专利名称：肝细胞生长因子激活剂的调控物的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体的说，本发明涉及肝细胞生长因子激活剂功能的调控物，及所述调控物的用途。背景肝细胞生长因子激活剂(HGFA)是一种血浆胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，主要由 肝分泌，调节肝细胞生长因子(HGF，也称作散射因子(SF))的促有丝分裂、促运动、和促形态发生活性(Shimomura et al. , Cytotech. , 8:219-229 (1992)) HGF 涉及胚胎发育、组织再生和侵入性肿瘤生长。此活性需要将HGF蛋白水解加工成双链、二硫化物连接的a, ￠-异二聚体形式。HGFA是至今鉴定的最有效力的HGF激活剂之一(Shimomura etal.，Eur. J. Biochem. 229 (1995))。已经报告了正常胃肠肾组织中、及中枢神经系统中、以及胰、肝细胞、结肠直肠、前列腺、和肺癌细胞中的HGFA表达(Itoh et al. , Biochim.Biophys.Acta, 1491:295-302(2000);van Adelsberg et al.，J. Biol. Chem.，276:15099-15106(2001);Hayashi et al. , Brain Res. , 799:311-316(1998);Moriyama et al. , FEBSLett. , 372:78-82 (1995) ;Parr et al. , Int.J.Oncol., 19:857-863(2001);Kataoka et al. , Cancer Res.，60:6148-6159(2000);Nagata et al. , Biochem. Biophys. Res.Comm.，289:205-211 (2001))。最近，已经将来自多发性骨髓瘤细胞的HGFA分泌与HGF有力的旁和/或自分泌效应联系起来(Tjin et al. ,Blood, 104:2172-2175(2004))。HGFA作为96kDa酶原(proHGFA)分泌，具有与凝血因子XII (FXIIa)相似的域结构，包含6个结构域。那些结构域包括N端纤连蛋白II型域、表皮生长因子(EGF)样域、纤连蛋白I型域、另一个EGF样域、三环域、和C端胰蛋白酶同源性丝氨酸蛋白酶域(Miyazawa, et al.，J. Biol. Chem.，268:10024-10028 (1993))。残基 Arg372 和 Val373 之间激肽释放酶敏感性位点处的切割可生成缺失头5个域的34kDa短形式。HGFA原的96kDa和34kDa两种形式都能在残基Arg407和Ile408之间被凝血酶切割成活性HGFA(Shimomuraet al.，J. Biol. Chem.，268，22927-22932 (1993))。凝血酶是促凝刺激的最终效应器，而且活性HGFA的生成会与伤口修复中的HGF活性一致(Bussolino et al. , J. CellBiol.，119:625-641(1992))。在影响HGF/Met信号传导的因素中有HGFA原的活化和随后HGFA的抑制。所鉴定的HGFA生理性抑制剂是剪接变体HAI-I和HAI-IB (肝细胞生长因子激活剂抑制剂_1)、和 HAI-2 (也称作胎盘双库尼茨抑制剂(bikunin) ) (Shimomura et al. , J. Biol. Chem.,272:6370-6376(1997);Kawaguchi et al.，J. Biol. Chem.，272:27558-27564 (1997); Kirchhofer et al.，J. Biol. Chem. 278:36341-36349 (2003))。HGFA 具有有限的底物特异性(Kataoka et al. , Cancer metastasis reviews 22，223-239 (2005);Miyazawa et al. ,JBiol Chem 268, 10024-10028(1993)):只知道两种大分子底物，肝细胞生长因子原(HGF原)(Shinomura et al. , Eur J Biochem 229，257-261 (1995))和巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP 原)(Kawaguchi et al, Febs J 276 (13) 3481-3490 (2009))受到 HGFA 加工，例示该酶高度有限的底物特异性。HGFA受到库尼茨(Kunitz)型抑制剂HGFA抑制剂-I抑制，后者利用N端库尼茨域-I (KDl)通过规范抑制机制来抑制HGFA (Shia et al.，J Mol Biol346，1335-1349 (2005))。HGFA经HGF原加工及随之发生的HGF/Met信号传导途径激活来影响组织再生并促进癌生长(Parr and Jiang, Int，I J of Oncol 19, 857-863 (2001)) 根据定义，酶的变构调节涉及改变的源自远端效应器相互作用位点的催化活性。事实上，似乎所有机能蛋白(单体的和多聚体的)都具有变构的潜力(Gunasekaranet al. ,Proteins 57，433-443 (2004))。变构调控及其通讯途径的阐释得到了可观的关注(Swain and Gierasch, Curr Op in Structural Biol 16，102-108 (2006) ; Yu andKosh I and, PNAS 98, 9517-9520 (2001)) 在血红蛋白中观察到变构的一个经典例子(Perutz, Nature 228，726-739 (1970))，其第一次提供对变构调节机制的了解。其后出现了数项X射线结晶学研究,描述变构调节期间的构象变化(Changeux and Edelstein, Science308, 1424-1428(2005);DiCera, J Biol Chem 281，1305-1308(2006);Pellicena a ndKuriyan, Nature 228，726-739 (2006) ; Xu et al. , Nature 388, 741-750 (1997)) 变构还是一种相当普通的且有力的调节蛋白酶的催化活性的机制(Hauske et al. , Chembiochem9, 2920-2928 (2008) ; Turk, Nature Reviews 5,785-799(2006))。与活性位点不同，位于远端的变构位点通常不太保守，而且可用于实现特异性(Hauske et al.，supra)。变构性抗蛋白酶基于蛋白质的药剂具有巨大的治疗潜力，因为它们是有力的且高度特异性的，而且针对它们的靶蛋白酶的任何无意加工得到防护。丝氨酸蛋白酶家族(Clan PA，MER0PS命名法中的家族 SI (Rawlings et al. , Nucleic Acids Res 36，D320-325 (2008)))中的变构调节剂的例子有HtrA蛋白酶家族中的附属PDZ域(Sohn et al. ,Cell 131,572-583(2007))、对许多凝血因子而言的钙(Bjelke et al. , J Biol Chem 283，25863-25870 (2008))、对凝血酶而言的钠(Huntington, Biological chemistry 389，1025-1035 (2008) ; Wells andDi Cera, Biochem 31，11721-11730 (1992))、对凝血因子Vila而言的辅因子诸如组织因子(Eigenbrot and Kirchhofer, Trends in Cardiovascular Med 12, 19-26 (2002))和进入“活化口袋”的 N 端妝插入(Friedrich et al. , Nature 425，535-539 (2003) ;Huber andBode, Acc Chem Res 11,114-122(1978))。已经将蛋白酶与许多人病理过程联系起来(Barrett et al. , (1998). Handbookof Proteolytic Enzymes. San Diego: Academic Press (1998);Egeblad and fferb, NatureRev Cancer 2，161-174(2002);Hooper, Proteases in Biology and Medicine. In Essaysin Biochemistry, London:Portland Press (2002);Luttun et al. , Curr Atheroscler. Rep2，407-416(2000))。因此，通过变构抑制剂来调节蛋白水解活性可能代表活性位点抑制剂的一种有希望的备选办法(Peterson and Golemis, J Cell Biochem 93, 68-73 (2004)),活性位点抑制剂常常遭受不当的特异性，因为活性位点拓扑学在同一家族的成员间一般是保守的(Hedstrom，Chem Revs 102，4501-4524(2002))。与活性位点不同，位于远端的变构位点通常不太保守，而且可用于实现特异性(Hauske et al.，supra)。已经对凝血因子VIIa和胱天蛋白酶描述了特异性的且有力的变构抑制剂的卓越例子(Hardyet al. , PNAS 101，12461-12466(2004);Hardy and Wells, Curr Op Structural Biol14，706-715(2009))。由于HGF原的活化需要转变酶诸如HGFA的切割，因此HGFA功能和/或它与其底物相互作用的调控可证明是有效的治疗途径。在这点上，显然需要能够调控HGFA活性和/或特异性与HGFA相互作用的临床相关药剂。本发明满足了这一需求并提供了其它好处。通过述及将所有出版物、专利、和专利文件收入本文，就像通过述及个别收录。发明公开本发明提供了方法、组合物、试剂盒和制品，用于调控肝细胞生长因子激活剂(HGFA)的功能，由此调控HGFA活性的生理学作用。HGFA功能的调控可通过使用本文所述
抗体来实现。本文中描述变构抑制HGFA功能的抗HGFA抗体。变构性抗蛋白酶抗体可具有巨大的治疗潜力，因为它们是有力的且高度特异性的，而且针对它们靶蛋白酶的任何无意加工得到防护。在一个方面，本发明提供适合治疗用途且能够实现不同程度对HGF/c-met信号传导途径破坏的抗HGFA治疗剂。例如，本发明提供分离的抗HGFA抗体，其中全长IgG形式的该抗体以小于或等于20pm的结合亲和力特异性结合人HGFA。在一个实施方案中，该分离的抗HGFA抗体以约lOXlO^fY1或更快的Km特异性结合人HGFA。在一个实施方案中，该分离的抗HGFA抗体以约I. TXlO-4S-1或更慢的Ktjff特异性结合人HGFA。在一个实施方案中，本发明提供亲和力成熟的抗HGFA抗体，其中该抗体对人HGFA的二价亲和力比参照抗体的二价亲和力低，例如低至少3、5、7或10倍或更多，诸如40倍或60倍或更多，参照抗体包含下述各项、由下述各项组成或基本上由下述各项组成(a)包含序列 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSYITPPT(SEQ ID NO:7)的 HVR-L3 ; (d)包含序列 GTHH(SEQ IDNO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。如本领域中所完善确立的，配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测定法之任一种来测定，并以多种定量数值表示。因而，在一个实施方案中，结合亲和力以Kd值表示，并反映内在结合亲和力(例如具有最小化的亲合效应)。一般且优选地，结合亲和力是在体外测量的，无论在无细胞的或细胞相关的环境中。如本文中更为详细描述的，结合亲和力的倍数差异可根据人源化抗体(例如以Fab形式)的单价结合亲和力数值和参照/比较抗体(例如以Fab形式)(例如具有供体高变区序列的鼠抗体)的单价结合亲和力数值的比率量化，其中所述结合亲和力数值是在相似测定条件下测定的。如此，在一个实施方案中，结合亲和力的倍数差异是作为Fab形式人源化抗体和所述参比/比较Fab抗体的Kd值比率测定。例如，在一个实施方案中，如果本发明抗体(A)具有比参比抗体(M)的亲和力“低3倍”的亲和力，那么A的Kd值是3x，M的Kd值是lx，而A的Kd对M的Kd的比率是3:1。相反，在一个实施方案中，如果本发明抗体(C)具有比参比抗体(R)的亲和力“高3倍”的亲和力，那么C的Kd值是lx，R的Kd值是3x，而C的Kd对R的Kd的比率是1:3。本领域已知的许多测定法中的任一种，包括那些本文所描述的，都可用于获取结合亲和力测量，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)和ELISA。在一个方面，本发明提供分离的抗HGFA抗体，其中该抗体结合HGFA残基446，449，450, 452, 453, 455, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 496, 499, 501，578，579，580, 636，637，640, 643，644中至少一个残基、两个残基、三个残基、四个残基、或
