胞的抗体混合物(cocktail)， RosetteSepTM(Stemcell)t ，并将 混合物在室温下静置20分钟。然后，通过密度梯度离心使用菲可帕 克(Ficoll-Paque)收集CD4阳性T细胞。
3.诱导WT1肽特异性CD4阳性T细胞
使用预测程序(Propred， 5/w7i/o/7iifl"cs 17: 1236， 2001)在WT1蛋 白的氨基酸序列(NCBI数据库，登录号P19544， XP—034418， SEQ IDNO:l)中搜索可能结合HLA-DRBH405的肽。选择并合成了3 种肽。这些肽具有与那些存在于WT1如下位置处的氨基酸序列相同 的氨基酸序列
第172-186位PNHSFKHEDPMGQQG (WT1172 186， SEQ ID NO:
25);
第225 243位NLYQMTSQLECMTWNQMNL (WT1225 243， SEQ ID NO: 26);以及
第332-347位KRYFKLSHLQMHSRKH (WT1332 347， SEQ ID NO: 24)。
以3X105细胞/孔将上述(l)中制备的树突细胞接种在24孔培养平 板中，并添加SEQ ID NO: 24的肽至50 fig/ml。在培养4小时后，通 过X-射线照射(25GyM吏细胞生长停止。以3义106细胞/孔将上述(2)中 制备的CD4阳性细胞添加到每个孔中，并与树突细胞共培养。至于 培养基，使用含1% AB血清的X-VIVO 15TM培养基。在培养开始后， 每2天用新鲜培养基置换一半的培养基并添加IL-2至20 U/ml。在从 培养开始的第7和14天，收集T细胞并以3乂106细胞/孔接种在24 孔培养平板中，另外再向孔中添加已用20 ng/ml肽(SEQ ID NO: 24) 刺激并经受X-射线照射(25Gy)的3xl()S树突细胞。接着共培养细胞。 至于培养基，使用含1% AB血清和20 U/ml IL-2的X-VIVO 15顶培 养基。
在第3次刺激后，回收T细胞并以3xl04细胞/孔接种在96孔平 板中。以3xl04细胞/孔添加已用20 pg/ml肽(SEQ ID NO: 24)刺激并 经受X-射线照射(25Gy)的树突细胞，接着进行共培养。作为阴性对 照組，T细胞与未用肽进行刺激的树突细胞共培养，作为阳性对照组， 添加0.2% PHA取代树突细胞。在培养80小时后，添加pH卜胸苷 (37kBq/孔)，细胞再培养16小时。然后，使用p-闪烁计数器测量掺入细胞中的["H-胸苷。结果示于图l中。当与用WTl332.347刺激的
树突细胞共培养时，用WT1第332-347位的肽(WTl332.347， SEQ ID NO: 24)刺激的CD4阳性T细胞显示了增殖应答。但是，当与未用肽进行 刺激的树突细胞共培养时，或与用具有不同于SEQ ID NO: 24的SEQ ID NO: 25或26的氨基酸序列的肽刺激的树突细胞共培养时，CD4 阳性T细胞并不显示增殖应答。这些结果表明WT1332_347肽(SEQ ID NO: 24)作为抗原肽i秀导了特异性CD4阳性T细胞。 实施例2
建立特异于WTl肽的CD4阳性T细胞系
将以类似于实施例l的方法制备的树突细胞以104细胞/孔接种在 96孔平板中，然后以103细胞/孔接种为WT1332_347肽(SEQ ID NO: 24) 所诱导的CD4阳性T细胞。至于培养基，使用含1% AB血清、20 U/ml IL-2和5 ng/ml PHA的X-VIVO 15TM培养基。通过连续培养建立CD國4 阳性T细胞系并命名为"G2细胞系"。通过类似于权利要求1的方法 测定G2细胞系对用肽刺激的树突细胞的应答。结果示于图2中。当
与用WTl332.347肽刺激的树突细胞共培养时，G2细胞系显示了增殖
应答，当与未进行肽刺激的树突细胞共培养时，则不显示增殖应答。 这些结果表明G2细胞系是一种特异于\￥11332-347肽的CD4阳性
T细胞系。 实施例3
WT1肽抗原呈递至HLA-DR分子
以类似于实施例1的方法，通过密度梯度离心使用菲可帕克 (Ficoll-Paque)从HLA-DRB1 *0405-阳性健康志愿者血液中分离外周 血单核细胞(PBMCs)。然后，以107细胞/孔将PBMCs接种在24孔平 板中。至于培养基，使用含10% FCS和55 nM 2ME的RPMI1640 培养基。添加含EB病毒(EBV)的培养基后，再连续培养4周以建立 用EBV转化的B-细胞系，该细胞系命名为"B-LCL(-)细胞"。EBV制 备自B95-8(JCRB Cell Bank No. 9123)的培养物上清液中，该B95画8 是一种产生EBV的细胞系。将B-LCL(-)细胞调节到3xl(T细胞/mL， 并向其中添加含表达WT1基因病毒的培养基，接着添加聚丙烯(终 浓度，8 ng/mL)，并以1 ml/孔添加该混合物至24孔平板中。培养 16小时后，添加1 ml新鲜培养基到每个孔中，并继续进行培养。每个孔中添加G418 (新霉素)至0.7 ng/mL,当导入基因的细胞被选择 时，培养平板5-7天。将所选择的表达WT1的B-细胞系命名为 "B-LCL(+)细胞"。依据89:1405， 1997中描述的方法，通过 RT-PCR技术测定B-LCL(-)和B-LCL(+)细胞表达的WT1基因的量。 该测量结果通过将作为阳性对照的K562细胞系的表达量假定为1进 行转换。所得到的B-LCL(-)细胞的值为1.6xl(T4，而B-LCL(+)细胞 的值为3.2,表明WT1基因是高表达的。以类似于实施例2的方法研 究G2细胞对B-LCL(+)细胞的应答。在测试组中，在与G2细胞混合 前，用抗HLA-DR抗体处理B-LCL(+)细胞以确认HLA-DR-限制性。 结果示于图3中。其揭示了当与表达内源性WT1基因的B-LCL(+) 细胞共培养时，对肽阳性的CD4阳性T细胞系G2显示了增殖应答，
