专利名称：：用于治疗性低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)多价抗体的组合物及使用方法
技术领域：
：本发明涉及多价抗体，其包含针对LRP6上两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域。更具体地，本发明涉及作为LRP6拮抗剂的多价抗体。
背景技术：
：Wnt/￠-连环蛋白途径通过调节￠-连环蛋白的蛋白质稳定性，在发育和组织稳态期间调节多种生物学过程(Clevers等人，(2006)Cell127:469-480;和Logan等人，(2004)Annu.RevCellDev.Biol20:781-810)。在不存在Wnt信号转导的情况下，胞质￠-连环蛋白与P-连环蛋白破坏复合体结合，所述P-连环蛋白破坏复合体包含多种蛋白质，包括腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli)(APC)、Axin和糖原合酶激酶3(GSK3)。在该复合体中，￠-连环蛋白被GSK3组成性磷酸化，并通过蛋白酶体途径降解。Wnt信号通过两种不同的受体，蛇根碱受体Frizzled和单次跨膜蛋白LRP5或LRP6跨质膜转导。Wnt蛋白促进Frizzled-LRP5/6信号复合体的组装，并诱导LRP5/6的胞质PPPSPxS基序被GSK3和酪蛋白激酶I磷酸化。磷酸化的LRP5/6与Axin结合并使P-连环蛋白降解复合体失活。稳定的￠-连环蛋白进入细胞核，与TCF家族转录因子结合，并启动转录。LRP5/6的巨大胞外结构域含有4个YWTD型P-螺旋桨区(每一个YWTD型P-螺旋桨区之后是EGF样结构域)，以及LDLR结构域。每一螺旋桨区含有形成6叶片P-螺旋桨结构的6个YWTD基序。生物化学研究提示，Wnt蛋白质与Frizzled和LRP6二者物理上地结合，并诱导Frizzled_LRP6信号复合体的形成(Semenov等人，(2001)Curr.Biol11,951-961;和Tamai，等人(2000)Nature407,530-535)。除Wnt蛋白质外，LRP5/6的巨大胞外结构域与多种分泌性Wnt调节剂结合，其包括Wnt拮抗剂、DKKl和Sclerostin(SOST)，以及Wnt激动剂R-Spondins。途径组分例如APC和￠-连环蛋白中的突变与人类癌症相关。最近的研究提示，过表达fct蛋白和/或使Wnt拮抗剂例如DKKl、WISP和sFRP沉默促进了癌症发展和进程(Akiri等人，(2009)Oncogene28:2163-2172；Bafico等人，(2004)CancerCell6:497-506；Suzuki等人，(2004)NatGenet.36:417-422；Taniguchi等人，(2005)Oncogene.24:7946-7952;Veeck等人，(2006)Oncogene.25:3479-3488；Zeng等人，(2007)Hum.Pathol.38:120-133)。此外，Wnt信号转导已经涉及肿瘤干细胞的维持(Jamieson等人，(2004)CancerCell6:531-533和Zhao等人，(2007)CancerCell12:528-541)。抗体治疗已经被用作治疗某些癌症的方法。增加各个抗体分子可以结合的抗原决定簇的效价或者数目的尝试导致了双特异性抗体的研发(例如参见Jimenez等人，MolecularCancerTherapeutics2005:4427-434,Lu等人，J.0fTmmun.Methods1999:230，159-171和美国专利公开号20070014794和20050100543)。双特异性抗体是基于免疫球蛋白(Ig)的分子，其与相同或者不同抗原上的两个不同表位结合。该抗体，例如可以是对肿瘤细胞抗原和效应细胞(例如活化的T细胞)或者两个功能性祀标或表位特异的。将双特异性抗体作为治疗剂开发的主要障碍是难以产生用于临床研究的足够数量和质量的抗体。特别地，常规方法，包括杂种杂交瘤(其中融合两种不同的杂交瘤以产生表达两组重链和轻链的细胞)，以及化学缀合(Carter等人，(1995)J.Hematotherapy4:463-70)都难以满足。例如，在杂种杂交瘤中共表达两组不同的IgG轻链和重链可以产生多达10种轻链和重链对，在这些轻链和重链对中仅有一对形成了功能性的双特异性异源二聚体(Suresh等人(1986)MethodsEnzymol.121:210-28)。此外，从非功能性种类，例如由杂种杂交瘤产生的非关联性Ig轻链和重链的同源二聚体和错误配对的异源二聚体中纯化抗体是麻烦的且效率低下的。两个IgG或其片段的化学交联也是效率低下的，并且可能导致抗体活性的丢失(Zhu等人(1994)CancerLett.86:127-34)。由化学缀合引起的多聚体聚集物导致了低的产率(Cao等人(1998)Bioconj.Chem.9:635-44)。因此，存在能以高亲和力结合至少两个或多个表位的功能性的多价抗体的需要。特别地，存在功能性的多价抗体的需要，所述多价抗体用一个以上的修饰配体修饰受体，例如标准的fct信号共受体，LRP6。发明概述本发明提供了与LRP6受体上的多个结合位点结合的新的多价抗体。特别地，本发明提供了抑制标准fct信号途径的LRP6多价抗体。本发明基于这样的发现:多价抗体(例如，单个LRP6双旁原位(biparatopic)抗体)具有抑制螺旋桨1(例如，fctl)和螺旋桨3(例如，Wnt3)配体的能力。此外，出乎意料地，多价抗体(例如，单个LRP6双旁原位抗体)并没有展示显著的Wnt信号增强作用。多价抗体与不同的LRP6β-螺旋桨结构域结合。螺旋桨I抗体与β-螺旋桨I结构域结合，并阻断螺旋桨I依赖的fct，例如Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、WntlOA、WntlOB。螺旋桨3抗体与β-螺旋桨3结构域结合，并阻断螺旋桨3依赖的Wnt，例如Wnt3a和Wnt3。LRP6抗体将螺旋桨I和螺旋桨3配体区分成两种单独的种类，并与LRP6靶受体的不同结合位点结合。