肽及其衍生物、其制备及其在制备治疗性和/或预防性的活性药物组合物中的用途的制作方法

专利名称：肽及其衍生物、其制备及其在制备治疗性和/或预防性的活性药物组合物中的用途的制作方法
肽及其衍生物、其制备及其在制备治疗性和/或预防性的 活性药物组合物中的用途 本发明涉及肽及其衍生物、其制备及其在制备治疗性和/或预防性的活性药物中 的用途、以及这样的药学药物。EP1586586描述了具有抗炎效应的来自纤维蛋白序列的肽的用途。所述效应可以基于以下事实纤维蛋白和在纤维蛋白分解过程中产生的纤维蛋 白片段通过Ββ-链的新的N末端与内皮细胞结合，并且通过Aa-链的序列与血流中的 细胞结合，从而导致这些细胞向组织中的粘附和迁移。纤维蛋白和纤维蛋白片段与内皮 细胞的结合伴侣是蛋白“血管内皮(VE)钙粘蛋白”，其在邻近的内皮细胞之间的粘合连接 (adherens junction)专有地表达。根据本发明的肽阻断该相互作用，从而抵制血细胞的迁 移。但是，血液中的白细胞抵抗感染的天然防御并不受到有害影响。因此，其成分，例如粒 细胞、淋巴细胞和单核细胞，保持不受影响，从而天然防御过程仍然维持。纤维蛋白原在肝脏中产生，这种形式的纤维蛋白原是无生物学活性的，在血液中 其浓度通常是约3g/l。酶原凝血酶原的蛋白水解切割引起凝血酶的形成，凝血酶将纤维蛋 白肽A和B从纤维蛋白原上切割下来。通过这种方式，纤维蛋白原被转化为其生物学活性 形式。产生了纤维蛋白和纤维蛋白切割产物。每当血液凝固被激活时，即由于组织损伤、炎症、外伤或发生退化，凝血酶即形成。 凝血酶介导的纤维蛋白的形成本质上是保护性过程，其旨在使血管系统造成的任何破损迅 速封闭。但是，纤维蛋白的形成也是病理过程。纤维蛋白血栓的出现(其为心脏梗塞的激 发起因)是人类医药中的最突出的问题之一。一方面，纤维蛋白在炎性细胞脱离血流进入组织的过程中发挥的作用是抵御组织 中的致病微生物或肿瘤细胞的想要的过程，但另一方面，其自身是诱导或延长对组织造成 的损伤的过程，目前尚未对其进行任何检查或进行了足够程度的检查。纤维蛋白通过Ββ 的序列经由Ββ的新的N末端与内皮细胞结合，并且通过Aa的序列与血流中的细胞结合， 从而导致细胞向组织中的粘附和迁移。通过以上描述的机理，根据本发明的肽或蛋白可以阻止细胞从血流向血管壁的内 皮细胞的粘附和/或它们随后从血液向组织的迁移。与急性炎性疾病相关的主要异常之一是内皮屏障功能的丧失。内皮的结构和功 能上的完整性对于维持屏障功能是必需的，如果其中任一项被破坏，溶解物和多余的血浆 液体将穿过单层泄漏，导致组织水肿和炎性细胞的迁移。很多试剂通过激发内皮细胞形状 的改变(例如收缩或缩回)而增加单层的通透性，导致细胞间间隙的形成(Lum & Malik， Am. J. Physiol. 267 :L223_L241，1994)。这些试剂包括例如凝血酶、缓激肽和血管内皮生长 因子(VEGF)。血管壁的高通透性允许多余的液体的泄漏并允许蛋白进入间隙空间。这种急性炎 性事件经常伴随着组织缺血和急性器官功能失常。由于在邻近的EC之间形成大的细胞旁 洞(paracellular hole)，所以在激活的内皮细胞(EC)的位点形成的凝血酶启动该微血管 屏障功能失常(Carbajal 等人，Am J Physiol Cell Physiol 279 :C195_C204，2000)。这个过程的特征在于由于肌球蛋白轻链磷酸化(MLCP)(其启动F-肌动蛋白依赖性的细胞骨架 收缩紧张的产生)造成的EC形状的改变(Garcia等人，J Cell Physiol. 1995 ； 163 :510_522 Lum & Malik，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 273(5) :Η2442_Η2451· 1997)。 凝血酶诱导的内皮高通透性还可以由细胞-细胞粘附的变化所介导(Dejana J.Clin. Invest. 98 1949-1953，1996)。内皮细胞-细胞粘附主要由血管内皮(VE)钙粘蛋 白(钙粘蛋白5)的功能决定，所述蛋白是形成粘合连接的钙依赖性的细胞-细胞粘附分 子。通过与辅助蛋白b-连接素、盘状球蛋白(g_连接素)和pl20(这些蛋白继而与a-连 接素(与粘着斑蛋白同源)连接)以及F-肌动蛋白细胞骨架的结合而从细胞质一侧调节 钙粘蛋白5的功能。VE钙粘蛋白作为粘附分子出现，其在微血管通透性和与血管生成相关的形态发 生和增殖事件中发挥基础性作用(Vincent等人，Am J Physiol Cell Physiol, 286 (5) C987-C997，2004)。与其它钙粘蛋白一样，VE-钙粘蛋白介导钙依赖性的、亲同种粘附并作 为细胞骨架的细胞膜粘附位点发挥作用。但是，VE-钙粘蛋白整合进入对于血管内皮至关 重要的信号传导途经和细胞系统。