专利名称：一种纯化包涵体蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程下游蛋白质的纯化过程，具体涉及一种纯化包涵体蛋白质的方法。
背景技术：
在生理条件下，构成蛋白质的多肽链均以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以完成特定的生命活动。当外界环境改变时，如采用特定表达载体过量表达目的蛋白时，就可能使新合成的肽链异常聚积和运输、错误折叠或剪接，导致无生物活性、不可溶的包涵体形成。要溶解包涵体蛋白质，一般得用强变性剂如尿素(6-8M)或盐酸胍(6M)， 通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展而得以溶解；而对包涵体蛋白质的纯化，迄今多在变性条件进行，之后再使纯净的变性蛋白质恢复正常的折叠和空间结构而具有生物活性，即蛋白质的复性。但上述传统的蛋白质纯化过程耗时多、易使纯化中的蛋白质活性受损；且后续的蛋白质复性过程往往导致待纯化蛋白质的大量丧失等，因而极大地阻碍了经济、有效地获得纯净蛋白质的尝试。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纯化包涵体蛋白质的方法，它能快速、有效地纯化蛋白质，更好地保存了蛋白质的天然生物学活性。为解决上述技术问题，本发明纯化包涵体蛋白质的方法，其步骤包括包涵体蛋白质经IPTG诱导并于-80°C保存，将诱导的转化子在4°C离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块加Bind buffer和PMSF超声裂解5次，每次30sec、间隔3min, 4°C离心20min，弃上清液，加入IX bind buffer重悬包涵体团块，超声裂解5次，每次30sec、间隔3min，4°C离心20min，将该上清液加至Ni层析柱，流出液用3倍体积的IX Bind buffer洗涤柱床，再用3倍体积的Wash buffer洗涤柱床洗涤；依次加入各种5 ml复性buffer至Ni层析柱， 收集流出液；再加入5 mlElute buffer至Ni层析柱洗脱目标蛋白；取纯化的培养基上清液加至透析袋，用PBS于4°C透析》i，4°C离心15min沉淀目标蛋白；
所述各种复性buffer次序为
1)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0. 6 M 精氨酸、4 M 尿素，
2)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0. 6 M 精氨酸、2 M 尿素，
3)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0. 6 M 精氨酸、1 M 尿素，
4)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCU20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、0.5 M 尿素。本发明方法将蛋白纯化与变性蛋白层析柱上的原位复性直接结合起来，且采用辅助剂精氨酸助于变性蛋白的复性。可快速、简便、有效地获得具有生物学活性的目标蛋白， 直接降低了纯净重组蛋白的生产成本。具有快速、经济、简便的特点。
图1是本发明中SDS-PAGE检测目标蛋白结果图； 图2是本发明中上清液和沉淀SDS-PAGE鉴定结果图； 图3是本发明中SDS-PAGE分析目标蛋白纯度结果图。
具体实施例方式本发明纯化包涵体蛋白质的方法如下 1.目的基因克隆、鉴定
将目的基因克隆入表达载体中(如pET28a，pET44，pET32, pWH1520，或pBAD等质粒载体)，以载体pET28a为例，经酶切、测序鉴定后，转化入表达菌株BL21(DE3)(也可转化入 Rosetta-gami B (DE3) pLysS，或 Rosetta_gami2 B pLysS)中，加甘油 _80°C保存备用。2.目标蛋白小规模试诱导表达
取-80°C保存的BL21 (DE3)转化子在含抗生素卡那霉素(也可采用氨苄青霉素，或链霉素等合适抗生素)的LB平板上划线，37°C培养箱过夜培养。挑单克隆，接种于5mL LB/ kanamycin (或含与其它载体相符的其它抗生素)培养基，37°C 200rpm振荡培养至0D600为 0.6。加ImM IPTG至上述菌液中继续培养，在lh、2h、iai三个时间点各取约100 μ L菌液， 离心后将上清液以TCA沉淀，细胞团块以2XSDS上样液溶解，上至SDS-PAGE以检测目标蛋白表达。IPTG诱导过的细菌团块于-80°C保存。SDS-PAGE检测目标蛋白结果见图1，其中 泳道1 蛋白分子量标准
泳道2:未诱导
泳道3:lmMIPTGXlh，细胞团块泳道4:lmMIPTGXIh，培养基泳道5:lmMIPTGX池，细胞团块泳道6:lmMIPTGX池，培养基泳道7:lmMIPTGX12h，细胞团块泳道8:lmMIPTGX12h，培养基。3.目标蛋白可溶性分析
3. 1取上述_80°C保存的IPTG诱导过的细菌团块，加500 μ L IX PBS，在冰上超声3 次、每次15sec，间隔3min。3. 2 4°C 12000rpm 离心 15min,收集上清液。3. 3取10 μ L上清液和沉淀作SDS-PAGE鉴定。上清液和沉淀SDS-PAGE鉴定结果见图2，其中 泳道1 蛋白分子量标准
