专利名称：抗体纯化方法
抗体纯化方法 发明领域本发明涉及重组表达抗体的纯化。
背景技术：
抗体纯化方法通常基于捕获亲和色谱，通常为Protein Α,然后是离子交换和/或 疏水作用和/或混合模式色谱步骤。此类方法通常还包括至少两个病毒清除步骤，通常 通过亲和步骤洗脱液的低pH和在所述方法合适位置放置病毒过滤器清除。mAb纯化方法 去除的杂质包括半抗体、抗体片段、二聚体、以及聚集体、DNA、病毒、HCP、Protein A渗漏物、内毒素以及其它相关杂质。ProteinA为一种最初发现于细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)细胞壁 的40-60kDa表面蛋白。业已发现，由于其结合免疫球蛋白，尤其是IgG的能力，该蛋白 已用于生物化学研究。该蛋白通过与重链相互作用结合免疫球蛋白的Fc区域。W09856808 和 W02005016968 描述了 Protein A 纯化的示例。Protein A 纯化还描述于 W02004076485、US20070060741 和 Kelley BD Biotechnol Bioeng.皿.(3) .553-66 (2008)。持续需要工业生产重组抗体的有效方法。
发明内容
本发明涉及一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体 复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A 衍生物/类似物结合所述抗体复合物，ii)使用合适的缓冲液洗涤所述ProteinA衍生物/类似物结合的抗体，以及iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并 收集在所得洗脱物中。本发明涉及一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体 复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体 结合所述抗体复合物， )使用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以 及来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。本发明涉及一种抗体纯化平台，所述平台包含根据本发明的方法。本发明涉及一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据本发明的方法。详细说明
抗体纯化的常规方法为本领域所熟知，例如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies(单克隆抗体的纯化工具)(1996)ISBN_9653515-9-9中描述的方
法。本发明涉及开发抗体复合物纯化的新方法。在本申请上下文中，抗体复合物为免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”系指一种分子，其属于一类结构相关的糖蛋白，由两对 多肽链组成，一对轻(L)链和一对重(H)链，全部4条链通过二硫键相互连接。免疫球 蛋白的结构已充分鉴定。参见例如Fundamental Immunology Ch.7 (Paul，W.,编辑，第2 版.Raven Press，N.Y. (1989))。简而言之，每条重链通常由重链可变区(Vh)和重链恒定 区(通常包含3个结构域，CH1、Ch2、和Ch3)组成。每条轻链通常由轻链可变区(VJ 和轻链恒定区(通常包含1个结构域，CJ组成。在本发明上下文中术语“抗体复合物”系指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分 子片段、或者两者之一的衍生物，其具有在通常生理条件下长时间特异性结合抗原的能 力，结合时间例如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少 约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更长，约48小时或更长，约3、 4、5、6、7或更多天等等，或者任何其它相关功能限定的时间(例如足以引发、促进、 增强、和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间)。免疫球蛋白分子重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体 (Abs)的恒定区可能介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，其包括免疫系统的多种细胞 (例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)。如上面指出，术语抗体在本文中，除非另作说明或明显与上下文矛盾，包括任 何合适全长抗体的片段，该片段保留特异性结合抗原的能力，且能够结合Protein A，还 能够结合Protein A衍生物/类似物。抗体可能具有不同于上述“典型”免疫球蛋白结构的结构。其可为单链抗体、 双特异性抗体、以及轻链和重链的所有种类的片段和组合。文献中充满此类抗体的描 述。对于本发明的目的来说，抗体复合物结合ProteinA和抗原即可。在一种实施方案中，所述抗体复合物为治疗抗体。在一种实施方案中，所述抗体复合物为IgG抗体。