最近内皮细胞生物学和生理学的进展揭示了 VE-钙粘蛋 白的特征，其在粘附分子的钙粘蛋白家族成员中可能是独特的。由于这些原因，VE-钙粘蛋 白代表了既是钙粘蛋白家族的典型又具有独特的功能和生理相关性的钙粘蛋白。很多优秀 的综述文章讨论了 VE-钙粘蛋白对血管屏障功能、血管生成和心血管生理学的贡献。越来越多的证据表明VE_钙粘蛋白介导的细胞_细胞粘附由连接蛋白(包括钙 粘蛋白和连接素)的磷酸化和去磷酸化之间的动态平衡控制。b-连接素的酪氨酸磷酸化 的增加引起连接素从钙粘蛋白以及从细胞骨架的分离，从而导致弱的粘合连接(AJ)。类似 地，在松散的AJ发生的VE-钙粘蛋白和b-连接素的酪氨酸磷酸化在紧密汇合的单层中显 著减少(Tinsley 等人，J Biol Chem，274，24930-24934，1999)。此外，粘合连接中的VE-钙粘蛋白单体的正确成簇对于VE-钙粘蛋白的正确信号 传导活性是不可缺少的，因为携带嵌合突变体(IL2-VE)(其含有全长VE-钙粘蛋白细胞 质尾巴)的细胞不能引起正确的信号传导，虽然其具有与连接素和P120结合的能力 (Lampugnani 等人，Mol. Biol, of the Cell, 13，1175-1189，2002)。Rho GTPase是对于细胞的肌动蛋白细胞骨架具有显著作用的小的GTPase家族。 关于血管系统的功能，它们参与细胞形状、细胞收缩、细胞能动性和细胞粘附的调节。Rho GTPase家族的三个最重要的成员是RhoA、Rac和cdc42。RhoA的激活诱导细胞中的f_肌 动蛋白应激纤维的形成，而Rac和cdc42通过分别诱导膜褶皱和微棘而影响肌动蛋白细胞 骨架(Hall, Science, 279 :509_514. 1998)。尽管Rac和cdc42能够通过蛋白PAK的激活而 在有限程度上影响 MLCK 活性(Goeckeler 等人 J. Biol. Chem.，275，24，18366-18374，2000)， 但RhoA通过其使MLC的磷酸化状态稳定的能力而对肌动蛋白-肌球蛋白相互作用具有显 著的刺激效应(Katoh 等人，Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 280，C1669-C1679，2001)。这通 过Rho激酶的激活发生，Rho激酶的激活继而抑制磷酸酶PPlM(其水解磷酸化的MLC)。此 夕卜，Rho激酶抑制丝切蛋白(cofilin)的肌动蛋白切断作用，并因此使f_激动蛋白纤维稳定 (Toshima等人，Mol. Biol, of the Cell. 12，1131-1145，2001)。此外，Rho激酶还可以参与肌 动蛋白细胞骨架向细胞膜中的蛋白的锚定，因此可以潜在地作用于连接蛋白(junctional protein)和肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用(Fukata等人.Cell Biol 145:347-361，1999)凝血酶能够通过G α 12/13和所谓的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活 RhoA (Seasholtz 等人；Mol =Pharmacol. 55，949-956，1999)。GEF 将与 RhoA 结合的 GDP 交换 为GTP，从而RhoA变成有活性的。通过这种激活，RhoA转位到膜，在那里它通过它的亲脂性 香叶基-香叶基-锚定而发生结合。RhoA可以被许多有血管活性的试剂激活，包括溶血磷脂酸、凝血酶和内皮素。通过 鸟嘌呤分离抑制剂(GDI)的作用，或者在GTPase激活蛋白(GAP)的作用之后，与膜结合的 RhoA从膜上分离下来。鸟嘌呤分离抑制剂(GDI)是与RhoA的羧基端结合的调节蛋白。⑶I通过保持⑶P的分离并使活性RhoA与细胞膜分离而抑制RhoA的活性。凝血 酶直接激活人类内皮细胞中的RhoA并诱导RhoA转位至细胞膜。在相同的条件下，相关的 GTPase Rac不被激活。来自肉毒杆菌的C3转移酶对RhoA的特异性抑制减少了凝血酶诱导 的内皮MLC的磷酸化和通透性的增加，但是不影响瞬间组氨酸依赖性的通透性的增加(van Nieuw Amerongen 等人 Circ Res. 1998 ;83 :1115_11231，1998)。RhoA 的效应似乎是通过 Rho激酶介导的，因为特异性的Rho激酶抑制剂Y27632类似地也减少凝血酶诱导的内皮通 透性。Racl和RhoA对于内皮屏障功能具有拮抗效应。急性缺氧抑制Racl并激活正常 成人肺动脉内皮细胞(PAEC)中的RhoA，这导致屏障功能的破坏(Wojciak-Stothard and Ridley, Vascul Pharmacol.，39 187-99，2002)。来自于具有慢性缺氧的小猪的 PAEC 诱 导的肺部高血压具有稳定的异常表型，其中Racl持续降低并且RhoA的活性升高。