且所述应答为抗-HLA-DR抗体所抑制。这些结果表明WTl332.347肽是
WT1蛋白胞内产生的，且作为抗原内源性呈递至HLA-DR分子。 实施例4
建立特异于WTU".;u7肽的CD4阳性T细胞系E04.1 除了在第6天添加的TNF-a终浓度为200 IU/ml夕卜，以类似于实 施例l的方法使用分离自HLA-DRB"0405-阳性健康志愿者的血液制 备树突细胞。使用获得自用于制备树突细胞的同一健康志愿者的血液 制备CD4阳性T细胞。依据用于CD4阳性T细胞分离的RosetteSep (StemCell)的说明书分离CD4阳性T细胞。
以类似于实施例1的方法，将上述树突细胞和CD4阳性T细胞 用于诱导特异于WT1肽(SEQ ID NO: 24， WT1332_347)W CD4阳性T
细胞。通过有限稀释技术连续培养所产生的特异于\￥11332-347肽的
CD4阳性T细胞以建立CD4阳性T细胞系E04.1。作为在该有限稀 释结束中的饲养细胞，以类似于实施例1的方法制备并通过X-射线 照射处理的PBMCs以lxl()S细胞/孔进行接种。至于培养基，使用含 20 IU/ml IL-2和5 pg/ml PHA的X画VIVO 15T"培养基。
除了在添加[311卜胸苷后培养持续进行18小时外，通过类似于实
施例1的方法测定E04.1细胞系对用\￥11332.347肽刺激的树突细胞的 应答。结果示于图4中。当与用\￥11332_347肽刺激的树突细胞共培养
时，E04.1细胞显示增殖应答，而与未用该肽刺激的树突细胞共培养 时，则不显示增殖应答。这些结果表明E04.1细胞是一种特异于WTl332.347肽的CD4阳性T细胞系。
实施例5
WTUn47肽与HLA-DR的特异性结合
将实施例4中建立的E04.1细胞以lxl(^细胞/孔接种在96孔培 养平板中。建立自实施例3中HLA-DRBH405-阳性健康志愿者血液 的B细胞系B-LCL(-)细胞用20 |ig/ml浓度的WTl332-347肽刺激，并 通过X-射线照射处理，以3乂104细胞/孔接种在96孔平板中，并与 E04，1细胞共培养。作为阴性对照組，将不用肽刺激的B-LCL(-)细胞 与E04.1细胞共培养。
作为测试组，用20 pg/ml的抗-HLA-DR抗体(G46.6， BD ParMingen)、 抗-HLA-I类抗体(G46-2.6， BD ParMingen)或抗 國HLA-DQ抗体(SPVL3， Immunotech)处理已用WT1332_347肽刺激并经 受X-射线照射的B-LCL(-)细胞30分钟，并与E04.1细胞共培养以确 认HLA-DR限制性。作为抗体处理的阴性对照组，抗-小鼠IgG抗体 处理的细胞以类似的方式与E04.1细胞共培养。
共培养后，以类似于实施例4的方法测定E04.1细胞的生长。结 果示于图5中。当与用\￥11332_347肽刺激的B-LCL(-)细胞共培养时， E04.1细胞显示了增殖应答。但是，当用抗-HLA-DR抗体处理 11332.347肽刺激的B-LCL(-)细胞时，细胞生长被抑制了。此外，对 于用其他抗体处理的\￥11332.347肽刺激的B-LCL(-)细胞，E04.1细胞 显示了增殖应答，但是对不用肽刺激的B-LCL(-)细胞则不显示增殖 应答。这些结果表明WT1332_347肽特异性结合HLA分子中的 HLA-DR,并诱导特异于\￥11332.347肽的CD4阳性E04.1细胞系的生 长。
实施例6
WTlm-:u7肽与HLA-DRB1*0405的特异性结合 以类似于实施例4的方法从HLA-DRB1 *0405-阳性或阴性健康志 愿者血液中制备PBMCs。然后，PBMCs用20 pg/ml的\￥11332_347肽 刺激并经受X-射线照射，以3xl0"细胞/孔接种在96孔平板中。然后， 以lxl(^细胞/孔将E04.1细胞接种到该96孔平板中，共培养细胞。 作为阴性对照组，将不用肽刺激的PBMCs与E04.1细胞共培养。
共培养后，以类似于实施例4的方法测定E04.1细胞的生长。结
31果示于图 6 中。供体 l(HLA-DRBl*0405/0803)和供体 2(HLA-DRBlA0405/0101)是HLA-DRB11405-阳性的，与分离自每个 供体的PBMCs共培养、并用\￥11332_347肽刺激的E04.1细胞显示了 增殖应答。另一方面，供体3(HLA-DRB"0101/1001)和供体 4(HLA-DRBin201/0802)是HLA-DRBP0405-阴性的，与分离自每个 供体的PBMCs共培养并用\￥11332-347肽刺激的E04.1细胞并不显示 增殖应答。此外，在所有的情况下，当使用不用肽刺激的PBMCs时， 没有观察到增殖应答。上述结果表明WTl332-347肽与显示多态性的 HLA-DRB1分子中的HLA-DRB1*0405特异性结合，并诱导 WTl33W47特异性CD4阳性细胞系E04.1的生长。 实施例7
WTl^j^^肽抗原呈递至HLA-DRB1*0405
如实施例3所述，建立自HLA-DRBH405-阳性健康志愿者血液 的B-LCL(-)细胞(B-细胞系)和B-LCL(+)细胞(表达WT1的B-细 胞系)，分别经受X-射线照射并以3xl(^细胞/孔接种至在96孔平板 中。E04.1细胞以lxlO"细胞/孔接种并共培养。然后以类似于实施例 4的方法测定E04.1细胞的生长应答。结果示于图7中。当与表达 WT1的B-LCL(+)细胞共培养时，E04.1细胞显示了增殖应答，但与 不表达WT1的B-LCL(-)细胞共培养时，则不显示增殖应答。