在一种实施方案中，本发明提供了纯化抗体复合物的方法，该方法包含使用基 于Protein A衍生物/类似物而不是常规Protein A柱的亲和色谱。此类Protein A衍生物/ 类似物柱减少配体渗漏，改进日常生产成本并改进产品质量。另外，使用比传统Protein A步骤少盐的洗脱条件可避免亲和与离子交换步骤之间的任何浓缩步骤，例如UF/DF。在一种实施方案中，本发明提供了一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所 述悬浮液包含所述抗体复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A 衍生物/类似物结合所述抗体复合物，ii)使用合适的缓冲液洗涤所述ProteinA衍生物/类似物结合的抗体，以及iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并 收集在所得洗脱物中。在本发明上下文中，Protein A衍生物/类似物为Protein A衍生物/类似物配体，
其中Protein A的IgG结合结构域中的碱不稳定氨基酸已用对碱更加稳定的氨基酸替换。在一种实施方案中，Protein A衍生物/类似物为Protein A分子，其中一个或多个天门冬 酰胺(Asn)残基已被修饰以增加碱性条件下的蛋白稳定性。在一种实施方案中，修饰两 个或更多个Aot残基。在一种实施方案中，修饰所有Asn残基。在一种实施方案中，所 述Aot残基用选自赖氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸的氨基酸替换。在一种实施方案中，所 述Protein A衍生物/类似物为如本文前面所述修饰的结构域Z。在一种实施方案中，所 述Protein A衍生物/类似物为如EP1123389A1和/或US6831161所述的Protein A衍生物 /类似物。母体ProteinA分子也可以其它方式修饰，该方式可能例如增强特性 。在一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物与惰性树脂共价结合。在 一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物树脂为MabSelect SuRe 。MabSelect SuRe 来自 GE Healthcare life Sciences (http://www.gelifesciences.com)。在一种实施方案中，使用Protein A衍生物/类似物的亲和色谱在低于室温的温 度下进行。在一种实施方案中，使用ProteinA衍生物/类似物的亲和色谱在2到25°C温 度下进行，例如5到25°C，例如10到25°C，例如15到25°C，或者温度为2到20°C，例 如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者温度为2到15°C，例如5到15°C， 例如10到15°C，或者温度为2到10°C，例如5到10°C，或者温度为2到5°C。在一种 实施方案中，使用ProteinA衍生物/类似物的亲和色谱在2、5、10、15、20或25°C的温 度下进行。在一种实施方案中，步骤i)、ii)和iii)可使用膜或固体树脂以流过 (flow-through)方式进行。在一种实施方案中，来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物进行病毒灭 活。在一种实施方案中，所述病毒灭活通过降低来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗 脱物的pH进行。在一种实施方案中，所述洗脱物的pH降低至pH 3到4持续时间5分钟 到1天。在一种实施方案中，所述pH降低至pH3.1到4，例如3.2到4，例如3.3到4， 例如3.4到4，例如3.5到4，例如3.6到4，例如3.7到4，例如3.8到4，例如降低至pH 4。在一种实施方案中，所述pH降低至pH3到3.9，例如3.1至Ij 3.9，例如3.2至Ij 3.9，例 如3.3至Ij 3.9，例如3.4至Ij 3.9，例如3.5至Ij 3.9，例如3.6至Ij 3.9，例如3.7至Ij 3.9，例如降 低至pH3.9。在一种实施方案中，所述pH降低至pH3到3.8，例如3.1至Ij 3.8，例如3.2 到3.8，例如3.3至Ij 3.8，例如3.4至Ij 3.8，例如3.5至Ij 3.8，例如3.6至Ij 3.8，例如降低至pH 3.8。在一种实施方案中，所述pH降低至pH3到3.7，例如3.1至Ij 3.7，例如3.2至Ij 3.7， 例如3.3至IJ 3.7，例如3.4至IJ 3.7，例如3.5至Ij 3.7，例如降低至pH3.7。 在一种实施方案 中，所述pH降低至pH 3至Ij 3.6，例如3.1至Ij 3.6，例如3.2至Ij 3.6，例如3.3至Ij 3.6，例如 3.4到3.6，例如降低至pH 3.6。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.5，例如 3.1到3.5，例如3.2至IJ 3.5，例如3.3至Ij 3.5，例如降低至pH 3.5。在一种实施方案中，所 述pH降低至pH 3到3.4，例如3.1到3.4，例如3.2到3.4，例如降低至pH 3.4。