任何数目残基，直至所有残基，且进一步地其中该抗体变构抑制HGFA并与HGFA活性位点封闭剂 KDl 或 Ac-KQLR-氯甲基酮(Ac-KQLR-chloromethyl ketone) (〃KQLR〃披露为 SEQ IDNO: 10)竞争对HGFA的结合，但不与苄脒竞争对HGFA的结合。在一些实施方案中，该抗体在封闭HGFA活性(催化)位点的化合物缺失下结合HGFA，但在封闭HGFA活性位点的化合物存在下不结合HGFA。在一些实施方案中，该抗体竞争性抑制HGFA对HGFA底物的活化。在一些实施方案中，该抗体结合 HGFA 残基 449，450，452，482，484，485，486，487，488，489，490，491中至少一个残基、两个残基、三个残基、四个残基、或任何数目残基，直至所有残基。在一些实施方案中，该抗体结合HGFA残基446，482，484，490，499，501中至少一个残基、两个残基、三个残基、四个残基、或任何数目残基，直至所有残基。在一个方面，本发明提供分离的抗HGFA抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、和/或六种选自下组的高变区(HVR)序列(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSNRAPAT(SEQ ID NO:3)的 HVR-L3 ； (d)包含序列 GTHH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY (SEQ IDNO:6)的HVR-H3。在一些实施方案中，HVR-Hl包含序列NGTYIH(SEQ ID N0:43)。在一些实施方案中，HVR-Hl包含序列GFTFNGTYIH(SEQ ID N0:44)。在一些实施方案中，HVR-H2包含序列 GGIYPAGGATYY (SEQ ID NO: 45)。在一些实施方案中，HVR-H3 包含序列 KffffAWPAFDY (SEQID NO:46)。在一个方面，本发明提供抗HGFA抗体，其包含轻链，该轻链包含(a)包含序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ;(c)包含序列 QQSNRAPAT (SEQ ID NO: 3)的 HVR-L3。在一个方面，本发明提供抗HGFA抗体，其包含重链，该重链包含(a)包含序列GTYIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ; (b)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2 ;和(c)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。在一个方面，本发明提供抗HGFA抗体，其包含轻链和重链可变区，该轻链包含(a)包含序列 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO:2)的HVR-L2 ； (c)包含序列QQSNRAPAT (SEQ ID NO:3)的HVR-L3 ;该重链可变区包含(d)包含序列 GITIH (SEQ ID NO: 4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗HGFA抗体包含轻链可变域，且进一步包含重链可变域，该轻链可变域具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8) 在一个实施方案中，本发明的抗HGFA抗体包含重链可变域，且进一步包含轻链可变域，该重链可变域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
在一个实施方案中，本发明的抗HGFA抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域具有序列DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8);该重链可变域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。本发明的抗体可进一步包含任何合适的框架和/或轻链可变区序列，只要HGFA结合活性基本上得到保留。例如，在有些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的某些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A0在一个实施方案中，这些抗体包含人源化4D5抗体(huMAb 4D5-8) (HERCEPT丨Ni'Genentech, Inc. , South SanFrancisco, CA, USA)的重链可变区框架序列(还可参阅美国专
利 6，407，213 和 Lee et al.，J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-93 (2004))。在一个实施方案中，该人源化4D5-8抗体如美国专利6，407，213中所述。在一个实施方案中，这些抗体还包含人K I轻链框架共有序列。一方面，本发明提供了与任何上述抗体竞争结合HGFA的抗体。一方面，本发明提供了结合HGFA上与任何上述抗体所结合表位相同的表位的抗体。在一个实施方案中，本发明抗体是亲和成熟的、人源化的、嵌合的或人的。在一个实施方案中，本发明的抗体是抗体片段(如本文所述)或基本上全长的抗体。在一个实施方案中，本发明抗体包含野生型Fe区或其变体。在一个实施方案中，本发明抗体是IgG(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE 或 IgD。一方面，本发明的抗体与毒素诸如细胞毒剂连接。这些分子/物质可与添加剂/增强剂联合配制或施用，诸如放射和/或化疗剂。HGF/c-met信号途径涉及多种生物学和生理学功能，包括例如细胞生长刺激(例如细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生)和血管发生。因此，另一方面，本发明提供了抑制c-met激活的细胞生长(例如增殖和/或存活)的方法，所述方法包括使细胞或组织接触本发明的抗体，由此使与c-met活化有关的细胞增殖受到抑制。另一方面，本发明提供了抑制血管发生的方法，所述方法包括对具有异常血管发生相关状况的细胞、组织和/或受试者施用本发明的抗体，由此使血管发生受到抑制。一方面，本发明提供了本发明的抗体在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。一方面，本发明提供了本发明的核酸在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。一方面，本发明提供了本发明的表达载体在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。—方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。一方面，本发明提供了本发明的制品在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。一方面，本方面提供了本发明的试剂盒在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。一方面，本发明提供了抑制c-met激活的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明抗体，由此使与c-met活化有关的细胞增殖受到抑制。一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化的调节异常有关的病理状况的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明抗体，由此使所述疾病得到治疗。 一方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的抗体，由此引起所述细胞的生长抑制。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF (例如通过旁分泌作用)。一方面，本发明提供了治疗性处理患癌性肿瘤的哺乳动物的方法，该肿瘤包含表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞,所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明抗体分子，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF (例如通过旁分泌作用)。—方面，本发明提供了用于治疗或预防与HGFA的表达或活性增加有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明抗体，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。一方面，本发明提供了用于治疗或预防与c-met或肝细胞生长因子或二者的表达或活性增加有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明抗体，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。—方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于HGFA的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。一方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF (例如通过旁分泌作用)。一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于HGFA的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF (例如通过旁分泌作用)。一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF (例如通过旁分泌作用)。本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如与HGF/c-met信号途径调节异常有关的细胞和/或组织，例如通过与HGFA对HGF的活化作用有关的HGF活性增加。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可选自乳癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(例如甲状腺的)、结肠癌细胞、胰乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨源性肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、前列乳腺癌细胞、胃癌细胞、头和颈鳞状癌细胞、间皮瘤细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是过度增殖的和/或过度增生的细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是发育异常的细胞。在另一实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是转移的细胞。本发明的方法可进一步包括另外的处理步骤。例如，在一个实施方案中，该方法还