接着，已诱导凋亡的B-LCL(-)或B-LCL(+)细胞(分别为lx105 细胞)与以类似于实施例4的方法制备自HLA-DRBP0405-阳性健康 志愿者血液的树突细胞(3xl(^细胞)共培养16小时，接种在96孔 平板的孔中，并与E04.1细胞(lxl(^细胞)共培养。然后，以类似 于实施例1的方法测定E04.1细胞的生长应答。结果示于图8中。当 与用凋亡诱导的B-LCL(+)细胞刺激的树突细胞共培养时，E04.1细胞 显示了增殖应答，但与用凋亡诱导的B-LCL(-)细胞刺激的树突细胞 共培养时，则不显示增殖应答。这些结果表明\￥11332-347肽首先是通 过B-LCL(+)细胞中降解的WT1蛋白产生的，接着呈递至 HLA-DRB1*0405并诱导E04.1细胞的增殖。
通过渗压休克进行B-LCL(-)和B-LCL(+)细胞的凋亡的诱导。即， 将lx106细胞悬浮在500 pl的高渗培养基(含0.5 M蔗糖、10% w/v聚 乙二醇1000和10 mM HEPES， pH 7.2的RPMI培养基)中，并在
3237°C下静置10分钟。然后在调节到37°C前，用低渗培养基(60% RPMI， 40%水)稀释该培养物30倍，并在37°c下静置2-3分钟。 通过在室温下离心5分钟收集细胞并用作为凋亡诱导细胞。通过用于 死亡细胞染色的荧光染料(碘化丙锭，和膜联蛋白v,即磷脂酰丝氨 酸-结合试剂)来确证凋亡的诱导。 实施例8
用WTli"，;u7肽活化E04.1细胞
以类似于实施例4的方法用WT1332_347肽刺激制备来自 HLA-DRB"0405-阳性健康志愿者血液的树突细胞，与E04.1细胞混 合，培养24小时。作为阴性对照组，将不用肽刺激的树突细胞与e04.1 细胞混合。培养24小时后，添加终浓度为10 pg/ml的布雷菲德菌素 (Brefeldin)A以抑制E04.1细胞的胞外分泌。此外，在又培养6小时 后回收CD4阳性T细胞，并用含2%曱醛的PBC固定，用含0.1%皂 角甙的渗透性溶液处理以增加抗体的细胞膜渗透性。然后，通过用 PE-标记的抗IFN-y抗体(BD， PharMingen)和FITC-标记的抗-IL-4抗 体(BD， PharMingen)对所处理的细胞进行胞内染色，并使用流式细胞 仪进行分析。结果示于图9中。揭示了 E04.1细胞，当与用WT1332.347 肽刺激的树突细胞共培养时，强烈诱导产生了 Th-l型细胞因子 IFN-y,但没有产生Th-2型细胞因子IL-4。
通过用抗-CD4抗体和抗-CXCR3抗体染色未经刺激的E04.1细 胞，并通过流式细胞仪进行分析。结果示于图10中。揭示了超过卯％ 的E04.1细胞是Th-l型CD4阳性T细胞，且为对CD4和CXCR3 阳性。已知CXCR3是一种在Th-l型免疫细胞上高表达的趋化因子 受体。
上述结果表明WTl332-347肽活化WTl332-347特异性CD4阳性细胞
系e04.1细胞，并诱导细胞产生Th-l型细胞因子IFN-y。这些结果表 明WTl33W47肽活化并^吏cd4阳性T细胞分4匕为Th-l型。 实施例9
通过WTlmw7肽增强WTl-特异性CTLs的i秀导和活化 以类似于实施例4的方法使用用于建立e04.1细胞的同一健康志 愿者(HLA-aa2402/1101， DrbP0405.0803)血液制备PBMCs，并以 3xl04细胞/孔接种在24孔培养平板中。以如下方式向孔中添加
33WT1235_243肽(SEQ ID NO: 27)和E04.1细胞，并在37"C下培养平板7 天，即WT1235 243肽(20 ng/ml); WT1235_243肽(20 ng/ml)+WTl332.347 肽(20 ng/ml); WT1235 243肽(20 jig/ml)+E04.1细胞(1.5xl06细胞/孔); 或WT1235.243肽(20 ng/ml)+WTl332.347肽(20 jig/ml)+E04.1细胞 (1.5xl()6细胞/孔)。至于培养基，使用含10% AB血清的X陽VIVO 15^培养基。在此使用的\￥11235_243肽是一种具有诱导HLA-A*2402-限制性CTLs活性的癌抗原肽(W02004/024175)。
培养7天后，回收细胞并用抗-CD8抗体(BD PharMingen)和 WT1235.243肽/HLA-A+2402特异性PE-标记的四聚物染色一半的细胞， 通过流式细胞仪进行分析。结果示于图ll(A-D)中。业已报道了用 WT1235.243肽刺激PBMCs产生了对CD8和WT1235_243肽/HLA-A头2402 阳性的WT1235.243肽特异性CTL前体的i秀导(Omcer /ww"m / /附附MWO/Z^r， 51， p614-620 (2002))。当用WTl235-2"肽单独刺激PBMCs 时，WTl235-243肽特异性CTL前体的百分比是0.12% (图ll-A)。
当用WT1,43肽加WTl332-347肽进行刺激时，WT1235.243肽特异性
CTL前体的百分比增加到0.69% (图11-B)。当用\￥11235_243肽加 E04.1细胞进行刺激时，\￥11235-243肽特异性CTL前体的百分比进一
步增加到4.51%(图ll-C)。当用WTl235-243肽加WTl332-347肽加E04.1
细胞进行刺激时，WT1235.243肽特异性CTL前体的百分比又增加到 7.12% (图ll陽D)。
将另 一半回收的细胞(3xl05细胞)与用WT1235.243肽刺激并经受 X-射线照射(30 Gy)的树突细胞培养6小时。在培养开始1小时后， 添加布雷菲德菌素A以抑制细胞的胞外分泌。培养再持续5小时， 并用抗-CD8抗体和WTl235-243肽/HLA-A头2402-特异性PE-标记的四 聚物对细胞染色。固定细胞并用渗透性溶液处理以增加细胞膜渗透 性，以类似于实施例8的方法用PE-标记的抗IFN-y抗体进行胞内染 色。作为阴性对照组，用APC-标记的抗-小鼠IgG抗体(BD PharMingen)染色细胞，且对IFN-y和小鼠IgG都是阳性的细胞群作 为非特异性染色被排除。