在一种 实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.3，例如3.1到3.3，例如降低至pH 3.3。在一种 实施方案中，所述pH降低至pH3到3.2，例如降低至pH 3.2，或者降低至pH 3.1，或者 降低至pH3。如上所述，来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物可在任一所述这些pH值 下保存5分钟到1天时间。在一种实施方案中，所述时间为10分钟到240分钟，例如20到90分钟。然后，所述洗脱物的pH调节至pH 4.5到5.5或者适合任意下列步骤的其它值。在一种实施方案中，来自ProteinA衍生物/类似物色谱的洗脱物在所述降低pH值之前和/或重新调节pH之后过滤。在本发明的一种实施方案中，来自Protein A衍生物/类似物色谱的所得洗脱 物，无论是否进行上述pH降低，都进行阳离子交换步骤。在亲和步骤下游安排阳离子交 换步骤可能有利，因为所得洗脱物的pH低于7，所述洗脱物可直接处理而无需进一步调 节和可能的额外pH调节，所述调节可能跨过mAb的等电点。避免进一步pH调节可帮 助避免沉淀和聚集体形成。可将来自Protein A的洗脱物(可能地，在病毒灭活之后)集合装填到在乙酸钠缓 冲液中在pH 4.5-6.0下预先平衡的柱上进行阳离子色谱。未结合物质从柱上洗去，mAb 使用乙酸钠缓冲液中的0-0.3M氯化钠的线性梯度洗脱。聚集体作为产品之后的峰值洗 脱。杂质例如宿主细胞蛋白、DNA和ProteinA渗漏也显著减少。在一种实施方案中，该阳离子色谱在低于室温的温度下进行。在一种实施方案 中，该阳离子色谱在2到25°C温度下进行，例如5到25°C，例如10到25°C，例如15至Ij 25°C,或者温度为2到20°C，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者温 度为2到15°C，例如5到15°C，例如10到15°C，或者温度为2到10°C，例如5到10°C， 或者温度为2到5°C。在一种实施方案中，该阳离子色谱在2、5、10、15、20或25°C的 温度下进行。在一种实施方案中，该阳离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。在流过模式中，柱或膜在乙酸钠缓冲液中在pH 4.5-6.0下平衡。装填柱直至收 集集合(样品/产品馏分)中出现HCP(宿主细胞蛋白)、聚集体或其它杂质的不可接受 的增长。在一种实施方案中，在阳离子色谱之后进行病毒过滤。在一种实施方案中，病 毒过滤在低于室温的温度下进行。在一种实施方案中，病毒过滤在2到25°C温度下进 行，例如5到250C，例如10到250C，例如15到25°C，或者温度为2到20°C，例如5到 20°C,例如10到20°C，例如15到20°C，或者温度为2到15°C，例如5到15°C，例如10 到15°C，或者温度为2到10°C，例如5到10°C，或者温度为2到5°C。在一种实施方案 中，所述病毒过滤在2、5、10、15、20或25°C的温度下进行。病毒过滤可以如本领域已知的方式完成，例如使用病毒过滤器，例如如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies (单克隆抗体的纯化工具)(1996) ISBN-9653515-9-9 所述。在一种实施方案中，重复病毒过滤步骤，例如使用相似的病毒过滤器或不同的 病毒过滤器进行第二次病毒过滤。在一种实施方案中，第一过滤器比第二过滤器更为多 孔。这使在第一步更有效去除聚集体，在第二步更有效去除病毒。在一种实施方案中，来自阳离子色谱的洗脱物可进行阴离子色谱，可能地，在 如上所述的病毒过滤步骤之后。可将来自阳离子交换色谱步骤的集合装填到在磷酸缓冲液中在pH 6-8下预先 平衡的柱或膜上进行所述阴离子色谱。装填之前，所述物质可使用水稀释至电导率2-12mS/cm并调节pH至目标pH。产品在流出馏分收集。在一种实施方案中，在阴离子色谱之后进行病毒过滤。可如上所述进行所述病 毒过滤。在一种实施方案中，在阳离子色谱之后和阴离子色谱之后都进行病毒过滤。在一种实施方案中，所述阴离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。如果需要，缓冲液交换和抗体浓缩可在最后色谱步骤之后进行(参见例如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies (单克隆抗体的纯化工具)(1996) ISBN-9653515-9-9)，以及例如见于 W02009010269。如本领域已知，抗体样品还可进一步配制成适于药用的制剂中的药物制剂 。本发明还提供了一种抗体纯化平台，即一种标准化方法，其可用于生产多种不 同抗体，一种通用方法，该平台包含根据本发明的方法。所述标准化平台在生产中具有多种优点一节省开发/试验成本和时间，因为每个项目可应用相同的方法一可应用相同的设备和原料、缓冲液等等，因此无需额外试验以及获得新的核 准供应商等等一病毒确认研究可在不同项目中重复使用一节省人力并确保产品质量。在一种实施方案中，所述抗体为IgG抗体。包含本发明方法的抗体生产平台可具有其它优点，例如亲和配体渗漏减少以及 在相同条件下洗脱不同IgG亚型的可能性。因此，本发明还提供了一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据本发 明的纯化抗体复合物的方法。