Muc1抗体的制作方法

专利名称：Muc1抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于抗体领域。特别地，提供了显示出改进的抗原结合和/或识别的改进的抗mucin抗体以及用于改进抗mucin抗体的抗原结合和/或识别的方法。在具体的实施方案中，本发明涉及改进的抗-MUCl抗体，其可用于癌症的治疗。
背景技术：
如今，抗体是医药和研究领域中广泛使用的试剂。在医药中，它们在许多不同的领域中都有应用。例如，抗体被用作检测某些标志物的标记试剂，这允许疾病的诊断和/或预后或测定特定的身体参数(例如某些激素的存在或浓度)。此外，在各种疾病的治疗和预防中，抗体也被用作治疗剂，所述疾病为例如癌症、 心血管疾病、炎性疾病、黄斑变性、移植排斥、多发性硬化和病毒感染。在这些治疗中，抗体可本身具有治疗活性，例如通过阻碍受体或信使分子、从而抑制它们的疾病相关的功能，或者通过募集和活化患者免疫系统的组分。备选地，抗体可与具有治疗活性的另一种试剂相偶联。特别是在癌症和感染的治疗中，所述其它的试剂具有细胞杀伤活性并且可以是例如放射性同位素或细胞毒素。在另一个应用中，可通过将合适的抗体转移到患者的循环系统中而将抗体用于被动免疫。通过将抗原注射到哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊或马)中而产生特异性的抗体。从这些动物分离的血液在血清中含有针对所述抗原的多克隆抗体。为了获得特异于抗原的单一表位的抗体，从动物中分离了分泌抗体的淋巴细胞并通过将它们与癌细胞系融合而使其永生化，产生杂交瘤细胞。然后通过进行稀释克隆来分离单个的杂交瘤细胞，以产生均产生相同的单克隆抗体的细胞克隆。然而，在治疗应用中这些单克隆抗体具有这样的问题它们源自动物生物体并且在其氨基酸序列方面区别于人抗体。因此，人免疫系统将这些动物抗体识别为外来的并将它们从循环中快速去除。此外，可引起全身性炎性效应。此问题的解决方案是用人抗体的相应部分替换单克隆抗体的某些恒定部分。如果仅替换了重链和轻链恒定区，就获得了嵌合抗体，而进一步替换重链和轻链可变区的框架区产生了所谓的人源化抗体。在研究中，纯化的抗体用于许多应用中。它们最常用于鉴别和定位生物学分子，例如特别是蛋白质。生物学分子可在分离后被检测，例如用于确定它们的存在、浓度、完整性或大小。另一方面，它们可在细胞或组织样品中被检测，例如用于确定其存在或位置。此外， 抗体被用于特定生物学物质(特别是蛋白质)的分离程序中，其中抗体将目的生物学物质从含有它的样品中特异性地分离。在所有这些应用中，对抗原的紧密结合和特异性识别对于所使用的抗体而言是至关重要的。由此获得了更高的活性和更少的交叉反应性，特别是在治疗应用中获得了更少的不良副作用。然而，在单克隆抗体的人源化过程中，通常降低了经工程化的抗体的亲和力和特异性。有趣且重要的抗体组是针对mucin蛋白的那些。Mucin是脊椎动物中由许多上皮组织产生的高分子量、严重糖基化的蛋白家族。它们可被细分为膜结合的mucin蛋白(由于存在有利于保留在质膜中的疏水性跨膜结构域)和被分泌到粘膜表面上或被分泌以成为唾液的组分的mucin。人mucin蛋白家族由至少下列家族成员组成MUC1，MUC2，MUC3A， MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUCl2，MUCl3，MUCl5，MUC16，MUCl7，MUC19 和MUC20 ；其中MUCl，MUC3A (亚型1)，MUC3B和MUC4是膜结合的。增加的mucin生产发生在许多腺癌中，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等。Mucin也在肺疾病中过表达，所述肺疾病为例如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病或囊性纤维化。关于两种膜muCin(MUCl和MUC4)在疾病进程中的病理学意义，已对其进行了广泛研究。此外，还就mucin作为诊断标志物的潜在可能性对其进行着研究。数种针对mucin蛋白(特别是MUC1)的抗体是本领域中已知的。其中的一些已被批准用于医药应用。然而，如果能够提高它们的抗原亲和力和/或特异性，其应用仍可被改进。鉴于此，本领域中需要提供改进的抗mucin抗体，其优选具有提高的抗原结合和/ 或识别特性；还需要适合用于改进已知抗体(特别是治疗性MUCl抗体)的抗原结合和/或识别的方法。发明概述当前的发明者发现了如果根据Kabat编号，脯氨酸残基存在于抗体重链可变区的第观位，则针对mucin蛋白的抗体的抗原结合特性良好。因此，在第一个方面，本发明涉及能够结合mucin蛋白且包含重链可变区的至少一部分的抗体或者其片段或衍生物，所述重链可变区的至少一部分根据Kabat编号在第观位氨基酸包含脯氨酸残基。在第二个方面，本发明提供编码根据本发明的抗体或者其片段或衍生物的核酸。 此外，在第三个方面提供了包含根据本发明的核酸以及与所述核酸可操作地连接的启动子的表达盒或载体，并且在第四个方面提供了包含根据本发明的核酸或表达盒或载体的宿主细胞。在第五个方面，本发明涉及包含根据本发明的抗体或者其片段或衍生物、根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒或载体、或者根据本发明的宿主细胞的组合物。