专利名称：环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体的制 备方法及应用。
背景技术：
环丙沙星(Ciprofloxacin，CPF)，其分子式为C17H18O3N3F,分子量为385. 82，为白色
或类白色的结晶性粉末，味苦，其结构式如式(I)所示环丙沙星为第三代喹诺酮类(FQs)的典型代表之一，具有抗菌谱广，毒副作用小， 血药浓度高，半衰期长，制剂形式多样，药效价格比高等特点，对各种革兰氏阴性和阳性菌 均具有强大的抑菌作用，与青霉素、头孢菌素和氨基类药物均无交叉耐药性等特点，对于治 疗炭疽热病症具有特效作用。FQs药物因其能抑制细菌DNA螺旋酶、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌 作用是磺胺类药的近千倍，加之系化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中很快取得 广泛应用，尤其在水产养殖中成为最重要的抗感染药物之一。由于致病菌产生耐药性和某 些潜在的致癌性质，其残留问题已引起广泛关注。美国和欧盟规定在禽食用组织中方的最 高残留限量为环丙沙星和环丙沙星为30μ g/Kg ；我国农业部标准NY5070-2001《无公害食 品水产品中渔药残留限量》规定环丙沙星和环丙沙星残留限量为50 μ g/Kg。FQs药物对动物体以及人体的绝大部分器官和组织都有不同程度的不良反应由 于FQs药物呈脂溶性，可通过血脑屏障进入脑组织，抑制□-氨基丁酸(GABA)与其受体结 合而产生神经系统反应。故以神经系统的损伤最为常见，其次是皮肤及其附件的损伤。多 数不良反应症状较轻，且可逆，但也有较重甚至危及生命的。动物实验表明，FQs药物可引 起幼畜关节炎、跟键炎，也能引起过敏性休克，恶心、呕吐，静脉炎等症状。对畜禽水产品中环丙沙星残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相 等仪器检测方法。然而应用仪器方法时，其灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大， 测定方法复杂、繁琐，检测通量小，需要培养专业人员进行检测，检测成本昂贵，不能实现大 批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简 单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。
(I )
人工抗原的合成是半抗原物质免疫分析方法建立的的关键，对于环丙沙星，因为 其本身含有羧基，不需要衍生，因此目前都是直接利用该羧基和蛋白质连接。譬如，李岩松 等发表了论文“环丙沙星单克隆抗体制备、纯化及鉴定”(中国卫生检验杂志，2008)，采用碳 二亚胺法，直接偶联羧基和蛋白质的氨基合成了环丙沙星人工抗原；顾黎等发表了论文“环 丙沙星单克隆抗体的制备和性质鉴定”(科技通报，2010)，同样采用碳二亚胺法，直接偶联 羧基和蛋白质的氨基；杨先乐等公开了一项专利“一种环丙沙星免疫原的制备方法(申请 号200810037474. 8) ”，采用碳二亚胺法将环丙沙星和载体蛋白偶联。尚未见有研究者在目 标物环丙沙星和载体蛋白间使用手臂的报导。寻找新的环丙沙星半抗原与人工抗原并获得高特异性抗体应用于免疫检测，使得 环丙沙星的检测能达到灵敏度高、特异性强，适宜于进行现场检测的目的，具有十分重要的
眉、O
发明内容
本发明的一个目的是填补环丙沙星现有检测技术的不足，提供一种环丙沙星人工 半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供所述环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆 抗体的制备方法。本发明还有一个目的是提供所述环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆 抗体的应用。本发明的目的通过以下技术方案予以实现提供一种环丙沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体，所述环丙沙星人 工半抗原具有式(II)所示分子结构
权利要求
一种环丙沙星人工半抗原，其特征在于是以环丙沙星与氨基丁酸或氨基己酸在NHS、DDC和DMF存在条件下反应制备得到，所述半抗原含4个或6个碳原子手臂，具有式(II)所示分子结构其中，n为 CH2基团数目，n＝4或6。FSA00000234628100011.tif
2.根据权利要求1所述环丙沙星人工半抗原，其特征在于η= 4。
3.—种权利要求1或2所述环丙沙星人工半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)按投料摩尔比为1 1 1将环丙沙星、N-羟基基琥珀酰亚胺和脂溶性碳二亚胺 置于反应容器中，并将上述混合物用少量的DMF溶解，室温下避光搅拌过夜；(2)将经步骤(1)得到的反应物离心取上清得A液；取与环丙沙星等摩尔量的氨基丁酸或氨基己酸溶于少量蒸馏水中，得B液；(3)将B液缓慢加到A液中，室温搅拌过夜，离心取上清液，调节上清液ρΗ值为碱性，将 析出的沉淀过滤，收集上清液；(4)将步骤(3)制得的调节上清液ρΗ值至酸性，收集沉淀，得到环丙沙星半抗原。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述调上清液为碱性是将上 清液PH值调节为8. 0 8. 5 ；步骤(4)所述调上清液为酸性是将上清液ρΗ值调节为5. 0 6. 0。
5.一种环丙沙星人工抗原，其特征在于是将权利要求1或2所述环丙沙星半抗原与蛋 白质偶联制备得到，具有式(III)所示分子结构
6.一种权利要求5所述环丙沙星人工抗原的制备方法，其特征在于采用活泼脂法将环 丙沙星半抗原与蛋白质偶联。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将等摩尔的所述的环丙沙星半抗原、DDC、NHS溶解于DMF中，室温避光反应过夜；(2)将步骤(1)所得反应物离心取上清液，将上清液加入到含有载体蛋白的硼酸缓冲 液中，混合物反应过夜；(3)待步骤(2)反应完成后，将反应后混合液透析得到所述人工抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述硼酸缓冲液为硼酸-硼 酸钠缓冲液，PH 9.0，100福；所述载体蛋白为85六或^^，载体蛋白的浓度在20 3011^/1^ ； 所述反应温度为4°C。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述透析采用0.9%的生理 盐水透析3天，每天更换换透析液3 5次。
10.一种权利要求5所述抗原的应用，其特征在于应用于制备环丙沙星抗体或环丙沙 星免疫检测方面。
全文摘要
本发明提供了一种环丙沙星半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以环丙沙星为原料，与氨基丁酸或氨基己酸反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原；通过活泼脂法将半抗原与蛋白质偶联制备得到人工抗原；将人工抗原免疫小鼠，采用细胞融合技术制得对环丙沙星高特异性的单克隆抗体。采用本发明单克隆抗体建立免疫检测可用于环丙沙星现场快速检测，对实现畜禽水产品中环丙沙星残留的快速检测具有重要现实意义。
文档编号C07K16/44GK101962358SQ201010256939
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者孙远明, 张挺, 杨金易, 沈玉栋, 王弘, 雷红涛 申请人:华南农业大学