在一种实施方案中，所述抗体复合物为治疗抗体。在一种 实施方案中，所述抗体复合物为IgG抗体。在一种实施方案中，本发明提供了一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包 含根据本发明的纯化抗体复合物的方法，其中从Protein A衍生物/类似物色谱洗脱之后 的步骤无需储存罐以连续过程模式进行。下面是本发明实施方案的非限制性列表。实施方案1 一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗 体复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A 衍生物/类似物结合所述抗体复合物，ii)使用合适的缓冲液洗涤所述ProteinA衍生物/类似物结合的抗体，以及iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并 收集在所得洗脱物中。实施方案2:根据实施方案1所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/类似物为 Protein A的衍生物/类似物，其中IgG结合结构域中的碱不稳定氨基酸已用对碱更加稳定
的氨基酸替换。实施方案3:根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述ProteinA衍生 物/类似物与惰性树脂共价结合。实施方案4:根据实施方案3所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/类似物树脂为 MabSelect SuRe 。
实施方案5 根据实施方案1到4中任一实施方案所述的方法，其中步骤i)到 iii)中的一步或多步在低于室温的温度下进行。实施方案6 根据实施方案5所述的方法，其中所有步骤i)、ii)和iii)在低于室 温的温度下进行。实施方案7 根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温 度为温度2到250C，例如5到250C，例如10到25°C，例如15到25°C。实施方案8 根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温 度为选自温度2到20°C的温度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者 温度为2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。实施方案9 根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温 度为选自温度2到10°C的温度，例如5到10°C。实施方案10 根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的 温度为2到5°C的温度。实施方案11 根据实施方案1到7中任一实施方案所述的方法，其中所述色谱 使用膜或固体树脂以流过方式进行。实施方案12 一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗 体复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体 结合所述抗体复合物， )使用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以 及来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。实施方案13 根据实施方案12所述的方法，其中所述配体为Protein A。实施方案14 根据实施方案1到11中任一实施方案所述的方法，其中来自步骤 iii)的洗脱物进行阳离子色谱。实施方案15 根据实施方案12到14中任一实施方案所述的方法，其中来自步 骤iii)的洗脱物在进行阳离子色谱之前进行病毒灭活。实施方案16:根据实施方案15所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物的pH 降低至pH 3到4持续5分钟到1天的时间，然后在阳离子色谱之前重新调节。实施方案17:根据实施方案16所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4-3.9持 续20到90分钟的时间。实施方案18 根据实施方案12到17中任一实施方案所述的方法，其中阳离子 色谱在低于室温的温度下进行。实施方案19 根据实施方案18所述的方法，其中所述低于室温的温度为温度2 到25°C,例如5到25°C,例如10到25°C,例如15到25°C。实施方案20 根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温 的温度为选自温度2到20°C的温度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者温度为2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。实施方案21 根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温 的温度为选自温度2到10°C的温度，例如5到10°C。