结果示于图12(A-D)中。当用WTl235—243肽刺激WT1 235-243 肽特异
性CTL前体6小时时，诱导了并对CD8、 WT123S.243肽/HLA-A+2402 阳性和IFN-y阳性的、特异于活化的WT1235_243肽的CTLs。当用WTl235-2"肽单独刺激时，特异于活化的\￥11235.243肽的CTLs的百分 比为17.0% (图12-A)。当用WTl235-243肽加WTl332-347肽刺激时，
特异于活化的\￥11235_243肽的(:11^的百分比增加到23.3%(图12-B )。
当用WTl235-243肽加E04.1细胞刺激时，特异于活化的WTl235-243肽
的CTLs的百分比增加到25.7% (图12-C)。当用WTl235-243肽加
WTl332.347肽加E04.1细胞刺激时，特异于活化的\￥11235_243肽的CTLs
的百分比增加到39。 0% (图12-D)。
从上述结果中，揭示了 WT1332_347肽是一种增强WT1特异性CTL 前体诱导和活化的辅助肽。也揭示了 E04.1细胞是一种增强WT1特 异性CTLs活化的辅助性T细胞，其辅助功能通过\￥11332_347肽得到 增加，并增强了 WTl特异性CTLs活化。
实施例10
WT1 ,".,47肽非种系选择性特性的研究
研究WT1332_347肽是否也能与据说许多日本人具有的 HLA-DRB1*1502分子结合，以及作为非种系选择性辅助肽对 WTl332-347特异性CD4阳性T细胞的i秀导。
l.实验方法
1) 制备树突细胞(DC)
外周血单核细胞(PBMCs)分离自健康志愿者 (HLA-DRB1"502/1403)的外周血中，并以lx107细胞/孔接种在使用 1% AB-型血清(Nabi， Miami， FL)和X-VIVO 15TM培养基(Cambrex) 的6孔塑料平板中，培养2小时。在除去不贴壁细胞后，在含1000 IU/ml IL-4(PeproTech)、 1000 IU/ml GM-CSF(PeproTech)、 1% AB 型血清和X-VIVO 15TM的培养基中培养剩下的贴壁细胞，在第2和4 天，更换培养基并添加IL-4和GM-CSF，在第6天，添加TNF-a至 100 IU/ml以4吏树突细胞成熟。
2) 诱导\￥11332-347特异性CD4阳性T细胞
使用用于分离CD4阳性T细胞的RosetteSep(StemCell)自同 一志 愿者的血液分离CD4阳性T细胞。将所获得的CD4阳性T细胞以 3xl06细胞/孔接种在24孔平板中，并用经WT1332.347肽(20將/ml)刺 激并经受放射线照射(25Gy)的自体树突细胞(3xl()S细胞)进行刺激。 刺激的第2天，添加IL-2至20 IU/ml。以类似的方法，用经WTl332-347肽(20 jig/ml)刺激的树突细胞每隔一周刺激经刺激的CD4阳性T细胞 一次。此外，在第二次刺激后使用含IL-2培养基每隔一天更换培养 基一次。在该实验中，所诱导的CD4阳性T细胞总共经过3次刺激。
3) 生长测定
通过pH卜胸苷掺入法进行生长测定。将肽刺激诱导的CD4阳性 T细胞(3xl()4细胞；效应物)与用选自WT1332_347、 WT1172_186和 评11225.243肽的肽刺激并经受放射线照射的PBMCs ( lxl()5细胞；"刺 激物")在96孔平板中共培养。作为阴性对照，使用不用肽刺激的 DC(-)。 80小时共培养后，以37kBq/孔添加[3H-胸苷(Amersham Biosciences),该平板温育又16小时并用P闪烁计数器测定。度量单 位是"计数/分钟(cpm)"，每次测定重复进行三次。
4) 通过流式细胞仪分析细胞因子产生
以生长测定相同的方法，将CD4阳性T细胞与刺激物共培养2 小时，并向其中添加布雷菲德菌素A。 4小时后，回收细胞，进行固 定和渗透处理，用FITC-标记的抗-IL-4抗体(BD Pharmingen)和PE-标记的抗-IFN-Y抗体(BD Pharmingen)染色，通过流式细胞仪进行分 析。
5) ELISA测定
通过放射线照射(25Gy)用或不用WTl332-347肽刺激的PBMCs (6xl()5细胞)，每组细胞与WTl332-347诱导的CD4阳性T细胞(6x10s 细胞)共培养。72小时培养后，回收上清液，将300 jil溶液用于IL-4 和IFN國y观'J定。
6) TCR反应谱测定
使用 TCR V P反应镨试剂盒(BECKMAN COULTER)、 FACsort(BECTON DICKINSON)对WT1332 347肽诱导的CD4阳性T 细胞的T-细胞受体(TCR)P链的反应语进行分析。
2.实验结果
分离自健康志愿者(HLA-DRB1"502/1403)血液的CD4阳性T细 胞用经\￥11332.347肽刺激的自体树突细胞总共刺激3次。通过分别使
用WT1172.186、 \￥11225.243和WTl332.347肽的生长测定，研究所诱导的
CD4阳性T细胞对该肽的特异性。结果，\￥11332.347肽诸导的CD4
阳性T细胞在缺少该肽或在用\￥11172-186或WTl225-243刺激的条件下无法增殖，但当用WTl33W47刺激时，增殖达约IO倍之多(图13)。 根据这些结果，诱导的CD4阳性T细胞对WTl332.347具有特异性。
WTl332-347肽诱导的CD4阳性T细胞进行TCR反应谱测定。结 果示于图14中。具有VP3的细胞和具有VP20的那些占优势，分 别占总数的10%。