这些 活动与内皮细胞骨架、粘合连接和通透性的变化相关联。Racl的激活以及RhoA的抑制使 异常表型和通透性恢复至正常(Wojciak-Stothard等人，Am. J. Physiol, Lung Cell Mol. Physiol. 290，L1173-L1182，2006)。因此可以预期，将Racl激活至并将RhoA的活性减少至在正常和稳定条件下的内 皮细胞中观察到的水平的那些物质会降低内皮的高通透性并对多种疾病具有有益的治疗 效应。优选地，这种效应由粘合连接中的VE-钙粘蛋白的成簇的稳定化引起。与VE-钙粘蛋 白连接的细胞内蛋白复合物的主要组分是fyn，其为一种激酶，是src酪氨酸激酶的成员。 作为本发明的主题的化合物与VE-钙粘蛋白的结合引起fyn与VE-钙粘蛋白的分离，继而 引起凝血酶诱导的活性RhoA的失活。W09216221描述了与长链聚合物例如甲氧基聚乙二醇(PEG)共价连接的多肽。多 肽与这类聚合物的结合通常引起这些多肽的生物学半衰期的延长并延迟它们的肾脏排泄。 这些多月太的总结见 Davis 等人，Polymeric Materials Pharmaceuticals for Biomedical Use,pp. 441-451(1980)。PEG基团的加入通过与PEG化的肽的分子量成比例的方式发挥这 种效应，因为，直至分子的一定大小，肾小球滤过率与分子量成反比。

W02004/101600也描述了新的聚(乙二醇)_修饰的化合物及其用途，尤其重点在 于修饰的肽激活红细胞生成素受体。肽和蛋白PEG残基的共价修饰的其它例子有白细胞介素(Knauf等人，J.Biol Chem.1988，263，15064 ；Tsutumi 等人，J. Controlled Release 1995，33，447)、干扰素 (Kita 等人，Drug Delivery Res. 1990,6 157)、过氧化氢酶(Abuchowski 等人，J. Biol. Chem. 1997，252，3582)。现有技术的综述见 Reddy，Ann. of Pharmacotherapy，2000，34，915。
延长的生物学半衰期对于肽的各种治疗应用是有利的。在慢性疾病(其中建议在 延长的时间段内给予活性试剂)的情况下尤其是这样。通过这样的建议，其可以改善患者 的依从性，因为每日一次地使用活性试剂将比例如连续输注更容易被人接受。除了通过共 价修饰增加分子量之外，还可以通过防止其被水解酶(例如外切或内切蛋白酶或肽酶)降 解的方式对其进行修饰从而获得多肽的持续性的延长。已经通过使用不同的实例显示了有必要对每种肽进行个性化的合适修饰从而 防止对于药代动力学效应的显著影响(与未经修饰的肽相比)。在本文上下文中可能提 及下列物质降钙素(Lee等人Pharm. Res. 1999，16，813)、生长激素释放激素(Esposito 等人，Advanced Drug Delivery Reviews，2003，55，1279)、胰高血糖素样肽 1 (Lee 等 人，Bioconjugate Res. 2005，16，377)、以及生长激素-受体拮抗剂培维索孟(Ross等 人，J. Clin. Endocrin. Metab. 2001，86，1716)。Caliceti 禾口 Veronese (Adv. Drug Deliv. Rev. 2003,551261)以及 Harris 和 Chess 的综述(Nature Rev. Drug Discovery 2003，2， 214)讨论了在设计肽-或蛋白-PEG-缀合物时有必要考虑最初物质的结构、肽和聚合物的 分子量、缀合的聚合物链的数目以及接头化学，从而获得有效的肽-PEG-缀合物。令人惊奇的是，现在已经发现衍生自Ββ (15-42)纤维蛋白片段链的肽(其缺少氨 基酸6-11并且已猜测其作为推定的糖胺聚糖结合位点)，以及在该肽序列的C末端修饰的 衍生物，也具有强烈的抗炎和内皮稳定化效应。这一点适用于肽及其衍生物(其修饰会防 止蛋白酶或肽酶对它们的破坏)，也适用于通常衍生自B β (15-42)纤维蛋白片段的基础序 列但缺少氨基酸6至11的-PEG-缀合物和肽-PEG-缀合物。因此本发明涉及肽和修饰的肽，其衍生自Ββ (15-42)纤维蛋白片段的链，其中除 去了纤维蛋白序列的氨基酸6至11。它们可以游离肽或以C-末端衍生物和/或与聚乙二 醇(PEG)-聚合物连接的形式存在，并具有抗炎和/或内皮稳定化效应。例如可以考虑酯或 酰胺作为C-末端衍生物。本发明的化合物相对于待处理的温血动物的纤维蛋白的天然序列可以在一个或 数个位置具有保守性氨基酸替换。保守性替换定义为各个氨基酸的侧链被具有相似化学结 构和极性的侧链替换，所述侧链衍生自遗传编码的或非遗传编码的氨基酸。这种具有相似 侧链的氨基酸的家族是本领域已知的。