在另一种蛋白质例如Wntl或Wnt3配体的存在下，将LRP6抗体的片段(例如，Fab)转变成全长IgG抗体导致了增强Wnt信号的抗体。多价抗体抑制螺旋桨I(例如，Wntl)和螺旋桨3(例如，Wnt3)配体，而不会增强。除了Wnt配体外，预期LRP6螺旋桨I抗体会抑制与其他螺旋桨I结合配体(例如Sclerostin、Dkkl)的相互作用。相似地，预期螺旋桨3抗体会抑制与其他螺旋桨3结合配体(例如Dkkl)的相互作用。此外，可以预期螺旋桨I和3结合抗体会影响其他Wnt信号调节剂，例如R-spondins的活性。多价抗体提供了优于常规抗体的优势，例如扩大了目标库的范围、具有新的结合特异性、效价增加，以及不会增强信号。单个LRP6多价抗体可以与同一细胞上单个LRP6靶受体上的多个β_螺旋桨结构域结合，并抑制fct信号转导。在一个实施方案中，多价抗体与选自螺旋桨1、螺旋桨2、螺旋桨3和螺旋桨4的β-螺旋桨结构域的任一组合结合。在一个实施方案中，多价抗体与LRP6的螺旋桨I和螺旋桨3结构域结合。因此，通过与多个β-螺旋桨结构域结合，单个LRP6多价抗体具有增加的作用效价，并抑制通过每一结构域介导的fct信号转导。例如，单个LRP6多价抗体抑制分别与螺旋桨I和螺旋桨3结构域结合的螺旋桨I和螺旋桨3介导的Wnt信号转导。增加的作用效价可能是由于LRP6多价抗体的提高的亲合力或者更好地结合。因此，在一个方面，本发明涉及分离的多价抗体，其具有针对靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域，其中第一个受体结合结构域与靶受体上的第一结合位点结合，并且第二受体结合结构域与同一靶受体上的第二结合位点结合，其中第一和第二受体结合结构域是连接在一起的，以致第一和第二受体结合结构域与靶受体的第一和第二结合位点的结合抑制标准的fct信号转导途径；并且其中抗体或抗原结合片段并没有展示出Wnt信号的显著的增强。多价抗体具有大约纳摩尔亲和力，或者大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。多价抗体是多价抗体、二价抗体、双特异性抗体或双旁原位抗体。在一个实施方案中，第一和第二受体结合结构域是IgG抗体、scFv片段、单链双抗体、抗体模拟物或者抗体可变结构域。第一和第二受体结合结构域通过接头连接在一起，所述接头具有允许第一和第二受体结合结构域分别与第一和第二结合位点结合的空间分布。在一个实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一个实施方案中，多价抗体具有抑制标准fct信号转导途径例如Wntl信号途径和/或fct3信号转导途径的功能活性。在一个实施方案中，多价抗体具有这样的功能性活性:减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介质的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。在另一方面，本发明涉及分离的多价抗体，其具有针对LRP6靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域，其中第一个受体结合结构域与靶受体上的第一结合位点结合，并且第二受体结合结构域与同一LRP6靶受体上的第二结合位点结合。第一和第二受体结合结构域是连接在一起的，以致第一和第二受体结合结构域与LRP6靶受体的第一和第二结合位点的结合抑制了标准的Wnt信号转导途径，并且抗体或抗原结合片段并没有展示出Wnt信号的显著的增强。在一个实施方案中，抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。在另一个实施方案中，抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。在一个实施方案中，第一受体结合结构域是IgG抗体，并且第二受体结合结构域是scFv片段,其中IgG抗体和scFv片段通过接头连接在一起,所述接头具有允许IgG抗体和scFv片段分别与LRP6的第一和第二表位结合的空间分布。在一个实施方案中，接头是选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3的甘氨酸-丝氨酸接头。在一个实施方案中，LRP6靶受体的第一表位是P-螺旋桨I结构域，并且LRP6靶受体的第二表位是￠-螺旋桨3结构域。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段与LRP6螺旋桨I结构域结合，并包含选自SEQIDN0:USEQIDN0:21和SEQIDNO:47的重链CDRl;选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:22和SEQIDNO:48的CDR2;和选自SEQIDNO:3,SEQIDN0:23和SEQIDNO:49的CDR3;和选自SEQIDNO:4、SEQIDN0:24和SEQIDNO:50的轻链CDRl;选自SEQIDNO:5、SEQIDN0:25和SEQIDNO:51的CDR2;和选自SEQIDNO:6、SEQIDNO:26和SEQIDN0:52的CDR3。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段与LPR6^-螺旋桨3结构域结合，并包含选自SEQIDNO:69,SEQIDN0:93和SEQIDNO:115的重链CDRl;选自SEQIDNO:70,SEQIDN0:94和SEQIDNO:116的CDR2;和选自SEQIDNO:71、SEQIDNO:95和SEQIDNO:117的CDR3;和选自SEQIDNO:72,SEQIDNO:96和SEQIDNO:118的轻链CDRl;选自SEQIDNO:73,SEQIDNO:97和SEQIDNO:119的CDR2;和选自SEQIDNO:74,SEQIDNO:98和SEQIDN0:120的CDR3。