实施方案22 根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温 的温度为2到5°C的温度。实施方案23 根据实施方案12到22中任一实施方案所述的方法，其中所述阳离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。实施方案24 根据实施方案1到7中任一实施方案所述的方法，其中来自步骤 iii)的洗脱物进行阴离子色谱。实施方案25:根据实施方案24所述的方法，其中装填之前将来自步骤iii)的洗 脱物的电导率调节至2到12mS/cm的电导率。实施方案26:根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中来自步骤iii)的 洗脱物在进行阴离子色谱之前进行病毒灭活。实施方案27:根据实施方案26所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物的pH 降低至pH 3到4持续5分钟到1天的时间，然后在阴离子色谱之前重新调节。实施方案28:根据实施方案27所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4_3.9持 续20到90分钟的时间。实施方案29 根据实施方案12到23中任一实施方案所述的方法，其中来自阳 离子色谱的洗脱物进行阴离子色谱，其中来自阳离子色谱的洗脱物可选地在进行阴离子 色谱之前进行病毒过滤。实施方案30:根据实施方案29所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进 行阴离子色谱之前进行病毒过滤。实施方案31:根据实施方案30所述的方法，其中病毒过滤包含来自阳离子色谱 的洗脱物在第一过滤器然后在第二过滤器上过滤。实施方案32:根据实施方案42所述的方法，其中该第一过滤器比第二过滤器更 多孔。实施方案33:根据实施方案29所述的方法，其中装填之前将来自阳离子色谱的 洗脱物的电导率调节至2到12mS/cm的电导率。实施方案34 根据实施方案24到33中任一实施方案所述的方法，其中所述阴 离子色谱在低于室温的温度下进行。实施方案35:根据实施方案34所述的方法，其中所述低于室温的温度为2到 25°C的温度，例如5到25°C,例如10到25°C,例如15到25°C。实施方案36 根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温 的温度为选自温度2到20°C的温度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C， 或者温度为2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。实施方案37 根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温 的温度为选自温度2到10°C的温度，例如5到10°C。实施方案38 根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温 的温度为2到5°C的温度。
实施方案39 根据实施方案24到38中任一实施方案所述的方法，其中所述阴 离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。实 施方案40:根据实施方案24到39中任一实施方案所述的方法，其中来自阴 离子色谱的洗脱物进行病毒过滤。实施方案41:根据实施方案40所述的方法，其中病毒过滤包含来自阴离子色谱 的洗脱物在第一过滤器然后在第二过滤器上过滤。实施方案42:根据实施方案42所述的方法，其中该第一过滤器比第二过滤器更 多孔。实施方案43 根据实施方案1到42中任一实施方案所述的方法，其中最终洗脱 物进行渗滤和/或超滤。实施方案44 根据实施方案1到43中任一实施方案所述的方法，其中最终洗脱 物配制成药物制剂。实施方案45 根据实施方案1到44中任一实施方案所述的方法，其中所述抗体 复合物为IgG抗体。实施方案46 根据实施方案1到45中任一实施方案所述的方法，其中所述抗体 复合物为治疗抗体。实施方案47 一种抗体纯化平台，所述平台包含一种根据实施方案1到46中任 一实施方案所述的方法。实施方案48: —种适合纯化IgG抗体的抗体纯化平台，所述平台包含一种根据 实施方案1到46中任一实施方案所述的方法。实施方案49:根据实施方案47或实施方案48所述的抗体纯化平台，其中所述 平台用于生产IgG抗体。实施方案50 根据实施方案47到49中任一实施方案所述的抗体纯化平台，其 中所述平台用于生产治疗抗体。实施方案51 一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据实施方案1到 46中任一实施方案所述的方法。实施方案52:根据实施方案51所述的方法，其中从Protein A衍生物/类似物色 谱洗脱之后的步骤无需储存罐以连续过程模式进行。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引用结合到本 文中，其范围与每个参考文献单独并特定注明通过引用结合且其全部内容所阐明的相 同。所有标题和副标题在本文中仅为方便使用，不应解释为以任何方式限制本发 明。上述要素以其所有可能变化的任何组合包含在本发明中，除非本文另有说明或 者上下文明显矛盾。