包括其中将祀细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放射处理或化疗剂的步骤。如本文所述，HGF/c-met的活化是重要的生物学过程，它的调节异常导致许多病理状况。因此，在本发明方法的一个实施方案中，所靶向的细胞(例如癌细胞)是其中HGF/c-met的活化与相同组织起源的正常细胞相比增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起靶细胞的死亡。例如，与本发明调控物分子的接触可导致细胞不能通过c-met途径发信号，这导致细胞死亡。c-met活化(及由此信号传导)的调节异常可源自许多细胞变化，包括例如HGF(c-met的关联配体)和/或HGFA的过表达，和/或HGFA对HGF的活化作用增加。因此，在有些实施方案中，本发明的方法包括靶向这样的组织，与相同起源的正常组织相比，其中表达和/或存在的HGFA、c-met和肝细胞生长因子中的一种或多种更丰富(例如癌)。表达HGF或c-met的细胞可受到来自多种来源的HGFA调节，即以自分泌或旁分泌的方式。例如，在本发明方法的一个实施方案中，使靶细胞受到被不同细胞所表达的HGFA活化的肝细胞生长因子的接触/结合(例如通过旁分泌作用)。所述不同细胞可以是相同或不同组织起源的。在一个实施方案中，使靶细胞受到被靶细胞自身所表达的HGFA活化的HGF的接触/结合(例如通过自分泌作用/环)。一方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种抗体及载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。一方面，本发明提供了编码本发明抗体的核酸。在一个实施方案中，本发明的核酸编码调控物分子，其是或者包含抗体或其片段。一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。—方面，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。一方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了制备调控物分子的方法，该调控物分子是或者包含抗体(或其片段)，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明重组载体，并回收所述抗体。一方面，本发明提供了包括容器及该容器内所装有的组合物的制品，其中所述组合物包含本发明的一种或多种抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品还包括关于对受试者施用所述组合物(例如抗体)的说明书。一方面，本发明提供了包括第一容器和第二容器的试剂盒，其中第一容器装有包含本发明的一种或多种抗体的组合物，而第二容器装有缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含抗体的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒还包括关于对受试者施用所述组合物(例如抗体)的说明书。一方面，本发明提供了诊断疾病的方法，包括通过使样品接触本发明的抗体来测 定组织细胞待测样品中的HGFA水平，由此被所述抗体结合的HGFA指示样品中HGFA的存在和/或量。另一方面，本发明提供了测定个体是否有患病风险的方法，包括通过使待测样品接触本发明的抗体来测定组织细胞待测样品中的HGFA水平，由此测定样品中存在的HGFA的量，其中与包含与待测样品细胞起源相同的正常组织的对照样品相比，待测样品中HGFA水平较高指示该个体有患病风险。在本发明方法的一个实施方案中，HGFA水平是基于HGFA多肽的量测定的，而后者由待测样品中抗体所结合的HGFA量指示。所述方法中所采用的抗体可任选进行可检测标记，附着于固相支持物，等等。一方面，本发明提供了使本发明抗体与体液例如血液中存在的HGFA结合的方法。另一方面，本发明致力于使本发明抗体与表达和/或响应HGFA的细胞结合的方法，其中所述方法包括在适于所述抗体与HGFA结合且允许它们之间结合发生的条件下使所述细胞接触所述抗体。在一个实施方案中，所述抗体与细胞上的HGFA的结合抑制HGFA的生物学功能。在一个实施方案中，所述抗体不抑制HGFA与其底物分子的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体与细胞上的HGFA分子结合并抑制另一分子(诸如HGF原)与HGFA分子结合。一方面，本发明提供了使治疗剂靶向宿主中的HGFA相关组织的方法，所述方法包括对宿主施用与本发明抗体连接形式的所述治疗剂，由此使所述药剂靶向于宿主中的HGFA相关组织。在一个实施方案中，结合HGFA的抗体能够特异性结合位于细胞上的HGFA(在体外或在体内)，例如在HGFA存在于细胞表面上的情形中。附图简述图I :抗HGFA抗体的CDR序列。残基依照Kabat编号系统(Kabat et al.，1991)来编号。Ab39和Ab40之间的序列变异标有阴影。Fab40的单个残基删除(Trp96H)以粗体突显。图 I 披露"CDR-L1"为 SEQ ID NO I, I,和 1，"CDR-L2"为 SEQ ID NO 2，2，和 2，"CDR-L3〃 为 SEQ ID NO 22, 3,和 3，〃CDR_H1"为 SEQ ID NO 23,23，和 23，〃CDR_H2〃 为 SEQID NO 47，47，和47，而"CDR-H3"为SEQ ID NO 46，46，和24，均分别依照出现的次序。图2 Ab40对HGFA酶活性的抑制。(a)在Ab40的3倍连续稀释液存在下HGFA对125I-HGF原的切割。通过SDS-PAGE (还原性条件)及随后的X射线胶片曝光来分析切割产物HGF a -和0 -链。(b) Ab40对产色底物S-2266水解的部分抑制(表述为HGFA分级活性vi/vo)及Ab40. ATrp的抑制的缺失。(c)Ab40 (I y M-0. 004 y M，3倍分步稀释；实心菱形=“无抗体”对照)抑制HGFA的Eadie-Hofstee曲线图显示竞争性抑制(对于对照，Vmax=O. 99 u MpNA/min, Km=O. 23mM ;对于 I y M Ab40,1,: = 0.99 jiM pNA/min ，[r =0.82 mM)。图3 :活性位点抑制剂对抗体结合HGFA的影响。(a_b，e-f)共注射HGFA(a，e)或HGFA-KQLR(b, f)复合物(〃KQLR〃披露为 SEQ ID NO: 10)后对固定化抗体Ab40 (a_b)或Ab40.A Trp (e-f)的结合的表面等离振子共振(BIAcore)测量。(C)在不同浓度的KDl存在下HGFA对固定化Ab40的竞争结合(BIAcore)。(d)测量浓度渐增的抗体存在下HGFA对生物素化KDl的结合的竞争结合ELISA。图4 HGFA/Fab40复合物的结构。(a)表面呈现，其中为HGFA (飘带)和Fab40(轻链浅灰色和重链深灰色)之间的复合物突显二级结构。显示了催化三联体(His57-Aspl02-Serl95)残基，而且以箭头突显了 99-环。(b)HGFA/Fab40 (浅灰色)结构与
HGFA/Fab75 (ffu et al, 2007)(深灰色)的叠加，显示除了 99-环(黑色)的变化以外，HGFA的构象没有显著变化。(c)Fab40的⑶R环(Ll-3、Hl-3)与HGFA (表面呈现)的相互作用的近视图。突显了涉及界面相互作用的关键残基，而且99-环以红色指示。除几个氢键(深灰色虚线)之外，观察到HGFA的Asp241和Fab40的Lys64H之间的一个盐桥。图5 HGFA/Fab40表位和互补位，其中HGFA (浅灰色)和Fab40 (轻链浅灰色，重链深灰色)。(a) HGFA (浅灰色)上Fab40接触区(深灰色，4人截留)的表位。指示了催化三联体和底物结合亚位点S1-S4。(b)HGFA上Fab40接触区的一个不同视图，Fab40接触区与对应于凝血酶(绿色)中exosite-II的区域部分交叠。(c)Fab40 (虚线,4人截留)上的HGFA接触区。重链涉及与HGFA的密切接触且贡献Fab40结合时HGFA上埋藏的总可及表面积的三分之二。图6 =HGFA的99-环的三个结构快照。(a) 99-环的构象的“变构转换”导致形成疏水性深口袋(着色深灰色,HGFA的残基Ala56, Pro90, Tyr88, Val96, Vall05和Ilel07)，容许Fab40的Trp96H结合。(b)HGFA/Fab40. ATrp中疏水性口袋(着色深灰色)的大小受到严格限制，源于Val96和此口袋其它衬里残基的运动。(c)在其它已知结构中找到的HGFA的99-环的“松弛”状态构象(Shia et al. , 2005; Wu et al.，2007)。(d) HGFA 的 99-环(浅灰色)和HGFA/Fab40 (深灰色)复合物的叠加。99-环在Fab40结合时的构象转变，99-环残基的主链移位> I A，而侧链构象移动>2. O。在棍棒呈现(上部)中突显了 Fab40的⑶R-H3环。(e) HGFA/Fab40. ATrp 的 99-环与 HGFA 的 99-环及与 HGFA/Fab40 的 99-环的叠加。在Fab40. A Trp/HGFA复合物结构中99-环(浅灰色)的构象几乎复原到“松弛”状态。在棍棒呈现(深灰色)中突显了 Fab40. ATrp的CDR-H3环。(f)HGFA/Fab40. ATrp的99-环与HGFA/Fab40的99-环的叠加，指示CDR-H3环在删除Fab40的Trp96H (虚线圆圈)时的微小变化。图7 :变构机制。(a)立体视图，在HGFA_KQLR/Fab40. A Trp复合物(〃KQLR〃披露为 SEQ ID NO: 10)中肽抑制剂 Ac-KQLR-cmk (〃KQLR〃 披露为 SEQ ID NO: 10) (CPK 球体呈现中埋藏的深灰色棍棒，下部)共价连接至HGFA的活性Serl95和His57。P2_Leu针对99-环的Pro99a (点呈现中埋藏的浅灰色棍棒，上部)压紧，而且与Ser99的氢键稳定P4_Lys。(b)自 HGFA/Fab40 结构与 HGFA-KQLR/Fab40. ATrp (〃KQLR〃披露为 SEQ ID NO: 10)叠加获得的HGFA-KQLR/Fab40 (〃KQLR〃披露为SEQ ID NO: 10)模型立体视图显示变构抑制是由于Pro99a和Ser99与99-环的P2_Leu (点呈现中埋藏的白色棍棒)之间的空间冲突。(c)HGFA-KQLR/Fab40. A Trp (〃KQLR〃 披露为 SEQ ID NO: 10)与 HGFA_KQLR/Fab40 (〃KQLR〃 披露为SEQ ID NO: 10)模型叠加的立体视图，突显关键构象变化和对HGFA的Ser99和抑制剂的P4-Lys之间的氢键的破坏。图8 :卡通模型，图示抑制的变构机制。在功能活性状态中，结合亚位点是底物可及的，而且“变构转换”处于“关”状态。Fab40优先抽取瞬时形成的构象之一并转换平衡远离功能活性状态，如此驱动酶分子的主要群体从“变构转换” “关”状态变成“开”状态。相反，不抑制酶活性的Fab40. A Trp可仅仅结合酶,不驱动状态变化。图9 : (a)抗体特异性。在直接结合ELISA中，将96孔板用2mg/ml HGFA、 matriptase (Kirchhofer et al. (2003) J Biol Chem 278:36341-36349)、尿激酶(AmericanDiagnostica)、或因子 XIIa(American Diagnostica)包被，并与 PBS, 0. 05%(v/v)Tween-20 (PBT)缓冲液中的10mg/ml抗HGFA抗体一起温育。清洗后，通过添加抗人抗体HRP偶联物(在PBT缓冲液中1: 2，500稀释)和TMB底物来检测结合的抗体。在微量板阅读仪上测量450nm处的吸光度。(b) Ab39 (I u M-0. 004 u M, 3倍分步稀释；实心菱形=“无抗体”对照)抑制HGFA的Eadie-Hofstee曲线图显示竞争性抑制(对于对照，Vmax=O. 99 u MpNA/min,Km=O. 25mM ;对于 I u M Ab39,K；^ = 0.97 jiM pNA/min,A;f =0.91 mM)。