它们包括例如具有碱性侧链(赖氨酸、精氨酸、组 氨酸)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧 链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。侧链的这种保守性替换可以优选在非 必需位置进行。在本文上下文中，序列中的必需位置是指相关氨基酸的侧链对于其生物学 效应具有重要意义。本发明特别考虑到下列通式I的肽及其衍生物，和其生理上可接受的盐H2N-GHRPX1X2PX3X4X5PX6PPPX7X8X9XiciB (1) B (2) B (3)-X11 (I)，其中 B(I)代表化学键或氨基酸G ；B (2)代表化学键或氨基酸Y ；B (3)代表化学键或氨基酸R ；
X1-X10代表20种遗传编码的氨基酸中的一种，X11 代表 OR1，R1 =氢或(C「Cltl-烷基)，或NR2R3, R2和R3相同或不同，且代表氢、(C1-C10)-烷基，或残基-PEG5_6(1K，其中PEG-残 基通过间隔子与N原子连接，或残基NH-Y-Z-PEG5_6(IK，其中Y代表化学键或选自S、C、K或R 的遗传编码的氨基酸，Z代表间隔子，通过该间隔子可连接聚乙二醇(PEG)-残基。本发明的优选主题是通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的盐，其中B(I), B (2)和B (3)具有如上所述的含义，X” X3，X4，X8 代表 L、I、S、M 或 A，X5 代表 R 或 K，

12、父6代表六、6、3或1^X7代表I、L或V，并且其中X9, X10和X11具有如上文定义的相同的含义。 本发明的特别优选的主题为通式II的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的盐，H2N-GHRPLAPSLRPAPPPISGG"B(I)-B(2)-B(3)-X17(II)，其中X11具有如通式I中定义的相同的含义。本发明最高度优选的主题是通式(II)的化合物，及其生理上可接受的盐，其中X11代表NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氢或(C1-Cltl)-烷基，或残基 C (NR2R3) - (S-琥珀酰亚胺)-(PEG5_4CIK)，琥珀酰亚胺残基通过C原子3与半胱氨酸残基中的 硫原子连接。在以上通式I和II中，下列字母代表根据蛋白和肽的一般命名法的氨基酸残基 苯丙氨酸是F，亮氨酸是L，异亮氨酸是I，蛋氨酸是M,缬氨酸是V，丝氨酸是S,脯氨酸是P， 苏氨酸是T，丙氨酸是A，酪氨酸是Y，组氨酸是H，谷氨酰胺是Q，天冬酰胺是N，赖氨酸是K， 天冬氨酸是D，谷氨酸是E，半胱氨酸是C，色氨酸是W，精氨酸是R，甘氨酸是G。通式I的化合物中的氨基酸残基可以以其D或其L构型存在。术语肽是指这些氨基酸的聚合物，其通过酰胺键连接。“生理上可接受的”意思是与酸或碱形成的盐，当用于人类时，所述酸或碱的加入 不产生不想要的效应。优选的是与酸或碱形成的这样的盐在美国药典或任何其它普遍接 受的药典中将其列为用于温血动物，尤其是人类。PEG代表聚乙二醇残基，其具有5000至60000道尔顿的分子量，该分子量是分子量 分布的最大值，从而混合物中的单个组分具有更高或更低的分子量。本发明还涉及通式I的肽和肽衍生物的生产方法，其特征在于下列任一项(A)将各序列的C末端的第一个氨基酸通过合适的可切割的间隔子连接至聚合物 树脂，随后的氨基酸(任选含有合适的官能团保护基)通过本领域已知的方法逐步连接，根 据本领域已知的合适的方法将完成的肽从聚合物树脂上切割下来，如果存在保护基，则通 过合适的方法将其切除，根据合适的方法纯化肽或肽衍生物，或(B)将具有想要的分子量的PEG基团通过合适的间隔子连接至聚合物树脂，使用 合适的方法将肽的N末端的第一个氨基酸连接，其余的步骤与(A)中的描述相同，或(C)使用合适的方法将在ε _氨基上含有合适的保护基的赖氨酸残基连接至合适 的聚合物树脂，如(A)中的描述合成肽链，然后从聚合物树脂上切除并纯化，如果必要，使用合适的方法切除ε -氨基上的保护基，使用适当激活的试剂将具有想要的分子量的PEG 基团连接至ε “氨基，切除任选地剩余的保护基，使用合适的方法纯化最终的产物，或(D)将含有半胱氨酸残基的肽与PEG-马来酰亚胺反应以形成式II的化合物。(A)、⑶或(C)之后的适当的处理步骤以及适当的试剂在例如文献WO 2004/101600中有描述。各个处理步骤的实施方式本身不是新的，对于有机合成领域有经验的技术人员是 清楚的。将PEG-残基连接至肽链的方法对技术人员而言是已知的。例如，半胱氨酸(C)残 基可以与PEG-马来酰亚胺反应，产生琥珀酰亚胺残基作为残基Z的间隔子。