术语“一种”和“一个”和“该”以及类似指代词用于描述本发明的上下文 时，应解释为包含单数和复数，除非本文另有说明或者上下文明显矛盾。本文列举的数值范围仅意在作为单独表示该范围内每个不同数值的简短方法， 除非本文另有说明，每个不同数值结合到说明书中，如同其在本文中单独列举。除非另有说明，本文提供的所有精确数值代表对应的近似数值(例如对于特定因子或测量提供 的所有精确示例数值可认为也提供了对应的近似测量，在适当情况下用“约”修饰)。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或者上下文 明显矛盾。使用本文提供的任何和所有实例、或示例语言(“例如”)，仅意在更好地说明 本发明，而非对本发明的范围进行限制，除非另有说明。本说明书中的语言不应解释为 提示任何要素对本发明的实践必不可少，除非明确说明如此。本文引用和结合专利文件仅为方便而为，并不反映此类专利文件的有效性、专 利性和/或可实施性的任何观点。本文对本发明的任何方面或实施方案的描述，其涉及一种要素或多种要素使用 术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”，意在对本发明的相似方面或实 施方案提供支持，所述相似方面或实施方案“由”所述特定要素或多种要素“组成”、
“主要由”所述特定要素或多种要素“组成”、或者“主要包含”所述特定要素或多种 要素，除非另有说明或上下文明显矛盾(例如本文所述的一种组合物包含一种特定要素 应理解为也描述了一种由所述要素组成的组合物，除非另有说明或上下文明显矛盾)。本发明以适用法律允许的最大范围包括本文描述的方面或权利要求中列举的主 题的所有修改和等价物。
实施例实施例1抗体纯化方法 从CHO细胞培养中纯化mAb的方法(抗NKG2A，描述于例如W02006070286 和W02008009545，抗NKG2D，描述于例如W02005097160，以及抗C5aR，描述于例如 W02003062278和W02008022390)包含多个步骤。细胞培养上清液过滤并装填到106ml MabSelect SuRe亲和柱(长度Ilcm)上(关于溶剂和条件，参见下面)。洗脱产物集合 通过使用0.2M柠檬酸调节pH至pH 3.7进行病毒灭活并在室温下保持1小时。也可使 用其它低pKa缓冲液例如5-lOOmM浓度的柠檬酸或乙酸进行洗脱。随后，该集合使用 0.5M Na2HPO4调节至pH 5.0，然后装填到94ml POROS 50HS阳离子交换柱(长度4.8cm) 上。pH调节之后，溶液中的杂质可能发生沉淀，在装填到阳离子柱之前必须通过过滤或 离心去除。使用包含超过IOCV的0-0.3mol/kg NaCl梯度的25mM CH3COONa, pH 5.0 洗脱缓冲液完成洗脱。此步骤的pH可根据实际mAb的pi调节。mAb集合使用0.5M Na2HPO4溶液调节至pH 7.0，并通过由0.1 μ m过滤器(4.52cm2)组成的过滤器串过滤， 紧接着用Planova 20N病毒过滤器(0.001m2)过滤。(Millex-W过滤器的替代品为0.1 μ m Millipore Opticap XLT 20 过滤器)。病毒滤液在装填到 Sartobind Q SingleSep 胶囊(75cm2) 阴离子交换膜之前在室温下用水稀释至<7.0mS/cm。电导率降低也可通过UF/DF实现。 阴离子交换膜步骤在非结合条件下以流过方式进行，滤液最终使用50cm2 Biomax 30k膜 在Akta交叉流动仪器上超滤并渗滤至IOmM组氨酸缓冲液pH 6.2中，然后加入Tween 80至0.01%。药物制剂的最终组成为40mgmAb/mL、25g/L蔗糖、0.01 % w/w Tween 80、IOmM组氨酸，pH6.2。抗NKG2A、抗NKG2D和抗C5aR的步骤产率和其它条件/结果分别在表1、2和3中提供。Q膜步骤和通过膜的装填溶液的电导率和pH必须根 据每种mAb调节以达到具有最高可能产率的最大杂质减少。因此电导率和pH可能分别 在2-12mS/cm(由NaCl含量控制)和pH 5.8-8.0范围内变化。溶剂和条件Protein A 衍生物 / 类似物捕获-MabSelect SuRe 室温 流速20倍柱容积每小时(CV/h) 装填30g mAb/L树脂，但可在l_50g/L树脂范围内变化 平衡与洗涤缓冲液11.5mmol/kg NaH2PO4, 38.5mmol/kg Na2HPO4, 300mmol/kg N aCl 洗涤缓冲液6.5mmol/kg NaH2PO4, 43.5mmol/kg Na2HPO4, 1000mmol/kg NaCl 洗脱缓冲液10mmol/kg 甲酸，pH 3.5 使用分段梯度洗脱 在pH3.7(0.2M柠檬酸)病毒灭活1小时，然后使用0.5M Na2HPO4调节pH至 pH5.0CIEX-Poros 50HS, pH 5 室温 流速25CV/h 装填45g mAb/L树脂，但可在40_120g/L树脂范围内变化 平衡与洗涤缓冲液25mmol/kg CH3COONa 和 12.5mmol/kg CH3COOH 洗脱缓冲液25mmol/kg CH3COONa 和 10.lmmol/kg CH3COOH, 300mmol/ kg NaCl 使用平衡/洗脱缓冲液中的0-300_ol/kgNaCl线性梯度缓冲液pH 5洗脱病毒过滤-Planova20N 室温 过滤时压力0.8巴 装填《110kg/m2，但可高达 5OOkgAn2 使用 0.5M Na2HPO4 溶液调节 pH 至 7.0 平衡与洗涤缓冲液7.7mmol/kg NaH2PO4, 12.2mmol/kg Na2HPO4, 50mmol/ kg NaCl 使用0.1 μ m过滤器预过滤·使用 Planova 20N 过滤Q 膜流过，pH7 室温 流速300CV/h 装填483g/m2，但装填可在200_3000g/m2范围内变化 用水稀释集合至7mS/cm 平衡与洗涤缓冲液7.7mmol/kg NaH2PO4, 12.2mmol/kg Na2HPO4, 50mmol/