图10 :立体图像，图示电子密度图的质量(在Is成形的2fofc)。(a)在HGFA/Fab40结构中99-环米取“无能力(non-competent) ”构象。(b)在HGFA/Fab40. ATrp结构中99-环复原成“有能力(competent) ”构象。(c)HGFA活性位点中共价结合的KQLR肽(SEQID NO: 10)不扰乱 Fab40 A Trp 的结合，因为在 HGFA_KQLR/Fab40. A Trp (〃KQLR〃 披露 为 SEQID NO: 10)结构中99-环采取“有能力”构象。图11 HGFA-KQLR/Fab40. A Trp 复合物("KQLR〃披露为 SEQ ID NO: 10)结构中活性位点处的化学结构和氢键网络。肽抑制剂KQLR(SEQ ID NO: 10)(中央)共价结合Serl95和 His57。图12 HGFA/Fab40. ATrp (浅灰色)和 HGFA_KQLR/Fab40. ATrp (〃KQLR〃 披露为SEQ ID勵10)(更深的灰色，1^1^(5￡0 ID NO: 10)-最深的灰色)复合物结构的叠加。99-环的构象处于“有能力”构象，正如在HGFA的其它已知结构中找到的。图 13 :HGFA/Fab40和 HGFA/KDl(Shia et al(2005)J Mol Biol 346(5):1335-49)复合物结构的叠加。Fab40 (深灰色,飘带)的结合位点不与KDl (深灰色)的结合位点直接交叠，但是99-环的运动可引起一些针对KDl结合HGFA/Fab40复合物的空间冲突。图14 HGFA/Fab40 (99-环的“无能力”构象(可互换称作“紧张”构象；浅灰色)复合物和已发表的HGFA (99-环的“有能力”构象(可互换称作“松弛”构象)，黑色)结构的叠加。处于“有能力”构象的HGFA的99-环残基与Fab40的⑶R-H3环残基中的Trp96H、Ala97H和Trp98H之间可发生空间冲突。图15 :胰蛋白酶样蛋白酶域，使用结构同源性的比对。HGFA的天然连续残基编号出现在序列上方，而糜蛋白酶原编号出现在序列下方。糜蛋白酶原编号包括相对于糜蛋白酶原序列以小写字母表示的插入(例如His60a)和删除(例如没有残基编号218，所以217后面是219)。残基60a、60b、60c和60d在残基60后面，而残基111a、111b、Illc和Illd在残基111后面，而残基170a和170b在残基170后面。但是，残基99a在残基99前面，残基184a在残基184前面，残基188a在残基188前面，而残基221a在残基221前面。图15A公开SEQ ID NO 25-33，而图15B公开SEQ ID NO 34-41，均分别依照出现的次序。图16 A.抗HGFA抗体的轻链可变域序列。B.重链可变域序列。残基依照Kabat编号系统来编号，并且图示了 Kabat、Chothia和接触⑶R。发明详述本发明提供了包含肝细胞生长因子激活剂功能的调控物的方法、组合物、试剂盒和制品。本文提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的细节。通用技术除非另有说明，本发明的实行将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分解释了这些技术，诸如 “Molecular Cloning: ALaboratory Manual”，secondedition (Sambrook et a I. , 1989) ; “Oligonucleotide Synthesis，，，(M.J. Gait, ed. , 1984) ; “Animal Cell Culture，，，(R. I. Freshney, ed.，1987) ; “Methods inEnzymoIogy^, (Academic Press, Inc. ) f Current Protocols in Molecular Biology”，(F.M.Ausubel et al. , eds. , 1987,and periodic updates) ; “PCR:The PolymeraseChain Reaction，，，(Mullis et al. , ed. , 1994) ; “A Practical Guide to MolecularCloning”，(Perbal Bernard V. , 1988) ; “Phage Display:A Laboratory Manual”，(Barbaset al. , 2001)。定义如本文中使用的，除非另有具体或上下文说明，术语“肝细胞生长因子激活剂”或“HGFA”指能够在容许下述过程发生的条件，例如容许HGF双链形式形成的条件下结合HGF和/或活化HGF的任何天然或变异(天然的或合成的)HGFA多肽。术语“野生型HGFA序列”一般指在天然存在HGFA中找到的氨基酸序列，而且包括天然存在的截短或分泌形式、变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。野生型HGFA的一个例子是包含表4所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)的多肽。HGFA的序列编号方式依照SWISS-PR0T条目HGFA_HUMAN登录号Q04756且如表4所示。对于蛋白酶域内的残基，有时使用自糜蛋白酶原衍生的备用编号方案。这两种残基编号方案的相互转换见图15。一般地，会标示贯穿此申请利用的编号系统。“活化的HGFA”或其变化指具有野生型HGFA蛋白从单链形式转变成2链形式时野生型HGFA所采取的一种或多种构造(conformation)的任何HGFA链。在一些实施方案中，转变至少部分源自HGFA蛋白的残基407和残基408之间的切割。在一些实施方案中，构造具体指蛋白酶域的构造。活化的HGFA也可以自全长HGFA的片段，诸如34kDa形式形成。34kDa形式可通过残基372和373之间的切割来生成。HGFA可以自多种来源分离，诸如人组织或人血衆，或者通过重组或合成方法来制备。活化的HGFA的一个实施方案包含表5所示氨基酸序列(SEQ ID N0:20)。(编号方式为本文所述天然HGFA的编号方式。)如本文中使用的，“HGFA变体”指具有与参照多肽不同的序列的多肽。在一些实施方案中，参照多肽是包含表4所示序列的HGFA多肽。变体包括“非天然”存在变体。在一些实施方案中，变体与表4所示氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性。变体包括那些具有替代、添加或删除的多肽。在一些实施方案中，变体具有结合HGF和/或活化它的生物学活性。在其它实施方案中，变体能结合HGF，但不活化它。通常，HGFA变体多肽与包含表4所示氨基酸序列的HGFA多肽或包含表5所示序列的HGFA多肽会具有至少80%序列同一性，更优选会具有至少81%序列同一性，更优选会具有至少82%序列同一性，更优选会具有至少83%序列同一性，更优选会具有至少84%序列同一性，更优选会具有至少85%序列同一性，更优选会具有至少86%序列同一性，更优选会具有至少87%序列同一性，更优选会具有至少88%序列同一性，更优选会具有至少89%序列同一性，更优选会具有至少90%序列同一性，更优选会具有至少91%序列同一性，更优选会具有至少92%序列同一性，更优选会具有至少93%序列同一性，更优选会具有至少94%序列同一性，更优选会具有至少95%序列同 一丨I"生，更优选会具有至少96%序列同一丨丨生,更优选会具有至少96%序列同一丨丨生,更优选会具有至少97%序列同一性，更优选会具有至少98%序列同一性，更优选会具有至少99%序列同一性。关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，如美国专利No. 6，828，146中所述。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(任选可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可预料到若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一丨I"生。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值均是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分阻断。多核苷酸还可以在合成后修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety),诸如例如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接
(如a端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何轻基可用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与另外核苷酸的另外连接，或者可偶联至固相或半固相支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ -氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -叠氮-核糖，碳环糖类似物，a -端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯用 P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯”(dithioate) )、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate) )、P (0) R、P (0) 0R’、CO 或 CH2 (“ 甲缩醛”(formacetal))替代，其中 R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短多核苷酸，通常是单链，通常是合成的，长度通常但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(I)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“依照Kabat的可变区残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中的抗体编辑用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。利用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变区FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变区可包括H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat是残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。