根据第六个方面，本发明提供了根据本发明的抗体或者其片段或衍生物、核酸、表达盒或载体、宿主细胞或组合物用于医药，特别是用于治疗、预后、诊断和/或监测癌症，其中所述癌症优选选自结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、血癌、肺癌和卵巢癌。在第七个方面，本发明涉及用于改进能够结合mucin蛋白且包含重链可变区的抗体或其片段或衍生物的抗原结合和/或识别的方法，所述方法包括根据Kabat编号在重链可变区的第观位提供脯氨酸残基的步骤。在第八个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的核酸的方法，所述方法包括下列步骤(a)提供包含编码能够结合MUCl且包含重链可变区的抗体或者其片段或衍生物的核酸序列的核酸，其中所述重链可变区根据Kabat编号在第观位氨基酸不包含脯氨酸残基；(b)根据Kabat编号，向编码重链可变区的第观位氨基酸的密码子中引入突变，从而所述密码子编码脯氨酸残基。
从下文的描述和所附的权利要求，本发明的其它目的、特征、优势和方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应该理解，表明本申请的优选实施方案的下文的描述、所附的权利要求和具体实施例，仅是通过例举的方式给出。通过阅读下文，在所公开的发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员而言将变得非常显而易见。发明详述定义如本文中所使用的，下面的表述通常意在优选地具有如下所示的含义，除非其所用于的上下文另有所指。如本文中所使用的，表述“包含”除了其字面含义之外，还包括并特别指表述“基本上由...组成”和“由...组成”。因此，表述“包含”指这样的实施方案，其中“包含”特别列出的元素的主题不包含其它的元素；表述“包含”还指这样的实施方案，其中“包含”特别列出的元素的主题可以和/或的确涵盖其它的元素。同样地，表述“具有”将被理解为表述 “包含”，其也包括并特别指表述“基本上由...组成”和“由...组成”。术语“抗体”特别指蛋白，其包含通过二硫键连接的至少两条重链和两条轻链。术语“抗体”包括天然存在的抗体以及抗体的重组形式，例如在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体、人源化的抗体和嵌合抗体。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区 (CH)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链恒定区包含三个或(在IgM 型或IgE型抗体的情况下)四个重链恒定结构域(CH1，CH2，CH3和CH4)，其中第一恒定结构域CHl邻近可变区并且可通过铰链区与第二恒定结构域CH2相连。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区还可被进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有更为保守的区域(称为框架区(FR))，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分 (Clq))的结合。然而，根据本发明的术语“抗体”也包括不常见的抗体，例如重链抗体(即仅由一个或多个(特别是两个)重链构成的抗体)和纳米抗体(即仅由单一的单体可变结构域构成的抗体)。为了表明重链和轻链可变区的氨基酸位置，在本申请中使用了 Kabat编号系统(Kabat, Ε. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thedition，NIH Publication No. 91-3242)。根据所述系统，重链包含0位至113位的氨基酸位置，包括位置;35A、;35B、52A至52C，82A至82C和100A至100K。根据Kabat编号，重链可变区的⑶R位于位置31至35B (⑶Rl)、50至65 (⑶似)和95至102 (⑶R3)。剩余的氨基酸位置形成框架区FRl至FR4。轻链可变区包含位置0至109，包括位置27A至27F、95A 至 95F 和 106A。CDR 位于位置 M 至 34 (CDRl)，50 至 56 (CDR2)和 89 至 97 (CDR3)。取决于抗体的特定基因的起初形成，在给定的重链可变区或轻链可变区中不是必须存在所有这些位置。当在本文中提及重链或轻链可变区中的氨基酸位置时，除非另有所指，其是指根据 Kabat编号的位置。抗体的“片段或衍生物”特别是这样的蛋白或糖蛋白，其衍生自所述抗体并且能够作为抗体结合相同的抗原，特别是结合相同的表位。因此，在本文中抗体的片段或衍生物通常是指有功能的片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，抗体的片段或衍生物包含重链可变区。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段或其衍生物实行。