这些占优势的CD4阳性T细胞通过分选分离，具有VP3的细胞 系命名为E15.1亚系，而具有VP20的命名为E15.2亚系。在这两种
细胞系中，E15.2亚系显示了对WTl332.347肽更高的应答(图15)。
然后，用\￥11332.347肽刺激E15.2亚系，通过胞内染色法测定所
分泌的IL-4和IFN-y。结果，揭示了 IFN-y(Th-l型细胞因子)而非 IL-4(Th-2型细胞因子)在所述细胞系产生的细胞因子中占优势(图 16)。也揭示了 E15.2亚系的WT1332_347特异性增殖应答取决于 WTl332.347的浓度(图17)。这些结果表明E15.2亚系是一种特异于 WT1332.347的Th-l型CD4阳性T细胞系。
如上所述，有可能从对HLA-DRB1*1502分子阳性，但对 HLA-DRB1*0405分子阴性的健康志愿者来源的CD4阳性T细胞谦 导特异于WTl332.347的Th-l型CD4阳性T细胞系。基于这些结果， 认为所述的CD4阳性T细胞参与细胞免疫性并可通过分泌细胞因子 活化CTLs。因此，通过组合使用\￥11332_347和能活化CTLs的HLA画I 类限制性WT1肽(癌抗原肽)，显示了抗肿瘤效应可进一步得到增 强。
用WT1332.347肽刺激来自HLA-DRB1*1502阳性健康志愿者 (1502/0901)或HLA-DRB1*1502阴性健康志愿者(1302/0803)的 PBMCs以获得刺激物。将刺激物分别与E15.2亚系共培养，并通过 生长测定分析对WT1332_347特异性的增殖。结果示于图18中。在 HLA-DRBl"502-阳性的健康志愿者中，观察到WT1332.347特异性增 殖，但在HLA-DRB"1502-阴性的健康志愿者中，没有观察到增殖(图 18 )。 这表明 E15.2亚系的 WT1332.347特异性增殖限于 HLA-DRB1*1502。
如上所述，使用特异于\￥11332_347肽的Th-l型CD4阳性T细胞 系的E15.2亚系进行分析，表明\￥11332_347是一种非种系选择性辅助
肽，其不但与HLA-DRB1*0405分子结合，还与HLA-DRB1*1502分子结合，这些分子在日本人中出现频率分别为第一和第三。
工业实用性
本发明提供了 一种WT1衍生的HLA-DRB1*0405结合性抗原肽， 编码所述肽的多核苷酸，包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导 物等等。本发明的辅助性T细胞诱导物用作为癌症疫苗功效的增强 剂。本发明的癌症疫苗功效增强剂可适用于许多HLA-DRB1*0405阳 性的癌症患者，尤其用作为WT1疫苗功效增强剂。序列表
<110〉 Haruo, Sugiyama 〈120> WT1衍生的HLA-DR结合抗原肽 <130>
<140〉 2003-375603 〈141〉 2003-11-05
<160〉 56
〈170〉 Patentln Ver. 2. 1
〈210〉 1
<211〉 449
〈212〉 PRT
〈213〉智人(Homo sapiens)
〈400〉 1
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu 1 5
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys 20
Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
35 40
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro 50 55
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie 65 70
Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys 85
Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala 100
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala 115 120
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 10 15
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 25 30
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 45
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 60
Lys Gin Glu Pro Ser T卬Gly Gly 75 80
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 90 95
Gly Ala Cys八rg Tyr Gly Pro Phe 105 110
Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Glu Ser Gin Pro Ala lie 130 135 140
Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220
Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ma Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335
Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350
Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
40355 360 365
Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin 370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430
Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445
Leu
<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列
〈220>
〈223〉人工序列描述合成肽 <400> 2
Leu Val Arg His His Asn Met His Gin 1 5
<210〉 3 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
<223〉人工序列描述合成肽
<400〉 3
Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu1 5
〈210〉 4 <211> 9 <212> PRT 〈213〉人工序列
<220>
〈223〉人工序列描述合成肽 <400> 4
Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin 1 5
<210〉 5
〈211〉 9
〈212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉
<223>人工序列描述合成肽 〈400〉 5
Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser 1 5
<210〉 6 <211〉 9 <212〉 PRT <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列描述合成肽
<400> 6
Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu 1 5
<210> 7 <211> 9 <212> PRT<213〉人工序列 〈220>
<223>人工序列描述合成肽
<400〉 7
Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp 1 5
<210> 8 <211〉 9 <212> PRT 〈213〉人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 8
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn 1 5
<210〉 9 〈211> 9 〈212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽
〈400〉 9
Phe lie Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly 1 5
<210〉 10 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽〈400〉 10
Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu 1 5
<210〉 11
<211〉 9
<212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
〈223>人工序列描述合成肽 <400〉 11
Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His 1 5
<210> 12 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列
〈220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400〉 12
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met 1 5
〈210〉 13 <211〉 9 <212〉 PR丁 〈213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 13
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin Met 1 5
44〈210〉 14 <211> 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
〈223>人工序列描述合成肽 <400〉 14
Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg 1 5
<210〉 15
〈211〉 9
<212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 15
Leu Leu Pro Ala VaJ Pro Ser Leu Gly 1 5
<210〉 16 <211〉 9 <212> PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉人工序列描述合成肽