泳道2:未诱导，上清泳道 3:0. 4mM IPTG X4h,上清泳道 4 1 mM IPTG X 4h,上清泳道 5 1 mM IPTG X 4h,上清泳道6:未诱导，沉淀泳道 7 0. 4mM IPTG X 4h,沉淀泳道 8 1 mM IPTG X 4h,沉淀泳道 9:1 mM IPTG X4h,沉淀。4. 重组目标蛋白纯化
4. 1根据上述结果扩大诱导规模至500mL。4.2亲合层析柱的准备将3 mL亲和层析胶体装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱，去除下方的填塞物，用IX bind buffer流洗20 mL后塞住出口，准备注入样本。4. 3样品的准备将大规模(500mL)诱导的转化子在4°C离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块加20mL Bind buffer和200 μ L PMSF超声裂解5次，每次30sec、间隔3min, 4°C离心20min，取上清液。4. 4 弃上清液，加入 IX bind buffer (50 mM phosphate 8.0，300 mM NaCl，10 mM咪唑，8 M尿素)重悬包涵体团块，超声裂解5次，每次30sec、间隔;3min。4. 5 4°C离心20min，将上清液加至Ni层析柱，收集流出液以备检测。4. 6用3倍体积的IX Bind buffer洗涤柱床；再用3倍体积的Wash buffer (50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl,20 mM咪唑、8 M尿素)洗涤柱床(视洗涤效果可升高咪唑浓度至 60—100 mM)。4. 7如下依次加入每种5 ml复性buffer至Ni层析柱，收集流出液以备检测
1)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、4 M 尿素，
2)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、2 M 尿素，
3)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、1 M 尿素，
4)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0. 6 M 精氨酸、0.5 M 尿素。4.8 加入 5 ml Elute buffer (50 mM phosphate 8. 0、300 mM NaCl >250 mM 咪唑) 至Ni层析柱以洗脱目标蛋白，以0.5 χ 10组份收集以便确定洗脱峰。4.9鉴定SDS-PAGE分析纯度，结果见图3，其中 泳道1 蛋白分子量标准
泳道2:流出液泳道3:样品原液泳道4 洗涤/复性泳道5 洗脱组份4 泳道6 洗脱组份5 泳道7 洗脱组份6 泳道 8 =IOyg BSA04. 10取纯化的培养基上清液加至透析袋，在PBS中于4°C搅拌透析池， 40C 12000rpm离心15min，保存上清液。4. 11 Bradford 检测蛋白浓度1· 35 mg/ml χ 7 ml。
权利要求
1. 一种纯化包涵体蛋白质的方法，其步骤包括包涵体蛋白质经IPTG诱导并于-80°c 保存，将诱导的转化子在4°C离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块加Bind buffer和 PMSF超声裂解5次，每次30sec、间隔;3min，4°C离心20min，弃上清液，加入IX bind buffer 重悬包涵体团块，超声裂解5次，每次30sec、间隔3min，4°C离心20min，将该上清液加至Ni 层析柱，流出液用3倍体积的IX Bind buffer洗涤柱床，再用3倍体积的Wash buffer洗涤柱床洗涤；依次加入各种5 ml复性buffer至Ni层析柱，收集流出液；再加入5 ml Elute buffer至Ni层析柱洗脱目标蛋白；取纯化的培养基上清液加至透析袋，用PBS于4°C透析 i，4°C离心15min沉淀目标蛋白； 所述各种复性buffer次序为1)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、4 M 尿素，2)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、2 M 尿素，3)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0.6 M 精氨酸、1 M 尿素，4)50 mM phosphate 8. 0,300 mM NaCl,20 mM 咪唑、0. 6 M 精氨酸、0.5 M 尿素。
全文摘要
本发明公开了一种纯化包涵体蛋白质的方法，将包涵体蛋白质经IPTG诱导并在4℃离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块超声裂解、离心后，弃上清液，加入1Xbindbuffer重悬包涵体团块，超声裂解、离心，将该上清液加至Ni层析柱，流出液用3倍体积的1XBindbuffer洗涤柱床和3倍体积的Washbuffer洗涤柱床洗涤；依次加入含精氨酸的四种复性buffer至Ni层析柱,收集流出液；再加入Elutebuffer至Ni层析柱洗脱目标蛋白；取纯化的培养基上清液加至透析袋，用PBS于4℃透析2h，4℃离心15min沉淀目标蛋白。本发明方法快速、简便、有效地获得具有生物学活性的目标蛋白，降低了生产成本。
文档编号C07K1/34GK102367264SQ201110312089
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者王志超 申请人:太湖瑞晶生物科技有限公司