抗体的片段或衍生物的实例包括(i)Fab片段，其为由各重链和轻链的可变区及第一恒定结构域组成的单价片段；(ii) F(ab)2片段，其为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由重链的可变区和第一恒定结构域CHl组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的重链和轻链可变区组成；(ν) scFv片段，其为由单一多肽链组成的Fv片段；(vi) (Fv)2片段，其由共价连接在一起的两个Fv片段组成；(vii)重链可变结构域；以及(viii) 多体，其由以下述方式共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成重链与轻链可变区的缔合仅可发生在分子间而不发生在分子内。这些抗体片段和衍生物是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的。例如，如果靶氨基酸序列在其全长中与参考氨基酸序列的相应部分享有至少 60 %，优选至少70 %，至少75 %，更优选至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少93 %，至少 95%或至少97%的同源性或同一性，则靶氨基酸序列"衍生自"参考氨基酸序列。例如，如果人源化抗体的框架区衍生自特定的人抗体的可变区，则所述人源化抗体的框架区的氨基酸在其全长上与人抗体的相应框架区享有至少60 %，优选至少70 %，至少75 %，更优选至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少93 %，至少95 %或至少97 %的同源性或同一性。“相应部分”或“相应框架区”是指，例如，靶抗体重链可变区的框架区I(FRHl)相应于参考抗体重链可变区的框架区1。这同样适用于例如，？冊2，？冊3，？冊4，？扎1，？扎2，？扎3和？扎4。在特定的实施方案中，“衍生自”参考氨基酸序列的靶氨基酸序列在其全长上与参考氨基酸序列的相应部分100%同源或特别是100%同一。“特异性结合”优选是指试剂(例如抗体)对于其所特异于的靶标(例如表位)的结合比与另一靶标的结合更强。如果试剂与第一靶标的结合所具有的解离常数(Kd)低于与第二靶标结合的解离常数，则所述试剂与第一靶标的结合比与第二靶标的结合更强。优选地，与对于试剂所非特异性结合的靶标的解离常数相比，对于试剂所特异性结合的靶标的解离常数为多于2倍，优选多于5倍，更优选多于10倍，甚至更优选多于20倍，50倍，100 倍，200倍，500倍或1000倍更低。如本文中所使用的，术语“蛋白”是指氨基酸的分子链或多于一个氨基酸链的复合物。蛋白可含有任何天然存在的氨基酸以及人工氨基酸，并且可以是生物学或合成来源的。 蛋白可以通过例如糖基化、酰胺化、羧化和/或磷酸化作用而经修饰(天然地(翻译后修饰)或合成地)。蛋白包含至少两个氨基酸，但是不必为任何特定的长度；此术语不包括任何大小限制。在本申请中，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换地使用。优选地，蛋白包含至少10个氨基酸，优选至少50个氨基酸，至少100个氨基酸且最优选至少100个氨基酸。术语“核酸”包括单链和双链核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。其可包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且可以是经天然或合成地修饰的，例如通过甲基化作用，5’ -和 /或3’ -加帽。术语“缀合物”特别指连接在一起的两种或更多种化合物，从而每种化合物的至少一些性质保留在缀合物中。可通过共价键或非共价键实现连接。优选地，缀合物的化合物是通过共价键连接的。缀合物的不同化合物可通过化合物的原子之间的一个或多个共价键彼此直接结合。备选地，化合物可通过连接子分子彼此结合，其中所述连接子与化合物的原子共价连接。如果缀合物由多于两种化合物构成，那么这些化合物可例如以链构象被连接，其中一个化合物连接至下一个化合物，或者数个化合物各可与一个中央化合物连接。术语“表达盒”特别指核酸构建体，其能够使其中所引入的编码核酸序列能够表达并且能够调控其表达。表达盒可包含启动子、核糖体结合位点、增强子和其它调控基因的转录或mRNA的翻译的控制元件。表达盒的确切结构可根据物种或细胞类型而变化，但是通常包含5’ -未转录序列以及5’ -和3’ -未翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，例如 TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更特别地，5’ -未转录表达控制序列包含启动子区域，其包括用于转录控制可操作地连接的核酸的启动子序列。表达盒还可包含增强子序列或上游激活子序列。根据本发明，术语“启动子”指位于待表达的核酸序列上游(5’ )并通过提供RNA 聚合酶的识别和结合位点而控制所述序列的表达的核酸序列。“启动子”可包括用于参与调控基因转录的其它因子的其它识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“可诱导的”(即响应于诱导剂而起始转录)，或者可以是“组成型的”(如果转录不是由诱导剂控制的)。如果不存在诱导剂，则在诱导性启动子控制之下的基因不表达或仅少量表达。存在诱导剂时，基因被开启或者转录的水平增加。通常，这是由特定转录因子的结合介导的。术语“载体”以其最通常的含义用于本文并且包括任何用于核酸的中介性媒介，其使得所述核酸能够例如被引入原核和/或真核细胞，且(合适的时候)被整合到基因组中。 