权利要求
1.一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中i)所述悬浮液在某些条件下接触ProteinA衍生物/类似物，其中所述Protein A衍生 物/类似物与所述抗体复合物结合，ii)用合适的缓冲液洗涤所述ProteinA衍生物/类似物结合的抗体，以及iii)用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述ProteinA衍生物/类似物洗脱并收集在 所得洗脱物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/类似物树脂为MabSelect SuRe 。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤i)到iii)中的一步或多步在低 于室温的温度下进行。
4.一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中 i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体与所 述抗体复合物结合，ii)用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，iii)用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以及来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体为ProteinA。
6.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行 阳离子色谱。
7.根据权利要求4到6中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进 行阳离子色谱之前进行病毒灭活。
8.根据权利要求4到7中任一权利要求所述的方法，其中所述阳离子色谱在低于室温 的温度下进行。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行 阴离子色谱。
10.根据权利要求9所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进行阴离子色谱之前 进行病毒灭活。
11.根据权利要求4到10中任一权利要求所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物 进行阴离子色谱，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进行阴离子色谱之前任选进行病毒过滤ο
12.根据权利要求11所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进行阴离子色谱之 前进行病毒过滤。
13.根据权利要求9到12中任一权利要求所述的方法，其中所述阴离子色谱在低于室 温的温度下进行。
14.根据权利要求9到13中任一权利要求所述的方法，其中所述阴离子色谱使用膜或 固体树脂以流过方式进行。
15.根据权利要求9到14中任一权利要求所述的方法，其中来自阴离子色谱的洗脱物 进行病毒过滤。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中最终洗脱物进行渗滤和/或超滤。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，其中最终洗脱物配制成药物制剂。
18.一种抗体纯化平台，所述平台包含根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法。
19.一种适合纯化IgG抗体的抗体纯化平台，所述平台包含根据权利要求1到17中任 一权利要求所述的方法。
20.根据权利要求18所述的抗体纯化平台，其中所述平台用于生产治疗IgG抗体。
21.—种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据权利要求1到17中任一权利要 求所述的方法。
22.根据权利要求21所述的方法，其中从ProteinA衍生物/类似物色谱洗脱之后的 步骤无需储存罐以连续过程模式进行。
全文摘要
本发明涉及抗体的工业生产方法。
文档编号C07K16/06GK102027010SQ200980118361
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者A·斯塔比, B·R·尼尔森, C·杰斯帕斯加尔德, D·E·拉斯姆森, E·哈尔克杰尔, H·克里斯滕森, J·S·尼尔森, R·C·尼尔森, T·B·汉森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司