在一个实施方案中，IgG重链抗体选自SEQIDNO:18、66和101，并且轻链选自SEQIDNO:17、86和85。在一个实施方案中，scFv选自SEQIDNO:142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162和164。在一个实施方案中，scFv片段包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段比较，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。在一个实施方案中，多价抗体具有抑制选自Wntl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准Wnt信号转导途径的功能性活性。在另一个实施方案中，多价抗体具有这样的功能性活性:减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介质的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。在另一方面，本发明涉及分离的双旁原位抗体，其包含与LRP6靶受体上的β-螺旋桨I结构域结合的IgG抗体和与LRP6靶上的β-螺旋桨3结构域结合的scFv，其中IgG抗体和scFv通过接头连接，以致IgG抗体和scFv与β-螺旋桨I结构域和β_螺旋桨3结构域分别结合来抑制标准的fct信号转导途径，并且其中双旁原位抗体并没有表现出fct信号的显著的增强。在一个实施方案中，抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。在另一实施方案中，抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。在一个实施方案中，接头包含允许IgG抗体和scFv片段分别与LRP6的β-螺旋桨I结构域和LRP6的β-螺旋桨3结构域结合的空间分布。在一个实施方案中，scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的Fe结合位点连接,其中丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)315在另一个实施方案中，IgG抗体的Fe结合位点是CH3结构域。在另一个实施方案中，scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的轻链连接，其中丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3。在一个实施方案中，scFv包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段比较，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。在一个实施方案中，抗体包含SEQIDNO:1的重链可变区CDRl;SEQIDN0:2的重链可变区CDR2；SEQIDNO:3的重链可变区CDR3；SEQIDNO:4的轻链可变区CDRl；SEQIDNO:5的轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:6的轻链可变区CDR3，其中所述抗体与LRP6的β-螺旋桨I结构域结合；并且scFv包含SEQIDNO:69的重链可变区CDRl；SEQIDNO:70的重链可变区CDR2；SEQIDN0:71的重链可变区CDR3；SEQIDNO:72的轻链可变区CDRl；SEQIDN0:73的轻链可变区CDR2JPSEQIDNO:74的轻链可变区CDR3结合，其中scFv与LRP6的β-螺旋桨3结构域结合。在一个实施方案中，抗体还包含SEQIDΝ0:166的第454位处的赖氨酸缺失。在一个实施方案中，抗体还包含SEQIDNO:166的677位处脯氨酸至丙氨酸的突变。在一个实施方案中，抗体包含选自SEQIDNO:166、171、173、175、195、201和207的重链序列，以及选自SEQIDΝ0:170、193、199和205的轻链序列。在一个实施方案中，抗体包含选自SEQIDN0:166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205和195/193的重链序列和轻链序列的组合。在一个实施方案中，抗体包含具有SEQIDNO:166/170的重链序列和轻链序列。在一个实施方案中，抗体包含具有SEQIDNO:177/181的重链序列和轻链序列。在一个实施方案中，抗体具有抑制选自fctl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准Wnt信号转导途径的功能性活性。在另一个实施方案中，抗体具有这样的功能性活性:减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介质的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。在另一方面，本发明涉及分离的双旁原位抗体，其包含与LRP6靶受体上的P-螺旋桨3结构域结合的IgG抗体和与LRP6靶上的P-螺旋桨I结构域结合的scFv，其中IgG抗体和scFv通过接头连接，以致IgG抗体和scFv分别与P-螺旋桨3结构域和P-螺旋桨I结构域的结合抑制标准的fct信号转导途径，并且其中所述双旁原位抗体并没有展示出fct信号的显著增强。在一个实施方案中，抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。在另一个实施方案中，抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。在一个实施方案中，接头包含允许IgG抗体和scFv片段分别与LRP6的P-螺旋桨3结构域和LRP6的P-螺旋桨I结构域结合的空间分布。