此类载体优选在细胞中被复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。 如本文中所使用的，术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常为环形的DNA 双链体，其可独立于染色体DNA而复制。根据本发明，术语“宿主细胞”指可以外源核酸被转化或转染的任何细胞。根据本发明的术语“宿主细胞”包括原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选的是哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可源自多个组织类型并且包括原代细胞和细胞系。 核酸可以单一拷贝或者两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，其在宿主细胞中表达。根据本发明的术语“患者”是指人类、非人灵长类动物或另一种动物，特别是哺乳动物(例如母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))。在特别优选的实施方案中，患者是人类。根据本发明的术语“癌症”特别包括白血病，精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、 神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、 脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌以及它们的转移。其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌、或上述癌症类型或肿瘤的转移。 根据本发明的术语癌症也包括癌症转移。“肿瘤”指通过失调的细胞增殖而形成的细胞组或组织。肿瘤可显示部分或完全缺乏结构组织和与正常组织的功能性协调，并且通常形成不同的组织团，其可以是良性的或恶性的。“转移”是指癌细胞从其原始的位点到身体另一部分的散播。转移的形成是非常复杂的过程并且通常涉及癌细胞从原发肿瘤脱离、进入身体的循环系统以及安顿下来以在身体其它地方的正常组织内生长。当肿瘤细胞转移时，新的肿瘤被称为继发性或转移性肿瘤， 并且其细胞通常类似于原始肿瘤中的那些细胞。这表示，例如，如果乳腺癌转移到肺，继发性肿瘤是由异常的乳腺细胞、而非异常的肺细胞构成的。肺中的肿瘤就被称为转移的乳腺癌，而非肺癌。术语“药物组合物”特别是指适于向人或动物施用的组合物，即含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或者其盐或前药，以及载体、稀释剂或药物赋形剂，例如缓冲剂、防腐剂和张力修饰剂。本发明基于这样的发现，根据Kabat编号在重链可变区(VH)中第观位氨基酸处包含脯氨酸残基的抗mucin抗体显示出良好的抗原结合特性。重链可变区的第观位氨基酸位于互补决定区I(OTRl)附近的第一框架区(FRl)中。通常，在人类抗体中，苏氨酸或丝氨酸残基位于此位置。例如，NCBI数据库中所列出的抗体的2 个人种系序列均在重链可变区的第洲位包含苏氨酸或丝氨酸残基。特别地，在单克隆抗体的人源化中，本领域通常所教导的是在重链可变区的第观位使用苏氨酸或丝氨酸残基。基于所获得的数据，看来VH的第观位的脯氨酸有利地影响CDRl的结构特性。特别地，所述脯氨酸残基明显使得⑶Rl能够采取最匹配MUCl抗原的结构的三维结构。由此， 可改进抗体的特性。鉴于这些发现，在第一个方面，本发明提供了抗体或其片段或衍生物，其能够结合 mucin蛋白并且包含重链可变区的至少一部分，所述重链可变区的至少一部分根据Kabat 编号在第观位氨基酸包含脯氨酸残基。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体或其片段或衍生物所包含的重链可变区的一部分具有的长度为至少50个氨基酸、优选至少70个氨基酸、至少90个氨基酸、至少 100个氨基酸或至少110个氨基酸。更优选地，所述重链可变区的一部分至少包含整个框架区1和至少一个、优选两个或全部三个⑶R。最优选地，根据本发明的抗体或其片段或衍生物包含完整的重链可变区，其根据Kabat编号在第观位氨基酸处包含脯氨酸残基。根据本发明的抗体或者其片段或衍生物可能能够特异性结合mucin家族的一个或多个蛋白，例如 MUC1，MUC2，MUC3A，MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6，MUC7，MUC8，MUC12， MUC13，MUC15，MUC16，MUC17，MUC19，和/或MUC20。优选地，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物能够特异性结合一个或多个膜结合的mucin MUCl，MUC3A(同种型1)，MUC!3B和MUC4， 最优选MUCl。在优选的实施方案中，其特异性结合肿瘤相关的MUCl但是不结合或以少得多的程度结合正常、非肿瘤细胞的MUC1。特别地，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物结合 MUCl的细胞外结构域，优选其串联重复，最优选以依赖于构象和/或依赖于糖基化的方式结合，特别是如果所述串联重复在苏氨酸残基处以下列糖基化N-乙酰半乳糖胺(Tn)，唾液酰α 2-6Ν-乙酰半乳糖胺(sTn)，半乳糖β 1_3Ν_乙酰半乳糖胺(TF)或半乳糖β 1_3 (唾液酰α2-6)Ν_乙酰半乳糖胺(sTF)，优选以Tn或TF。