〈400〉 16
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser 1 5
〈210〉 17
<211〉 9
<212> PRT <213>人工序列
45<220>
<223〉人工序列描述合成肽 〈400〉 17
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly 1 5
〈210〉 18 <211〉 9 <212> PRT <213>人工序列
<220>
〈223〉人工序列描述合成肽
<400〉 18
Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu 1 5
〈210〉 19 〈211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽
<400〉 19
Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly 1 5
〈210〉 20 <211> 9 〈212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽
<400> 20
46Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 1 5
<210〉 21 <211> 9 <212> PRT <213〉人工序列
<220>
<223〉人工序列描述合成肽
〈400〉 21
Phe Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala 1 5
〈210> 22 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉
<223>人工序列描述合成肽
<400〉 22
Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn 1 5
<210〉 23 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽
<400> 23
Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys 1 5
<210〉 24 <211〉 16〈212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 24
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His 15 10 15
<210〉 25
〈211〉 15
<212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 25
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly 15 10 15
〈210〉 26 <211> 19 <212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400> 26
Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 15 10 15
Met Asn Leu
<210〉 27 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 列<220〉
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 27
Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5
<210〉 28
<211〉 9
<212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉人工序列描述合成肽 〈400〉 28
Cys Tyr Thr T卬Asn Gin Met Asn Leu 1 5
<210> 29
<211〉 9
<212> PRT
<213〉人工序列 -
〈220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400> 29
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5
〈210〉 30 〈211> 9 〈212> PRT <213>人工序列
〈220〉
<223>人工序列描述合成肽<400〉 30
Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe 1 5
〈210〉 31 <211〉 9 <212> PRT 〈213〉人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400〉 31
Ser Tyr Thr Trp Asn GLn Met八sn Leu 1 5
<210〉 32 〈211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400〉 32
Ala Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5
〈210〉 33
<211> 9
<212> PRT <213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽
<223〉 Xaa at 1 position stands for Abu.