在一个实施方案中，scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的Fe结合位点连接，其中所述丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)JP(Gly4Ser)3。在一个实施方案中，IgG抗体的Fe结合位点是CH3结构域。在一个实施方案中，scFv包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段比较，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。在一个实施方案中，抗体包含SEQIDNO:69的重链可变区CDRl；SEQIDNO:70的重链可变区CDR2;SEQIDN0:71的重链可变区CDR3;SEQIDNO:72的轻链可变区CDRl；SEQIDNO:73的轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:74的轻链可变区CDR3，其中所述抗体与LRP6的3-螺旋桨3结构域结合；scFv具有SEQIDNO:1的重链可变区CDRl；SEQIDNO:2的重链可变区CDR2；SEQIDNO:3的重链可变区CDR3；SEQIDNO:4的轻链可变区CDRl；SEQIDN0:5的轻链可变区CDR2JPSEQIDNO:6的轻链可变区CDR3，其中所述scFv与LRP6的^-螺旋桨I结构域结合。在一个实施方案中，scFvVH和VL用包含3个氨基酸的接头连接。在另一个实施方案中，scFvVH和VL用包含4个氨基酸的接头连接。在一个实施方案中，抗体包含选自SEQIDNO:187和189的重链序列；和包含SEQIDNO:185的轻链序列。在一个实施方案中，抗体具有抑制选自fctl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准Wnt信号转导途径的功能性活性。在另一个实施方案中，抗体具有这样的功能性活性:减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介质的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸。在一个方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含选自SEQIDN0:166、171、173、175、195、201和207的重链序列；和选自SEQIDNO:170、193、199和205的轻链序列。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含选自SEQIDN0:166、171、173、175、193、199、201和207的重链序列；和至少选自SEQIDNO:170、195和205的轻链序列，其中抗体或抗原结合片段具有与SEQIDNO:166、171、173、175、195、201和207的98%的序列同一性;并且轻链序列选自SEQIDNO:170、193、199和205。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含SEQIDNO:166和SEQIDNO:170。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含与SEQIDNO:166和SEQIDNO:170至少98%的序列同一性。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:177的序列；和SEQIDNO:181的轻链序列。在另一方面，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含与SEQIDNO:177至少98%的序列同一性；和SEQIDNO:181的轻链序列。在另一实施方案中，本发明涉及包含编码多价抗体的核苷酸序列的核酸，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:187和189的序列；和SEQIDNO:185的轻链序列。在另一方面，本发明涉及编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含与SEQIDNO:187和189至少98%的序列同一性；和SEQIDNO:185的轻链序列。在另一方面，本发明涉及包含本发明核酸的载体。在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含具有针对靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域的多价抗体和可药用载体。在另一方面，本发明涉及获得本发明多价抗体的方法，其包括a)提供与LRP6靶受体的第一结合位点结合的第一受体结合结构域；(b)提供与LRP6靶受体的第二结合位点结合的第二受体结合结构域；和(c)将第一受体结合结构域与第二受体结合结构域连接。在一个实施方案中，第一或第二受体结合结构域选自IgG抗体、scFv片段、单链双抗体、抗体模拟物和抗体可变结构域。在一个实施方案中，第一和第二受体结合结构域通过接头连接在一起，所述接头具有允许第一和第二受体结合结构域分别与LRP6的第一和第二表位结合的空间分布。在一个实施方案中，接头是选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3的甘氨酸-丝氨酸接头。在一个实施方案中，本方法进一步包括将至少一个氨基酸突变引入到第一或第二受体结合结构域中，以致与未突变的第一或第二受体结合结构域比较，所述氨基酸突变提高了第一或第二受体结合结构域的稳定性。在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达的癌症的受试者(例如，人类)，给需要的受试者施用有效量的组合物，其包含具有针对靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域的多价抗体。