优选地，糖部分通过α-0-糖苷键结合于苏氨酸残基。特别优选的根据本发明的抗mucin抗体是能够特异性结合包含肽部分的表位的抗体。所述表位优选是糖基化的肽部分并且抗体的特异性结合优选依赖于表位的糖基化， 特别依赖于表位的特定糖基化模式。即，在优选的实施方案中，与不携带糖部分的表位相比，如果抗体所结合的特定表位携带糖部分，则抗体与其抗原的结合亲和力更高。在另一个优选实施方案中，与携带另一个糖部分或不携带糖部分的表位相比，如果mucin蛋白上的表位携带特定的糖部分，则亲和力更高。在这种情形中，与其中表位携带另一个糖部分的抗原的亲和力可能甚至低于与具有非糖基化表位的抗原的亲和力。在这些实施方案中，抗体所结合的表位可包含肽部分以及糖部分。即，抗体与肽部分及糖部分结合。然而，抗体可备选地仅结合肽部分。在这一实施方案中，抗体不结合与肽表位相连的糖部分。然而，糖部分仍可对抗体结合有影响，这在于其影响表位的肽部分的三维结构。 此处，表位的灵活性和三维结构取决于是否与糖部分结合，以及优选地与哪个糖部分结合。 然后，所述抗体优选结合具有当糖部分(特别是特定的糖部分)与表位结合时所采取的三维结构的表位。在上面的实施方案中，当与表位结合时引起抗体增强的结合的特定糖部分优选为N-乙酰半乳糖胺(Tn)，唾液酰α 2-6Ν-乙酰半乳糖胺(sTn)，半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)或半乳糖β 1-3(唾液酰α 2-6) N-乙酰半乳糖胺(sTF)，优选Tn或TF。优选地，糖部分通过α-0-糖苷键与肽部分结合。因此，在其它的实施方案中，抗体与其表位的特异性结合取决于表位的构象。如上文中所描述的，表位的构象可取决于表位的糖基化模式。然而，构象还可取决于表位被呈递的情境，例如包含所述表位的蛋白的总体三维结构。本质上，如果抗体与表位的结合是构象依赖性的，则表位能够采取不同的三维构象并且与对表位的其它构象相比，抗体对表位的一种或多种构象的结合亲和力更高。特别地，抗体仅在表位显示出特定构象时才能够结合所述表位。在特别优选的实施方案中，抗体能够特异性结合包含氨基酸序列PDTR(SEQ ID NO 49)或更优选PDTRP (SEQ ID NO 50)的表位。与这种表位的结合优选是糖基化依赖性的，如上文所述，其中特别地，如果糖部分分别与序列PDTR或PDTRP的苏氨酸残基相连，则结合增加。优选地，如果表位在苏氨酸残基处以选自下列的糖部分糖基化，则结合增加 N-乙酰半乳糖胺(Tn)，唾液酰α 2-6Ν-乙酰半乳糖胺(sTn)，半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺 (TF)和半乳糖β 1-3 (唾液酰α 2-6) N-乙酰半乳糖胺(sTF)，优选以Tn或TF。优选地，糖部分通过α-0-糖苷键与苏氨酸残基结合。在一些实施方案中，结合的糖基化依赖性是由于被糖基化时表位所采取的特定构象，特别是被上文所提及的特定糖部分糖基化时。在这种情形中，抗体不必结合糖部分而可仅与表位的肽部分结合，其中此结合的亲和力取决于表位的构象。优选地，所述表位被包含于mucin蛋白(特别是MUC1)的细胞外串联重复中。特别地，根据本发明的抗体能够结合肿瘤相关的mucin表位，特别是肿瘤相关的MUCl表位，例如表位 TA-MUCl (见 Karsten，U.et al. (2004) Glycobiology 14，681_692and Danielczyk, A. et al. (2006)Cancer Immunol. Immunother. 55，1337-1347)。优选地，根据本发明的抗体与表达肿瘤相关MUCl表位的细胞的结合比与表达正常的非肿瘤MUCl的细胞的结合更强。 优选地，所述结合是至少1. 5倍更强、优选至少2倍更强、至少5倍更强、至少10倍更强或至少100倍更强。肿瘤相关的mucin表位，特别是MUCl肿瘤表位，优选是指这样的mucin蛋白(特别是MUC1)表位其存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上，和/或仅当其存在于肿瘤细胞上时才能被宿主循环系统中的抗体所接触，而当其存在于正常细胞上时不行。特别地， MUCl肿瘤表位优选为包含至少一个MUCl串联重复的PDTRP序列的表位并且在PDTRP序列的苏氨酸处以N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)(优选地通过α-O-糖苷键)被糖基化。对于肿瘤特异性MUCl结合，抗体或其片段或衍生物优选特异性结合经糖基化的MUCl肿瘤表位，从而与同相同长度和相同肽序列的非糖基化的肽的键相比，键的强度增加为至少2倍，优选4倍或10倍，最优选20倍。可例如使用ELISA来测量结合强度，其中靶表位被固定并且使用酶联的(特别是过氧化物酶联的)二抗和适合的检测剂来检测根据本发明的抗体或者其片段或衍生物的结合。示例性的结合测定在WO 2004/065423(例如实施例5. 1)中描述。此外，抗体可显示与参考抗体PankoMab相似的抗原结合特性，所述参考抗体 PankoMab包含具有氨基酸序列SEQ ID NO : 的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 30的轻链可变区。