<400〉 33
Xaa Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5
50〈210〉 34 〈211> 9 〈212〉 PRT <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列描述合成肽 <400> 34
Arg Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5
<210〉 35 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
<223〉人工序列描述合成肽 <400> 35
Lys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5
〈210〉 36
<211〉 9
<212> PRT 〈213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 36
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5
<210> 37 <2H〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 37
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5
〈210〉 38 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <40。> 38
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5
<210> 39 <211> 9 〈212〉 PRT <213>人工序列
〈220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 39
Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5
〈210〉 40 〈211〉 9 〈212> PRT <213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽
<■〉 40Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5
〈210〉 41
<211〉 9
<212〉 PRT <213〉人丁.序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 41
Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Lys Lys Phe 1 5
<210〉 42
<211> 9
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400> 42
Arg Tyr Pro Ser Ala Gin Lys Lys Phe 1 5
<210〉 43 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人丄序列
<220〉
<223〉人工序列描述合成肽
<223〉 Xaa at 5 position stands for Abu.
<400〉 43
Arg Tyr Pro Ser Xaa Gin Lys Lys Phe 1 5
<210〉 44<211〉 9 <212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400〉 44
Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 1 5
<210〉 45 <211> 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉人工序列描述合成肽 <400〉 45
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5
<210〉 46 <211> 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 46
Tyr Arg lie His Thr His Gly Val Phe 1 5
<210〉 47 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成肽
54〈400〉 47
Leu Val Arg His His Asn Met His Gin 1 5
〈210〉 48
<211〉 9
<212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽
<400〉 48
Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys 1 5
〈210〉 49
<211> 9
〈212〉 PRT <213〉人l:序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽 〈400〉 49
Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5
<210> 50 〈211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉人工序列描述合成肽 〈400> 50
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met 1 5
<210〉 51 <211> 9<212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成肽 <400> 51
Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr Cys 1 5
<210〉 52 〈211〉 9 <212> PRT 〈213〉人工序列
<220>
〈223〉人T.序列描述合成肽 <400> 52
Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr 1 5 <210〉 53
<211〉 9
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列描述合成肽 <400〉 53
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr 1 5
〈210〉 54 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
〈223>人工序列描述合成肽 <400> 54
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro<210> 55 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
〈223〉人工序列描述合成肽 <400〉 55
Val Arg His His Asn Met His Gin Arg 1 5
〈210〉 56 〈211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
〈223>人-f:序列描述合成肽 <400〉 56
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser 1 权利要求
1.一种肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO24所示。
2. 权利要求1的肽，其与HLA-DRB1*1502结合并诱导辅助性T 细胞。
3. —致多核苷酸，其编码权利要求1所述的肽。
4. 一种含有权利要求3所述的多核苷酸的表达载体。
5. —种含有权利要求4所述的表达栽体的细胞。
6. —种生产权利要求1所述的肽的方法，其包括在该肽能表达 的条件下培养权利要求5所述的细胞。
7. —种特异性结合权利要求1所述的肽的抗体。
8. —种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽，以及药学上 可接受的栽体。
9. 权利要求1所述的肽在制备药物组合物中的用途，所述药物 组合物用于治疗或预防癌症。
10. 权利要求1所述的肽在制备药物组合物中的用途，所述药物 组合物为辅助性T细胞诱导剂。
11. 权利要求1所述的肽在制备药物组合物中的用途，所述药物 组合物为癌症疫苗功效增强剂。
12. 权利要求12的用途，其中所述癌症疫苗为癌抗原肽疫苗。
13. —种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽，以及癌抗原肽。
14. 权利要求1所述的肽和癌抗原肽在制备药物组合物中的用 途，所述药物组合物用于治疗或预防癌症。
全文摘要
本发明提供了一种WT1衍生的HLA-DRB1*1502-结合抗原肽，编码所述肽的多核苷酸，包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物等等。其涉及由如SEQ ID NO24所示的肽，该肽结合HLA-DRB1*1502并诱导辅助性T细胞，编码所述肽的多核苷酸，或包含所述肽或多核苷酸的辅助性T细胞诱导物。
文档编号C07K14/47GK101580538SQ20091014269
公开日2009年11月18日 申请日期2004年11月4日 优先权日2003年11月5日
发明者杉山治夫 申请人:株式会社国际癌症免疫研究所