指定抗体的Kabat残基编号可通过将此抗体序列与“标准”Kabat编号序列在同源区进行比对来确定。除非另有说明，本文中的所有氨基酸位置编号依照Kabat编号系统。“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，所述人免疫球蛋白VL或VH选集来自可变区序列亚型。通常，所述序列亚型是如Kabat等人所述的亚型。在一个实施方案中，对于VL,所述亚型是如Kabat等人所述的亚型K I。在一个实施方案中，对于VH，所述亚型是如Kabat等人所述的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变重链亚型III中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个全部EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:11)-Hl-ffVRQAPGKGLEWV(SEQ IDNO:12)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC(SEQ ID NO:13)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:14)。“VL亚型I共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变轻链k亚型I中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO:15)-Ll-ffYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:18)。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体，只要它们展示期望的生物学活性)，且还可包括抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，由此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fe区的抗体片段，保留通常与所述Fe区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与能够赋予该片段以体内稳定性的Fe序列相连的一个抗原结合臂。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即构成群体的抗体个体是相同的，只是可能以极小数量存在可能的天然发生突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(美国专利4，816，567;及Morrison etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。非人(如鼠源)抗体的“人源化”形式是最低限度含有衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是如下人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体高变区的残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含没有在受体抗体中或在供体抗体中发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个基本上整个可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白
中的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的Fe。更多详情参见Joneset al. , Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988);及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。还可参见下列综述性论文及其引用的参考文献Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998);Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle and Gross, Curr.Op.Biotech. 5:428-433(1994)。“人抗体”是具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列且/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述了经由通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献描述了⑶R和/或框架残基的随机诱变Barbas et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994) ; Schieret al. , Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.，J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al. , J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995);及 Hawkins et al. , J. Mol.Biol.226:889-896(1992)。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。“紊乱”是将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论紊乱的病理状况。本文中待治疗的紊乱的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关的紊乱。
术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊舌L。在一个实施方案中，所述细胞增殖性紊乱是癌症。“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。这样的癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的乳腺癌、肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰乳腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液乳腺癌、肾癌、肝癌、前列乳腺癌、外阴癌、甲状乳腺癌、肝的癌及各种类型的头和颈癌。血管发生调节异常可导致可用本发明组合物和方法治疗的许多紊乱。这些紊乱包括非肿瘤性的和肿瘤性的两类状况。肿瘤性的包括但不限于上文所描述的。非肿瘤性紊乱 包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新生血管性青光眼、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它组织的移植、慢性炎症、急性肺损伤/ARDS、脓毒病、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部损伤/外伤有关的)、滑液炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊性卵巢病、子宫内膜异位、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫平滑肌瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD (克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)、以及胸腔积液。“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或紊乱。自身免疫病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或紊乱，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫疾病或紊乱的实例包括但不限于炎性应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(如特应性皮炎);系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎);呼吸窘迫综合症(包括成人呼吸窘迫综合症;ARDS);皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE);糖尿病(如I型糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏(Reynaud)综合症；自身免疫性甲状腺炎；特应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjorgen)综合症；幼发型糖尿病；通常在肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏(Addison)病);牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性紊乱；多种器官损伤综合症；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症(cryoglobinemia)或库姆斯氏(Coombs)反应阳性贫血(Coombs positiveanemia));重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves)病；兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多种内分泌腺病；莱特氏(Reiter)病；僵体综合症(stiff-man syndrome);贝切特氏(Behcet)病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。在用于本文时，“治疗”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或紊乱的发展。“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的数量。本发明物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的数量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的数量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂,例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒性剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和 CYTOXAN 环磷酰胺(cyclophosphamide);横酸烧基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylameIamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethyIenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bulIatacin)和布拉他辛酮(bulIatacinone) ) ； 8 -9-四氢大麻酷(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酷(dronabinol), MARINOL ) ; 0 -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9_氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素I和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin) ;pancratistatin ;sarcodictyin ;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾酉享(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼唳氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫 司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素coll (参见例如Agnew，Chem.Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994));蒽环类抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ；埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素 D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN 、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL )和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcelIomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酷酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、撤揽霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、卩票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL )、卡培他滨(capecitabine) ( XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone)和 5_ 氟尿啼P定(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-疏基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鸟 P票呤(thioguanine)；啼卩定类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唳(eniluracil);安口丫P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ;elfornithine ;依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；轻脲(hydroxyurea)；香燕多糖(Ientinan);氯尼达明(Ionidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol) ; 二胺硝卩丫唳(nitracrine);喷司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ;2_ 乙基酸月井(ethylhydrazide);丙卡巴月井(procarbazine)； PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone) ;2，2’，2 "-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是 T-2 毒素、抚孢菌素(verrucarin) A、杆孢菌素(roridin)A 和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine) (ELDSINE ，FILDESIN );达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel) ( TAXOL )、清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) ( TAXOTERE );苯丁酸氮芥(chlorambucil) ;6_ 硫鸟 _呤(thioguanine);疏基票呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin);长春碱(vinblastine) ( VELBAN );钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine) ( ONCOVIN )；奥沙利钼(oxaliplatin);亚叶酸(Ieucovorin);长春瑞滨(vinorelbine) ( NAVELBINE );能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本勝酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid);任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利钼(EL0XATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素齐U，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) ( EVISTA )、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 轻基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene) ( FARESTON );抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant) ( FASLODEX );功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(Ieupix)Iide acetate) (LUPRON 和 ELIGARD )、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4 (5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) ( MEGASE )、依西美坦(exemestane) ( AROMASIN )、福
美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole) ( RIVISOR )、来曲唑(Ietrozole) ( FEMARA )和阿那曲唑(anastrozole) ( ARIMIDEX )。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸钠(etidronate) ( DIDROCAL )、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate) ( ZOMETA )、阿伦膦酸盐(alendronate) ( FOSAMAX )、帕米膦酸盐(pamidronate) ( AREDIA )、替鲁膦酸盐(tiludronate) ( SKELID )或利塞膦酸盐(risedronate) ( ACTONEL );以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍环核苷胞喃唳类似物)；反义寡核苷酸,特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf,H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE 疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓扑异构酶I抑制剂(例如 LURTOTECAN ) ;rmRH ( ABARELIX ); lapatinibditosylate (ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016) ;C0X_2抑制剂，诸如celecoxib(CELEBREX ; 4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-I-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制其生长依赖于HGF/c-met活化的细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期的HGF/c-met依赖性细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药齐U，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vinca)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烧类(taxane)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烧化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_ 氟尿P密唳(fIuorouracil)和 ara_C。其它信息可参见《The Molecular Basis of Cancer)),Mendelsohn 和 Israel 编，第 I 章，题为 “Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs，，，Murakaini 等人，WB Saunders, Philadelphia, 1995,尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))皆为衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL , Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞有丝分裂的抑制。“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10- [ (3-氨基-2，3，6- 二脱氧-a -L-来苏-卩比喃己糖基)氧基]_7，8, 9, 10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2, 3,6-trideoxy-a -L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11-trihydroxy-8- (hydroxyacetyl)-l-methoxy-5, 12_naphthacenedione)0载体、宿主细胞和重组方法为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动 物)起源的。使用原核宿主细胞生成抗体:载体构律可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒PBR322转化大肠杆菌。PBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人,美国专利5，648，237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如、GEM. TM. -11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5’)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型和组成性。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。适用于原核彳百王的启动子包括PhoA启动子、0 _半乳糖昔酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而,在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻 链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist et al. ,Cell 20:269(1980))。在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代碱性磷酸酶、青霉素酶、IPP、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因 此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Probaand Pluckthun, Gene 159:203(1995))。本发明提供了可调控所表达多肽构件的数量比率，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化的表达系统。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。Simmons等人,美国专利5，840，523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化(尽管优选核苷酸序列中的沉默变化)从而生成TIR变体。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al. , METHODS:ACompanion to Methods in Enzymol. 4:151-158 (1992)中详细记载了这种诱变方法。优选的是，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利5，840，523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria),诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E. coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌 B. subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)> 假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P. aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreosci I la)、或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110 (Bachmann, Cellularand Molecular Biology,第 2卷，Washington, D. C.，美国微生物学学会，1987,第 1190-1219页；ATCC保藏号27，325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 A fhuA ( A tonA) ptr3 lac IqlacL8 A ompT A (nmpc-fepE) degP41 kanR 的菌株 33D3(美国专利号 5，639，635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌8、大肠杆菌入1776(410 31,537)和大肠杆菌RV308 (ATCC 31，608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al. , Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例 如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。抗体牛成用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMS0。使用的还有一种技术是电穿孔。在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth) 0在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20°C至约39°C，更优选约25°C至约37°C，甚至更优选约30°C。主要取决于宿主生物体，培养基的PH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6. 8至约7. 4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P 培养基(参见例如 Simmons et al. , J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物,通常通过诸如渗透休克(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1，000至
100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约I升至约100升。在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如0D550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA (具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al. , J. Biol. Chem. 274:19601-19605 (1999) ;Georgiou 等人，美国专利 6, 083, 715;Georgiou 等人，美国专利 6, 027, 888;Bothmannand Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun, J. Biol.Chem. 275:17106-17113(2000);Arie et al. , Mol. Microbiol. 39:199-210(2001))。为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP, Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如 Joly et al. , (1998)见上文；Georgiou 等人,美国专利 5，264，365;Georgiou 等人,美国专利 5，508，192; Hara et al. , Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。抗体纯化在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如S^hadexG-75的凝胶过滤。在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质,它以高亲和力结合抗体 Fe 区。Lindmark et al.，J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白 A 固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。使用真核宿主细胞生成抗体:载体构件通常包括但不限于如下一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。(i)信号序列构件在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疫病毒gD信号。将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。(ii)复制起点通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。(iii)选择基因构件表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨节青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(C)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酌'fe和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4，965，199。(iv)启动子构件表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3’端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、 乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4，419，446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4，601，978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人P -干扰素cDNA还可参见Reyeset al. , Nature 297:598-601 (1982)。或者,可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。(V)增强子元件构件常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、a -胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5’或3’位置，但是优选位于启动子的5’位点。(vi)转录终止构件在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端和偶尔的3’端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见W094/11026及其中公开的表达载体。(vii)宿主细胞的选择和转化适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CVl系(C0S-7，ATCC CRL1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J. Gen.Virol. 36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CH0，Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VER0-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51),TRI 细胞(Matheret al. ,Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) )、MRC 5 细胞、FS4 细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。