在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达的癌症的受试者，给需要的受试者施用有效量的组合物，其包含具有针对靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域的多价抗体，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在另一方面，本发明涉及使用针对LRP6的双旁原位抗体治疗由标准Wnt信号途径介导的疾病的方法。在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达的癌症的受试者，给所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含具有选自SEQIDNO:166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205和195/193的重链和轻链序列的抗体，以及结合任一标准护理癌症疗法。在另一方面，本发明涉及多价抗体在生产用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。在另一方面，本发明涉及具有SEQIDIDIDNO:82的VH；SEQIDNO:81的VL的多价抗体在治疗通过标准Wnt信号途径介导的癌症中的用途。在另一方面，本发明涉及具有SEQIDIDIDNO:82的VH；SEQIDNO:81的VL的多价抗体，其用作药物。在另一方面，本发明涉及具有SEQIDNO:166和SEQIDNO:170的多价抗体，其用于治疗通过标准fct信号途径介导的癌症。在另一方面，本发明涉及具有SEQIDNO:166和SEQIDNO:170的多价抗体，其用作药物。在另一方面，本发明涉及多价抗体，用作药物。在另一方面，本发明涉及多价抗体，用作治疗表达LRP6的癌症的药物。在另一方面，本发明涉及多价抗体，作为用于治疗表达LRP6的癌症的药物，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。附图简述图1是显示所选择的Fab在PAl细胞、U266细胞和Daudi细胞上的FACSEC50测定，以及相应的mRNA表达数据(A)和通过shRNA击倒LRP6及相应的mRNA表达数据B的图；图2A-L是显示在表达Wntl或Wnt3A配体的HEK293T/17STF细胞(报道基因测定)中抗LRP6Fab片段活性的图。数据显示，抗LRP6Fab选择性阻断Wntl或Wnt3信号转导；图3显示抗LRP6^螺旋桨I和P螺旋桨3抗体对人、小鼠和猕猴的交叉反应值；图4是显示在HEK293T/17STF细胞(报道基因测定)中多种WNT配体的瞬时表达并用抗LRP6抗体处理的图，其显示，基于抗体与LRP6的特定P螺旋桨区的结合/阻断，特定WNT的活性抑制；图5是显示Fab转变成IgG导致来自未阻断的Wnt配体的信号增强的柱状图；图6是显示在细胞系统中选择性靶向抑制LRP6的蛋白质印迹；图7是显示在啮齿动物中，以5mg/kg单次静脉内施用与P螺旋桨I区结合的LRP6抗体的图；图8A是显示将单剂量的M0R08168(5mg/kg)施用给携带MMTV-Wntl肿瘤的小鼠后8小时，MMTV-Wntl肿瘤中相对于t=0对照上调>2倍的基因的表(调整的P值<0.01)和图8B是显示相对于t=0对照下调>2倍的基因的表(调整的P值<0.01)；图9A是显示在MMTV-Wntl模型中，螺旋桨ImAb，而不是螺旋桨3mAb在体内引起肿瘤消退的图。图9B是显示不同剂量的螺旋桨ImAb对MMTV-Wntl肿瘤模型生长的影响的图；图10是显示在MMTV-Wnt3模型中，螺旋桨3mAb，而不是螺旋桨ImAb引起肿瘤生长抑制的图；图11是显示在PA-1细胞中，螺旋桨3mAb，而不是螺旋桨ImAb在体内引起Wnt3A诱导的SuperTopFlash活性的抑制的图；图12是显示通过HDxMS测定的与M0R06475结合的LRP6PD3-4的经溶剂保护的区域(A)和导致丧失结合scFvM0R06475的特定残基突变的图(B)；图13是显示LRP6的β螺旋桨区的图；图14是显示从大肠杆菌中成功表达并纯化的全部scFv分子的SDS-PAGE凝胶的照片；图15A-D是多价抗体的图例。(15A)与完全IgG的羧基端连接的SCFVSCFV(15B)与Fe的氨基端连接的scFvscFv(15C)与Fe的羧基端连接的scFvscFv(15D)与Fe的氨基端和羧基端连接的scFvscFv；图16是显示在非还原(泳道I)和还原(泳道2)条件下纯化的双旁原位抗LRP6IgGscFv的SDS-PAGE凝胶的照片；图17显示双旁原位抗体和单独的各个组分部分在STF测定中的活性；图18显示scFv分子中，接头长度比较在STF测定中的活性；图19是显示双旁原位抗体的结合活性的表；图20显示了在PA_1/Wnt3aL细胞共培养模型中双旁原位抗体和Prop3抗体，而不是Propl抗体的活性；图21是显示在啮齿动物中，对比以5mg/kg单次静脉内给药ProplLRP6抗体和Prop1/3双旁原位抗体的图；图22是显示在MMTV-Wntl模型中螺旋桨I和双旁原位螺旋桨1/3抗体二者在体内引起肿瘤消退的图；图23是显示在MMTV-Wntl模型中，Propl/3结合双旁原位抗体的剂量应答关系的图；图24显示小鼠MMTV-WntI乳房肿瘤的分化受拮抗性LRP6抗体诱导。A-B)将MMTV-Wntl肿瘤的片段皮下移植到裸鼠中。用单剂量的PBS(对照)或5mg/kgM0R08168IgGlLALA6475scfv处理携带肿瘤的小鼠。A)油红O染色脂质的代表性图像。B)油红O染色的定量。图标表示为平均值土SEM值。在72小时组中n=4，在24小时组中n=3，在5天组中n=2，并且对于PBS(对照)n=l;图25是显示在E-钙粘着蛋白阴性的MDA-MB231异种移植模型中，结合Propl/3的双旁原位抗体的活性的图；图26显示M0R08168、M0R06475和M0R08168IgGlLALA6475scfv与重组LRP6PD1/2和TO3/4的亲和力和结合动力学。