特别地，根据本发明的抗体可与PankoMab特异性地结合相同的抗原(优选相同的表位)，并且可优选以相当的亲和力分别结合所述抗原或表位。即，所述抗体优选以下述亲和力结合抗原或表位其具有的解离常数是PankoMab的最多100倍，更优选最多 10倍，最优选解离常数与PankoMab的解离常数相同或比其更低。此外，抗体优选显示与参考抗体PankoMab的交叉反应活性。特别地，如果以足够高的浓度存在，则抗体能够阻碍 PankoMab与MUCl的结合。当根据本发明的抗体已经与抗原MUCl相结合时，如果PankoMab 与MUCl的结合被阻碍，则这可以是可能的。对PankoMab的结合的抑制可以是由于，例如位阻(即根据本发明的抗体占据PankoMab为了适当地结合MUCl将需要的空间的一部分)，或构象阻碍(即由于根据本发明的抗体的结合，PankoMab的表位采取了对于PankoMab的结合不利的构象)。根据优选的实施方案，抗体具有下列特征(a)其特异性地结合糖基化的MUCl肿瘤表位，和(b)其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO 16的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO 28的轻链可变区；或者其为具有特征(a)和(b)的抗体的功能性片段或衍生物，所述功能性片段或衍生物显示与包含氨基酸序列SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 28的抗体的交叉特异性。上述关于根据本发明的抗体及其抗原和/或表位结合特性的实施方案可以根据本发明以相同的方式适用于其片段或衍生物。根据本发明的抗体优选是单克隆抗体。此外，所述抗体优选是，或衍生自，人、鼠、 山羊、灵长类动物或骆驼抗体。其可以是嵌合的或人源化的抗体。其可以是任何同种型或其亚类的抗体，特别是IgG, IgM, IgA, IgE或IgD同种型或其亚类(例如IgGl)的抗体。优选地，根据本发明的抗体的片段或衍生物选自Fab片段、F(ab)2片段、Fd片段、Fv片段、scFv 片段、(Fv)2片段和多体。抗体或其片段或衍生物可以是仅包含一个氨基酸分子的单链构建体，或者是包含多于一个氨基酸分子(优选共价地彼此连接，例如通过二硫键)的多链构建体。在某些实施方案中，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物以这样的方式被工程化其中所包含的重链可变区(VH)含有至少一个衍生自与剩余的VH的至少一部分所不同的抗体的⑶R。例如，VH包含至少一个⑶R，优选两个或三个⑶R，其衍生自一种抗体(例如小鼠、骆驼、山羊或灵长类动物抗体)；和至少一个FR，优选两个、三个或四个FR，其衍生自另一种抗体或抗体组，优选另一个物种的抗体，特别是来自人抗体。在这一实施方案中，抗体或其片段或衍生物还可包含轻链可变区(VL)。特别地，VL可衍生自VH的一个或多个⑶R 所衍生自的抗体，或者VL可以是这样的构建体其中一个、两个或三个CDR衍生自与VH的一个或多个CDR相同的抗体，而一个、两个、三个或优选所有四个FR源自相同的物种，特别是与VH的一个或多个FR相同的抗体或抗体组。此外，抗体或其片段或衍生物还可包含一个、两个、三个或四个重链恒定区(CH)和/或一个轻链恒定区(CL)，其优选源自相同的物种，特别是与可变区的FR相同的抗体或抗体组。在优选的实施方案中，可变区的FR和恒定区不是衍生自一个特定的抗体而是具有代表衍生自特定抗体组(例如人抗体组)的共有序列或另一种优选序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物是嵌合的并且包含衍生自一种抗体的一个或多个重链可变区和任选地轻链可变区，以及衍生自另一种抗体的一个或多个重链恒定区和任选地轻链恒定区。优选地，两种不同的抗体来自不同的物种，例如可变区衍生自鼠抗体而恒定区衍生自人抗体。根据本发明的抗体或者其片段或衍生物优选是糖基化的。在优选的实施方案中， 其具有人糖基化模式，即也在人体所产生的天然存在的抗体上发现的糖基化模式。此外， 抗体或其片段或衍生物可优选包括调节、特别是提高其一种或多种活性的糖基化模式。例如，糖基化模式可提高抗体、其片段或衍生物对于其特定表位的亲和力，和/或对于其下游受体(例如Fc受体、特别是Fc Y，Fca或Fc ε受体)的亲和力。此外或备选地，糖基化模式可提高其补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)。为此，抗体或其片段或衍生物的糖基化模式可被工程化或优化，例如通过使用能够产生所需糖基化模式的特定细胞系。此类细胞系为，例如Κ562，KGl，MUTZ-3，NM_F9[DSM ACC2606]，NM-D4 [DSM ACC2605]，NM-H9D8 [DSM ACC 2806]，NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807]，NM H9D8-E6Q12[DSM ACC 2856]和GT_2X[DSM ACC 2858] 因此，抗体或其片段或衍生物优选具有当在这些细胞系之一中表达时所提供的糖基化模式。根据本发明的抗体或者其片段或衍生物优选可用于医药，特别是疾病的治疗、诊断、预后和/或监测，所述疾病特别是如本申请中所描述的疾病，优选癌症。