(viii)宿主细胞的培养可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏 FlO (Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、和 Dulbecco 氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham et al. , Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Barnes et al. , Anal.Biochem. 102:255 (1980);美国专利 4，767，704; 4，657，866; 4，927，762; 4，560，655; 5，122，469;W090/03430;W0 87/00195;或美国专利复审30，985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、PH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。(ix)抗体的纯化在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fe结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人Y I、Y 2、或y4重链的抗体(Lindmark et al. , J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白 G 推荐用于所有小鼠同种型和人Y3(Guss et al. , EMBO J. 5:1567-1575 (1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX 树脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAR0SE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用PH约2. 5-4. 5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0. 25M盐)进行。活性测定法可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。可通过一系列测定法进一步鉴定纯化的免疫球蛋白，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。在本发明的某些实施方案中，对本文在生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、 ELISA (酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供了例示性的抗原结合测定法。在一个实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生成免疫球蛋白的Fe活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fe受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏Fe YR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y RI、FcyRII和FcyRIII。Ravetchand Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)第 464 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR表达。美国专利5，500，362或5，821，337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所公开的。还可进行Clq结合测定法以确认抗体不能结合Clq且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al. , J. TmmunoI. Methods 202:163 (1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。人源化抗体本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al. , Nature332:323-327 (1988) ; Verhoeyen et al.，Science239:1534-1536 (1988))，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)，其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Simset al. , J. Immunol. 151:2296 (1993) ; Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285(1992);Presta et al. , J. Immunol. 151:2623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发
挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。杭体夺体一方面，本发明提供了在构成Fe区的Fe多肽界面中包含修饰的抗体，其中该修饰推动和/促进异多聚化。这些修饰包括将突起导入第一 Fe多肽和将腔导入第二 Fe多肽，其中突起可位于腔中，从而促进第一和第二 Fe多肽的复合。本领域知道生成具有这些修饰的抗体的方法，例如美国专利5，731，168中所述。在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列。可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”,如 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了 FR改变。表A中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表A中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。表A
权利要求
1.一种分离的抗HGFA抗体，其中该抗体的全长IgG形式以20pm或更低的结合亲和力特异性结合人HGFA。
2.权利要求I的抗体，其中该抗体对人HGFA的二价亲和力低于包含下述各项、由下述各项组成或基本上由下述各项组成的抗体的二价亲和力(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 7)的 HVR-L3 ； (d)包含序列 GTYIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ IDNO:6)的 HVR-H3。
3.权利要求I的抗体，其中该抗体结合HGFA残基449，450，452，453，455，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，496，578，579，580，636，637，640，643，644 中至少一个残基、两个残基、三个残基、四个残基、或任何数目残基，直至所有残基，且进一步地其中该抗体变构抑制HGFA并与HGFA活性位点封闭剂KDl或Ac-KQLR-氯甲基酮("KQL R"披露为SEQ ID NO: 10)竞争对HGFA的结合，但不与苄脒竞争对HGFA的结合。
4.权利要求I的抗体，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种、和/或六种选自下组的高变区(HVR)序列(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSNRAPAT (SEQ ID NO: 3)的 HVR-L3 ；(d)包含序列 GITIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ; (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ IDNO:5)的 HVR-H2;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。
5.权利要求4的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含(a)包含序列 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的HVR-L2 ；(c)包含序列QQSNRAPAT (SEQ ID NO:3)的HVR-L3 ;该重链可变区包含(d)包含序列 GITIH (SEQ ID NO: 4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。
6.权利要求5的抗体，其包含轻链可变域，且进一步包含重链可变域，该轻链可变域具有序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8)
7.权利要求5的抗体，其包含重链可变域，且进一步包含轻链可变域，该重链可变域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
8.权利要求5的抗体，其包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVE IKR (SEQ ID NO: 8)，该重链可变域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
9.前述权利要求任一项的抗体,其中该抗体包含人K亚组共有框架序列。
10.前述权利要求任一项的抗体，其中该抗体包含重链人亚组III共有框架序列。
11.权利要求10的抗体，其中该抗体包含第71位或第73位中一个或多个位置处的替代。
12.权利要求11的抗体，其中所述替代是R71A、N73T、或N78A中的一个或多个。
13.前述权利要求任一项的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
14.前述权利要求任一项的抗体，其中该抗体选自下组嵌合抗体，人源化抗体，亲和力成熟抗体，人抗体，和双特异性抗体。
15.前述权利要求任一项的抗体，其中该抗体是抗体片段。
16.—种多核苷酸,其编码权利要求1-15任一项的抗体。
17.—种宿主细胞,其包含权利要求16的多核苷酸。
18.—种用于生成权利要求1-15任一项的抗体的方法,所述方法包括培养权利要求17的宿主细胞，使得该抗体生成。
19.权利要求18的方法，进一步包括自所述宿主细胞回收所述抗体。
20.一种免疫偶联物，其包含权利要求I的抗体和细胞毒剂。
21.一种药物配制剂，其包含权利要求I的抗体和药学可接受载体。
22.权利要求21的药物配制剂，其进一步包含别的治疗剂。
23.作为药物使用的权利要求I的抗体。
24.在治疗癌症中使用的权利要求I的抗体。
25.在抑制血管发生中使用的权利要求I的抗体。
26.在抑制细胞增殖中使用的权利要求I的抗体。
27.权利要求I的抗体在制造药物中的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
29.权利要求27的用途，其中所述药物用于抑制血管发生或抑制细胞增殖。
全文摘要
本发明提供了用于调控肝细胞生长因子激活剂功能的方法和组合物。
文档编号C07K16/40GK102791739SQ201080055074
公开日2012年11月21日 申请日期2010年10月18日 优先权日2009年10月19日
发明者D.科赫霍弗, R.甘尼桑 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司