A)如通过Biacore分析测定，亲和力和开/关速率的总结表。B)抗LRP6分子与相应的LRP6受体结构域，PD1/2和TO3/4的代表性结合曲线。C)LRP6PD1/2和PD3/4与M0R08168IgGlLALA6475scfv的相继结合；图27显示基于IgG的双旁原位抗体的示意图；图28是显示大肠杆菌中抗LRP6scFv表达的优化的SDS-PAGE凝胶照片；图29是显示M0R06475scFv中单突变对Tm的影响的表。图30是显示M0R08168scFv中单突变对Tm的影响的表；图31是显示在细菌和哺乳动物系统中均表达的物质中，在M0R08168scFv中双突变对Tm的影响的表；图32是总结在ELISA、Proteon亲和力和报告基因测定中，野生型和M0R06475和M0R08168scFvs的单/双突变形式的结合和功能性活性的表；图33是设计的突变的所选择的实例的图解。在全部图中，蛋白质骨架以带状图表示，而所选择的侧链表示为棒状。(a):在8(^成475的同源性模型中，￥11:137与两个芳香族残基(VL:F98和VH:W103)邻近。(b)在scFv6475的VH:137F突变体中，VH:F37和VH:W103可以形成垂直的P1-Pi堆积相互作用，而VH:F37和VL:F98可以形成另一垂直的pi_pi堆积相互作用。(c)在scFv8168的同源性模型中，疏水残基VH:V33与极性残基VH=NlOOa邻近。⑷同源性建模提示，在scFv8168的VH:V33N突变体中，VH:N33侧链可以与VH:NlOOa形成氢键。两个残基之间的氢键通过键表示。(e):在scFv8168的同源性模型中，带电荷残基VH:K43并不与疏水残基VH:V85形成盐桥。(f):由于scFv8168上的VH:V85E突变，VH:K43和VH:E85的两个带电荷的侧链可以形成盐桥。两个带电荷基团之间的距离可以为图34是显示双旁原位抗体的热稳定性测量的表。发明详述为了可以更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其他定义在详细说明中给出。如本文中所用，术语“免疫应答”指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞，以及由上述细胞或者肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致了从人体选择性损伤、破坏或者清除侵入病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或者病理炎症情况下，正常的人类细胞或组织。如本文中所用，术语“信号转导途径”或“信号活性”指通常由蛋白质-蛋白质相互作用，例如生长因子与受体的结合引发的生物化学因果关系，导致信号从细胞的一个部分传递到细胞的另一部分。对于LRP6，传递涉及引起信号转导的一系列反应中一个或多个蛋白质上一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。次末端的过程通常包括导致基因表达改变的核事件。如本文中所用，术语“Wnt信号途径”指标准Wnt途径，其中分泌的蛋白质配体的Wnt家族成员结合LRP和Frizzled(FZD)的受体复合体,允许P_连环蛋白转移到核中，与LEF/TCF转录因子相互作用，并激活靶基因表达。如本文中所述，可以使用fct报告基因测定或者fct定向信号转导(例如，LRP6磷酸化、￠-连环蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量方法来测量fct信号途径。术语“WntI信号途径”指通过LRP6与Wntl配体和Wntl结合配体种类，例如Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、WntlOa或WntlOb相互作用激活的标准Wnt途径。术语“Wnt3信号途径”指通过LRP6与Wnt3或者Wnt3a配体相互作用激活的标准Wnt途径。术语“LRP6”指如在登录号NP002327中所定义的人类LRP6。如本文中所用，术语“抗体”指与LRP6表位相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并抑制信号转导的完全抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每一重链由重链可变区(在本文中简称为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CHUCH2和CH3组成。每一轻链由轻链可变区(在本文中简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，CL组成。VH和\区可以进一步细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其散布于更保守的区域(称为构架区(FR))中。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。术语“抗体”包括例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’)片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)，以及上述任一的表位结合片段。抗体可以是任一同种型(例如，IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY)、种类(例如，IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。可以将轻链和重链二者分成结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”被功能性地使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，例如分泌、经胎盘的流动性、Fe受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基端越远，它的编号越大。