另一个可能性 是任选被激活的C末端羧基残基与氨基烷基_取代的PEG残基反应。另一个可能性是通过 醛取代的PEG残基与赖氨酸残基的ε-氨基官能的反应而引入PEG残基。具有适当的间隔 子和反应性基团的激活的PEG试剂可以从例如NOF Corporation (Tokyo, Japan)获得。根据本发明的物质和根据本发明的物质用于生产药学药物的用途对于生产用于治疗疾病的药学药物具有特别重要的意义，所述疾病由白细胞的组织损伤效应引起，或所 述疾病中沿(lining)血管的内皮细胞层的完整性和完全(full)生理完整性被损害。属于该类别的疾病是与自身免疫相关的(in context with)那些疾病，例如胶原 病、风湿病、炎性肠道疾病(例如Morbus Crohn或溃疡性结肠炎)、牛皮癣和牛皮癣性类风 湿性关节炎，和感染后/类感染(parainfectious)疾病以及由移植物对宿主的反应引起的 疾病。随着该药物阻断白细胞向组织的迁移而发生复原效应。因此，白细胞保留在血流中， 不能引起对组织有害的自身反应性效应。本发明的物质的这种效应对于治疗休克病症也具 有重要意义，特别是在下列情况下由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌病原体感染以及病毒 感染引发的败血性休克，以及严重损伤或细菌或病毒感染导致的严重失血引起的出血性休 克。本发明的物质一般可用于分别由下列术语描述的情况全身性炎性反应综合征 (SIRS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和器官或多器官衰竭。用于治疗和/或预防器官移植的排斥反应的药学药物具有复原效应，因为该药学 药物阻止白细胞从血流迁移进入供体器官，因此，供体器官能够不被破坏，例如不被自身反 应性淋巴细胞破坏。用于治疗和/或预防动脉硬化的药学药物具有复原和/或预防效应，因为该药学 药物阻断淋巴细胞和单核细胞迁移进入组织壁，因此，阻断组织壁的细胞的激活。因此，动 脉硬化的进程被最小化或被停止，由此导致的动脉硬化斑的进展被抑制，从而引起动脉硬 化减退。用于治疗和/或预防手术或药物诱导的血液再供(re-supply with blood)之后 (例如经皮冠状动脉介入治疗、中风、血管手术、心脏搭桥手术和器官移植之后)的再灌注 损伤的药学药物具有复原和/或预防效应，因为该药学药物抑制淋巴细胞、嗜中性粒细胞 和单核细胞迁移进入血管壁。再灌注损伤是血液向血管再供过程中血管细胞的缺氧/酸中 毒(从而引起它们的激活和/或损伤)引起的。因此，淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞 粘附至血管壁并迁移至其中。阻断淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞在血管壁中的粘附 和迁移会使缺氧/酸中毒诱导的损伤降低，而没有随后的引起血管的永久性损伤的炎性反应。本发明的化合物的内皮稳定化效应还阻止水肿的形成以及对于经各自的血管供血的器官的进一步损伤。用于治疗和/或预防由代谢疾病或衰老过程造成的动脉硬化的药学药物具有复 原和/或预防效应，因为该药学药物抑制淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞迁移进入血 管壁，从而抑制由其造成的动脉硬化斑的进展(progredience)。根据本发明的药学药物还可用于运输另一种药物。本发明的药物特异性地结合内 皮细胞上的表面分子。因此，与其连接的药物可以以高浓度被输送到内皮细胞，而它们没有 在其它位点具有副作用的任何危险。在此可以例举的一个实例是使用抑制细胞分裂的物质 (其被特异性带至内皮细胞)可能具有抗血管生成效应。这会在肿瘤患者中带来复原效应， 因为肿瘤生长通过阻止内皮细胞的增殖并从而阻止血管新生而被阻断。本发明的化合物自 身还可以产生抗血管生成效应，因为，由于它们的内皮稳定化效应，它们阻止内皮细胞改变 为增殖表型，并因此阻止新的毛细血管的形成。因此，它们自身适合于治疗所有种类的肿瘤 疾病以及用于预防和/或治疗肿瘤转移。本发明的式(I)的化合物以及药学佐剂和添加剂可以配制进入药物制剂，其也是 本发明的主题。为了制备这样的制剂，将治疗上有效剂量的肽或肽衍生物与药学上可接受 的稀释剂、稳定剂、增溶剂、乳化辅助剂、佐剂或载体混合，并制成合适的治疗形式。这样的 制剂例如包含不同PH和离子强度的各种缓冲剂(例如This-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、去污剂 和增溶剂(例如吐温80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)和填充剂(例如乳酸、 甘露醇)的稀释物。这些制剂可以影响活性试剂的生物可用性和代谢行为。