根据本发明的抗体或者其片段或衍生物所包含的重链可变区优选包括至少一个选自下组的⑶R 具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或2的⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID NO 3或4的⑶R2和具有氨基酸序列SEQ ID NO :5或6的⑶R3，优选至少包括具有氨基酸序列 SEQ ID NO 1的⑶R1。特别地，其可包括一组⑶R，其中⑶Rl具有氨基酸序列SEQ ID NO 1，⑶R2具有氨基酸序列SEQ ID NO :3且⑶R3具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，或者其中⑶Rl 具有氨基酸序列SEQ ID NO 2,⑶R2具有氨基酸序列SEQ ID NO :4且⑶R3具有氨基酸序列 SEQ ID NO :6ο根据一个实施方案，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物优选包括重链可变区，其具有选自下组的至少一个框架区具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:7(特别是SEQ ID NO 8)的FRl，具有氨基酸序列SEQ ID N0:9(特别是SEQ ID NO=IO)的FR2，具有氨基酸序列 SEQ ID NO :11(特别是SEQ ID NO 12)的FR3，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO :13(特别是SEQ ID NO 14)的FR4。特别优选的是存在具有氨基酸序列SEQ ID N0:8的FR1。因此， 重链可变区优选包含氨基酸序列SEQ ID N0:15，特别是SEQ ID NO :16。在其它的实施方案中，根据本发明的抗体或者其片段或衍生物衍生自包含一个或
2多个上述区段或序列的抗体。根据本发明的抗体或者其片段或衍生物还可包括至少一个其它的选自下组的互补决定区具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17或18的⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID N0:19或 20的⑶R2以及具有氨基酸序列SEQ ID NO 21或22的⑶R3，其中所述至少一个其它的互补决定区优选存在于轻链可变区内。特别地，抗体或其片段或衍生物优选包含一组⑶R，其中重链可变区的⑶R具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，3和5，且轻链可变区的⑶R具有氨基酸序列SEQ ID NO 17，19和21 ；或者其中重链可变区的⑶R具有氨基酸序列SEQ ID NO 2,4 和6且轻链可变区的⑶R具有氨基酸序列SEQ ID N0:18，20和22。所述轻链可变区优选包括氨基酸序列SEQ ID N0:27，特别是SEQ ID NO :28。在特别优选的实施方案中，根据本发明的抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO 16的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的 VL,或者其功能性变体或衍生物。根据一个实施方案，抗体包含下列抗体框架区 (i)重链可变区VH的FRHl，FRH2，FRH3和FRH4具有下列氨基酸序列，氨基酸位置相应于根据Kabat的编号对于FRHl (SEQ ID NO 7)
权利要求
1.能够结合mucin蛋白且包含重链可变区的至少一部分的抗体或其片段或衍生物，其中所述重链可变区的至少一部分根据Kabat编号在第观位氨基酸处包含脯氨酸残基。
2.根据权利要求1的抗体，其具有下列特征(a)其特异性结合糖基化的MUCl肿瘤表位，并且(b)其包含含有氨基酸序列SEQID NO: 16的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO 28的轻链可变区；或者其为具有所述特征(a)和(b)的抗体的功能性片段或衍生物，所述功能性片段或衍生物显示与包含氨基酸序列SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 28的抗体的交叉特异性。
3.根据权利要求1的抗体或其片段或衍生物，其具有一个或多个下列特征(a)与其表位的特异性结合取决于所述表位的构象和/或糖基化模式；(b)其能够特异性结合包含氨基酸序列PDTR的肽，所述肽优选在苏氨酸残基处以N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)糖基化；(c)其能够特异性结合MUC1，特别是源自肿瘤的MUCl的、经糖基化的细胞外串联重复的至少一部分；(d)其特异性结合经糖基化的MUCl肿瘤表位，从而使得与和相同长度及相同肽序列的非糖基化的肽的键相比，键的强度增加至少20倍；(e)其被工程化，优选被人源化；(f)其包含至少一个互补决定区，优选至少两个，所述互补决定区选自下组⑴具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的CDRl，(ii)具有氨基酸序列SEQID NO 3的CDR2，和(iii)具有氨基酸序列SEQID NO 5的CDR3 ；(g)其包含选自下列的抗体框架区(i)对于可变重链VH，FRHl，FRH2，FRH3和FRH4具有下列氨基酸序列，氨基酸位置对应于根据Kabat的编号对于 FRHl (SEQ ID NO 7)位置氨基酸1E2V3Q或K4L5V6E7S