氨基端是可变区，并且羧基端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。特别地，术语“抗体”具体包括如图12A-D所示的IgG-scFv形式。术语“受体结合结构域”或“RBD”指结合分子(例如，抗体)的一部分，其与靶受体上的结合位点特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。RBD还指抗体的一个或多个片段，其保留了与LRP6表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力，并抑制信号转导。抗体片段的实例包括但不限于，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的scFv、Fab片段、单价片段；F(ab)2片段、包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546);以及分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段、VL和VH的两个结构域通过单独的基因编码，但是可以通过能使它们形成单一蛋白质链的合成接头，使用重组方法连接它们，其中VL和VH区配对，以形成单价分子(称作单链Fv(scFv);参见例如Bird等人，(1988)Science242:423-426;和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.85:5879-5883)。此类单链抗体也意图被包括在术语“抗体片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选以与完整抗体相同的方式应用的片段。还可以将抗体片段掺入到“单结构域抗体”、“大型抗体”、“小型抗体”、“双抗体”、“三抗体”、“四抗体”、“v-NAR”和“双-scFv”中(参见，例如，Hollinger和Hudson,(2005)NatureBiotechnology23:1126-1136)。还可以将抗体片段移植到基于多肽，例如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6，703，199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。还可以将抗体片段掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补轻链多肽一起形成了一对抗原结合区(Zapata等人，(1995)ProteinEng.8:1057-1062;和美国专利号5，641，870)。RBD还包括单结构域抗体、大型抗体、单抗体(unibody)、小型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,(2005)NatureBiotechnology23:1126-1136)、双特异性单链双抗体或者设计成结合两个不同表位的单链双抗体。RBD还包括抗体样分子或者抗体模拟物，其包括但不限于，特异性结合表位的小型抗体、大型抗体、基于Fn3的蛋白质骨架、Ankrin重复(还称为DARpin),VASP多肽、鸟胰多肽(aPP)、四连接素(Tetranectin)、Affililin、Knottin、SH3结构域、PDZ结构域、淀粉酶抑肽、新制癌菌素、A蛋白结构域、脂质运载蛋白、转铁蛋白，以及Kunitz结构域，它们都在本发明的范围内。术语“多价抗体”指具有多于一效价的单结合分子，其中效价描述为每一分子的抗体构建体中存在的抗原结合部分的数目。因此，单结合分子可以与靶受体上一个以上的结合位点结合。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等，以及双特异性抗体和双旁原位抗体。例如，对于LRP6受体，多价抗体(例如，LRP6双旁原位抗体)分别具有LRP6的P-螺旋桨I结构域结合位点的结合部分和P-螺旋桨3结构域结合位点的结合部分。术语“多价抗体”还指具有针对两个分离的靶受体的一个以上抗原结合部分的单个结合分子。例如，与LRP6靶受体和并非LRP6的第二靶受体(例如ErbB、cmet、IGFRUSmoothened、Notch受体)都结合的抗体。在一个实施方案中，多价抗体是具有4个受体结合结构域的四价抗体。四价分子可以是对靶受体上的每一结合位点双特异性的和二价的。多价抗体介导生物学效应(例如，其调节细胞活化(例如，通过与细胞表面受体结合，并导致传递或者抑制活化或者抑制信号)、其导致细胞死亡(例如，通过细胞信号诱导途径)或者其通过介导或促进细胞杀死或者通过调节生物可利用的物质的量，在受试者中调节疾病或者病症)。如本文中所用，术语“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LRP6的分离抗体基本上不含特异性结合非LRP6的抗原的抗体)。然而，特异性结合LRP6的分离的抗体可以具有与其他抗原，例如来自其他物种的LRP6分子的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。如本文中所用，术语“单价抗体”指与靶受体例如LRP6上的单个表位结合的抗体。如本文中所用，术语“二价抗体”指与至少两个相同靶受体(例如，与两个LRP6受体的P-螺旋桨I结构域结合的抗体或者与两个LRP6受体的P-螺旋桨3结构域结合的抗体)上的两个表位结合的抗体。二价抗体还可以使靶受体之间互相交联。“二价抗体”还指与至少两个相同靶受体上的两个不同表位结合的抗体。如本文中所用，术语“双旁原位抗体”指与相同靶受体上的两个不同表位结合的抗体，例如与单个LRP6受体的β-螺旋桨I结构域和β-螺旋桨3结构域结合的抗体。