根据本发明的药物制剂可以通过口服、非肠道(肌内、腹膜内、静脉内或皮 下)、透皮或以适当的生物可降解的聚合物(例如聚乳酸(polylactate)或聚乙醇酸 (polyglycolate))的可蚀性植入物来给药。根据本发明的化合物的关于阻止RhoA激活并继而阻止内皮细胞的细胞骨架结构 改变的有效性可以例如通过包括下列步骤的方法来证明a.在至少一种测试化合物存在的情况下，将培养的内皮细胞的汇合层与凝血酶接 触；b.以裂解缓冲液将内皮细胞裂解；c.通过具体的测定法，优选通过所谓的“下拉(pull down)测定”来测定RhoA的活性。可以使用例如啮齿类中的急性肺炎模型证明体内有效性。急性肺炎是例如在小鼠 中通过气管内灌输细菌脂多糖(LPS)而引起的。通过测定肺部灌洗液中的注射进入动物的 埃文斯蓝的量或者通过测定肺部灌洗液中溢出的白细胞的数目来测定活性物质的效应。本 发明的化合物在0. OOlmg/kg体重至500mg/kg体重的剂量，优选在0. lmg/kg至50mg/kg的 剂量显示出有效。另一种证明体内生物学效应的可能方式是减少或完全抑制由于溶血性病毒或细 菌感染引起的死亡率。为此目的，使用例如一剂登革热病毒感染小鼠，其中50%的动物在感 染后5-20天的时间内死亡。在0. 001至500mg/kg体重的剂量，优选在0. 1至50mg/g体重 的剂量，本发明的化合物引起该死亡率的降低。以下实施例为了解释本发明而不是将其限制到实施例。
根据本发明的肽的一般性制备和纯化 上述肽衍生物的制备和纯化一般通过FMOC-策略使用商业可获得的批肽合成器 (在文献中也有描述，例如“solid phase peptide synthesi s-A practical approach “， Ε. Atherton, R. C. Sheppard, Oxford University press 1989)在酸不稳定的树脂载体上进 行。N-α-FMOC-保护的衍生物(通过酸敏感的保护基保护其官能侧链)用作氨基酸组分。 除非另有指明，否则使用水/乙腈梯度和0. 1 %的TFA作为离子配对剂通过RP-层析法进行 纯化。实施例1Gly-His-Arg-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-G Iy-Gly-Gly-Tyr-Arg-OH将IOOmg Tentagel (Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的装载量转移至商业可获得 的肽合成装置(PSMM(Shimadzu))，其中根据碳二亚胺/HOBt方法逐步构建肽序列。通过加入5倍等摩尔过量的二 _异丙基_碳二亚胺(DIC)、二 -异丙基-乙胺 (DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)将FMOC-氨基酸衍生物预激活，将它们转移进入反应管之 后，与树脂载体混合30分钟。通过加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分钟而进行洗涤步 骤。通过加入3χ 900 μ 1处于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分钟而进行切割步骤。通过迫使溶液通过反应管的底部玻璃料(frit)而除去各个反应液和洗涤液。应用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu、FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu) (Orpegen)。当合成完毕时，将肽树脂干燥。然后通过在室温以三氟乙酸/TIS/EDT/水(体积 比为95 2 2 1)处理2个小时切除肽酰胺。通过过滤、浓缩溶液并通过加入冰冷的 二乙醚进行沉淀而获得固体粗产物(75mg)。通过RP-HPLC，在KromasilRP-18250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60% 的乙腈 梯度，在40分钟内，以12ml/分钟的流速纯化肽，并在215nm通过UV检测器评价洗出液。通 过分析型RP-HPLC和质谱法确定单个组份的纯度。将纯化的组份合并并冻干后，获得48mg 纯产物，Maldi-TOF, 2283. 7m/z (m. i.)。实施例2Gly-His-Arg-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-G Iy-Gly-Gly-Tyr-Arg-NH2将IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的装载量转移至商业 可获得的肽合成装置(PSMM(Shimadzu))，其中根据碳二亚胺/HOBt方法逐步构建肽序列。