4.编码根据权利要求1-3中任一项的抗体或其片段或衍生物的核酸。
5.包含根据权利要求4的核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子的表达盒或载体。
6.包含根据权利要求4的核酸或根据权利要求5的表达盒或载体的宿主细胞。
7.包含根据权利要求1-3中任一项的抗体或其片段或衍生物、根据权利要求4的核酸、 根据权利要求5的表达盒或载体或根据权利要求6的宿主细胞的组合物。
8.根据权利要求7的组合物，其为药物组合物，优选还包含一种或多种选自下列的组分溶剂、稀释剂和赋形剂。
9.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其片段或衍生物、根据权利要求4的核酸、根据权利要求5的表达盒或载体、根据权利要求6的宿主细胞或根据权利要求7或8的组合物， 用于医药。
10.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其片段或衍生物、根据权利要求4的核酸、根据权利要求5的表达盒或载体、根据权利要求6的宿主细胞或根据权利要求7或8的组合物，用于癌症的治疗、预后、诊断和/或监测，其中所述癌症优选选自结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、血癌、肺癌和卵巢癌。
11.用于改进能够结合mucin蛋白且包含重链可变区的至少一部分的抗体或其片段或衍生物的抗原结合和/或识别的方法，所述方法包括根据Kabat编号在重链可变区的第观位提供脯氨酸残基的步骤。
12.根据权利要求11的方法，具有至少一个或多个下列特征(a)通过向编码抗体或其片段或衍生物的核酸中引入突变而获得第观位的氨基酸残基，其中所述突变被引入到编码所述氨基酸残基的密码子中；和/或(b)改进抗原结合和/或抗原识别包括提高抗体或其片段或衍生物对其抗原的亲和力和/或增加抗体或其片段或衍生物对其抗原的特异性。
13.根据权利要求11或12的方法，其中抗体或其片段或衍生物具有一个或多个下列特征(a)与其表位的特异性结合取决于所述表位的构象和/或糖基化模式；(b)其能够特异性结合包含氨基酸序列PDTR的肽，所述肽优选在苏氨酸残基处以N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)糖基化；(c)其能够特异性结合MUC1，特别是源自肿瘤的MUCl的、经糖基化的细胞外串联重复的至少一部分；(d)其特异性结合经糖基化的MUCl肿瘤表位，从而使得与和相同长度及相同肽序列的非糖基化的肽的键相比，键的强度增加至少20倍；(e)其被工程化，优选被人源化；(f)其包含至少一个选自下组的互补决定区 ⑴具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的CDRl，(ii)具有氨基酸序列SEQID NO 3的CDR2，和(iii)具有氨基酸序列SEQID NO 5的CDR3 ；(g)其包含选自下列的抗体框架区(i)对于可变重链VH，FRHl，FRH2，FRH3和FRH4具有下列氨基酸序列，氨基酸位置对应于根据Kabat的编号
14.用于制备根据权利要求4的核酸的方法，包括下列步骤(a)提供包含编码能够结合MUCl并且包含重链可变区的抗体或其片段或衍生物的核酸序列的核酸，其中根据Kabat编号，所述重链可变区在第观位氨基酸处不包含脯氨酸残基；和(b)根据Kabat编号向编码重链可变区的第观位氨基酸的密码子中引入突变，从而所述密码子编码脯氨酸残基。
15.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其片段或衍生物，其具有的糖基化模式具有一个或多个下列特征(a)其为人糖基化模式；(b)其提高抗体的活性，特别是所述抗体与其特定表位的结合亲和力，所述抗体与一个或多个其下游受体例如Fc受体的结合亲和力，其补体依赖性细胞毒性(CDC)，和/或其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；和/或(c)其为如在选自下组的细胞系中表达抗体或其片段或衍生物时所获得的糖基化模式K562，KGl, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606]，NM-D4 [DSM ACC2605]，NM-H9D8 [DSM ACC 2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC 2807], NM H9D8-E6Q12 [DSM ACC 沘56]，和 GT_2X[DSM ACC 2858]。
全文摘要
本发明关于具有改进的抗原结合和/或识别特性的抗mucin抗体以及用于改进抗mucin抗体的抗原结合和/或识别的方法。特别地，本发明涉及用于癌症的治疗的抗MUC1抗体。
文档编号C07K16/30GK102574926SQ201080033969
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者A·丹尼尔奇克, R·施塔恩, S·高尔兹, U·卡斯滕 申请人:葛莱高托普有限公司