通过加入5倍等摩尔过量的二 _异丙基_碳二亚胺(DIC)、二 -异丙基-乙胺 (DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)将FMOC-氨基酸衍生物预激活，将它们转移进入反应管之 后，与树脂载体混合30分钟。通过加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分钟而进行洗涤步 骤。通过加入3χ 900 μ 1处于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分钟而进行切割步骤。通过迫使溶液通过反应管的底部玻璃料而除去各个反应液和洗涤液。应用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His(Trt)、FMOC-IIe, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro 禾口 FMOC-Ser (tBu)(Orpegen)0 当合成完毕时，将肽树脂干燥。然后通过在室温以三氟乙酸/TIS/EDT/水(体积 比为95 2 2 1)处理2个小时切除肽酰胺。通过过滤、浓缩溶液并通过加入冰冷的 二乙醚进行沉淀而获得固体粗产物(75mg)。通过RP-HPLC，在 Kromasil RP-18 250-20 上，10 μ m，0. 1 % TFA 中，以 5-60 % 的 乙腈梯度，在40分钟内，以12ml/分钟的流速纯化肽，并在215nm通过UV检测器评价洗出 液。通过分析型RP-HPLC和质谱法确定单个组份的纯度。将纯化的组份合并并冻干后，获 得 48mg 纯产物，Maldi-TOF, 2282. 6m/z (m. i.)。实施例3Gly-His-Arg-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-G Iy-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys- (S-琥珀酰亚胺-PEG·)-OH按照实施例1合成单体肽，使用Tentagel (Rapp Polymere)作为树脂载体，以 FMOC-Cys (Trt)作为第一个氨基酸。在切割和纯化肽之后，以2-至8-倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2cik进行反应。回 收之后，在Kromasi 1 RP-18上进行纯化，通过分析型RP-HPLC和MALDI-MS确认产物的特性。实施例4Gly-His-Arg-Pro-Leu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-IIe-Ser-G Iy-Gly-Gly-Tyr-Arg-Cys- (S-琥珀酰亚胺-PEG2qk)-酰胺将IOOmg Tentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以 0. 24mmol/g 的装载量转移至商业 可获得的肽合成装置(PSMM(Shimadzu))，其中根据碳二亚胺/HOBt方法逐步构建肽序列。通过加入5倍等摩尔过量的二 _异丙基_碳二亚胺(DIC)、二 -异丙基-乙胺 (DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)将FMOC-氨基酸衍生物预激活，将它们转移进入反应管之 后，与树脂载体混合30分钟。通过加入5次900 μ 1 DMF并充分混合1分钟而进行洗涤步 骤。通过加入3χ 900 μ 1处于DMF中的30%的哌啶并充分混合4分钟而进行切割步骤。通过迫使溶液通过反应管的底部玻璃料而除去各个反应液和洗涤液。应用氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、 FMOC-His (Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)禾口 FMOC-Cys(Trt)(Orpegen)。在切割和纯化肽之后，以2-至8-倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2qk进行反应。回 收之后，在Kromasi 1 RP-18上进行纯化，通过分析型RP-HPLC和MALDI-MS确认产物的特性。实施例5在人类脐带静脉血内皮细胞(HUVEC)培养物中凝血酶诱导的RhoA激活模型中证 明了化合物的生物学效应。在标准条件下使HUVEC生长至汇合。在诱导Rho活性之前，使用不含生长因子和 血清补充物的IMDM(Gibco)使HUVEC饥饿4个小时。饥饿期之后，向饥饿培养基中加入 5U/ml凝血酶(Calbiochem)或5U凝血酶+50 μ g/ml测试化合物，持续1、5和10分钟。根 据生产商的说明书，使用来自Upstate的Rho测试试剂分离活性RhoA。将分离物在15% 的聚丙稀酰胺凝胶上分开并点印到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。使用来自Upstate的 抗-Rho (-A、-B、-C)克隆 55(1 500)检测 RhoA。
与未经刺激的对照相比，相对RhoA刺激是对照肽1分钟1对照肽5分钟1对照肽10分钟1凝血酶5分钟2.6凝血酶+实施例1的化合物(10分钟)1 .权利要求
1.下列通式I的肽及其衍生物，和其生理上可接受的盐 &N-GHRP)(1)(2P)(3X4X5PX6PPPX7X8X9X1。B (I)B (2) B (3)-X11 (I)， 其中B(I)代表化学键或氨基酸G ； B (2)代表化学键或氨基酸Y; B (3)代表化学键或氨基酸R ； X1-Xio代表20种遗传编码的氨基酸中的一种，X11代表OR1, R1 =氢或(C1-Cltl-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同，且代表氢、 (C1-C10)-烷基，或残基-PEG5_6(IK，其中PEG-残基通过间隔子与N原子连接，或残基 NH-Y-Z-PEG5_6QK，其中Y代表化学键或选自S、C、K或R的遗传编码的氨基酸，和 Z代表间隔子，通过该间隔子可连接聚乙二醇(PEG)-残基。
2.通式I的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的盐，其中 B(l), B (2)和B (3)具有如上所述的含义，X” X3J4J8 代表 L、I、S、M或A，X5代表R或K，x2、)(6代表 A、G、S 或LX7代表I、L或V，并且其中X9> X10和A1具有如上定义的相同的含义。
3.通式II的肽和肽衍生物，及其生理上可接受的盐， H2N-GHRPLAPSLRPAPPPISGG"B(I)-B(2)-B(3)-X11 (II)， 其中X11具有如上通式I中定义的相同的含义。
4.通式(II)的化合物，及其生理上可接受的盐，其中X11代表NR2R3，R2和R3相同或不同，且为氢或(C1-Cltl)-烷基，或残基C (NR2R3) - (S-琥珀 酰亚胺)-(PEG5_4CIK)，琥珀酰亚胺残基通过C原子3与半胱氨酸残基的硫原子连接。
5.通式(I)的化合物的生产方法，其特征在于下列任一项(E)将各序列的C末端的第一个氨基酸通过合适的可切割的间隔子连接至聚合物树 脂，随后的氨基酸，任选含有合适的官能团保护基，通过本领域已知的方法逐步连接，根据 本领域已知的合适的方法将完成的肽从聚合物树脂上切割下来，如果存在保护基，则通过 合适的方法将其切除，根据合适的方法纯化肽或肽衍生物，或(F)将具有想要的分子量的PEG基团通过合适的间隔子连接至聚合物树脂，使用合适 的方法将肽的N末端的第一个氨基酸连接，其余的步骤与(A)中的描述相同，或(G)使用合适的方法将在氨基上含有合适的保护基的赖氨酸残基连接至合适的聚 合物树脂，如(A)中的描述合成肽链，然后从聚合物树脂上切除并纯化，如果需要，使用合 适的方法切除氨基上的保护基，使用适当激活的试剂将具有想要的分子量的PEG基团 连接至ε -氨基，切除任选地剩余的保护基，使用合适的方法纯化最终的产物，或(H)将含有半胱氨酸残基的肽与PEG-马来酰亚胺反应以形成式(II)的化合物。
6.药物组合物，其含有通式(I)的化合物。
7.通式(I)的化合物的医药用途。
全文摘要
下列通式(I)的肽及其衍生物，及其生理上可接受的盐H2N-GHRPX1X2PX3X4X5PX6PPPX7X8X9X10B(1)B(2)B(3)-X11，其中B(1)代表化学键或氨基酸G；B(2)代表化学键或氨基酸Y；B(3)代表化学键或氨基酸R；X1-X10代表20种遗传编码的氨基酸中的一种，X11代表OR1，R1＝氢或(C1-C10-烷基)，或NR2R3，R2和R3相同或不同且代表氢、(C1-C10)-烷基，或残基-PEG5-60K，其中PEG-残基通过间隔子与N原子连接，或残基NH-Y-Z-PEG5-60K，其中Y代表化学键或选自S、C、K或R的遗传编码的氨基酸，Z代表间隔子，通过该间隔子可连接聚乙二醇(PEG)-残基。
文档编号C07K14/75GK102083857SQ200980118358
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月21日 优先权日2008年5月15日
发明者P·佩策尔鲍尔, R·亨宁, S·赖因格鲁贝尔, W·帕斯特纳 申请人:菲布雷克斯医疗研究及开发有限责任公司