该术语还包括与至少两个LRP6受体的β-螺旋桨I和β-螺旋桨3结构域都结合的抗体，例如，四价双旁原位抗体。如本文中所用，术语“双特异性抗体”指与至少两个不同靶受体(例如，LRP6受体和不是LRP6受体的受体)上的两个或两个以上不同表位结合的抗体。如本文中所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本相同的氨基酸序列或者来源于相同的遗传来源的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。该术语还包括单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示出对特定表位的单一的结合特异性和亲和性。如本文中所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都衍生自人来源的序列。此外,如果抗体含有恒定区,那么恒定区也衍生自此类人的序列,例如人种系序列或者人种系序列的突变形式或者含有衍生自人构架序列分析的共有构架序列的抗体，例如，如Knappik，等人(2000.JMolBiol296，57-86)所述。可以使用熟知的编号方案，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案或者Kabat和Chothia的组合定义免疫球蛋白可变区，例如CDR的结构和位置(参见,例如SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(1991),Kabat等人编著；AlLazikani等人，(1997)J.Mol.Bi0.273:927948;Kabat等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，NIH公布号91-3242U.S.DepartmentofHealthandHumanServices;Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人,(1989)Nature342:877-883;和Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273:927-948)。本发明的人抗体可以包括并不由人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或者位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变弓I入突变，或者保守替换以促进稳定性或者产生)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”并不意在包括这样的抗体，其中已经将衍生自另一哺乳动物物种的种系(例如小鼠)的CDR序列移植到人构架序列上。如本文中所用，术语“重组的人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或者分离的全部人抗体，例如分离自人类免疫球蛋白基因的转基因或者转染色体动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤的抗体、分离自经转化的表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)的抗体、分离自重组的、组合的人抗体文库的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因、序列的全部或者一部分剪接至其他DNA序列的任一其他方法制备、表达、产生或者分离的抗体。此类重组的人抗体具有这样的可变区，其中构架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。而在某些实施方案中，可以将此类重组的人抗体进行体外诱变(或者，当使用了人类Ig序列转基因的动物时，可进行体内体细胞诱变)，这样重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以不是体内人抗体种系库内天然存在的序列，尽管其衍生自人类种系VH和VL序列并与人类种系VH和VL序列相关。如本文中所用，术语“接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽接头，其用于将scFv与IgG连接。示例性的甘氨酸/丝氨酸接头包含氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)2,即(Gly2Ser)n,其中η是等于或者大于I的正整数。例如η=1、η=2、η=3、η=4、η=5和η=6、η=7、η=8、η=9和η=10。在一个实施方案中，接头包括但不限于，(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，为了更好的可溶性，将接头的谷氨酸和赖氨酸残基散布于甘氨酸-丝氨酸接头内。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在另一个实施方案中，接头包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)的组合和并联。在另一个实施方案中，丝氨酸可以用丙氨酸替换，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)15在另一个实施方案中，接头包含甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸的任一组合。又在另一个实施方案中，接头包含基序(GluAlaAlaAlaLys)n,其中n是等于或者大于I的正整数。如本文中所用，术语“Fe区”指包含抗体的CH3、CH2和恒定区的铰链区的至少一部分的多肽。任选地，Fe区可以包括在一些抗体种类中存在的CH4结构域。Fe区可以包含抗体恒定区的整个铰链区。在一个实施方案中，本发明包含抗体的Fe区和CHl区。在一个实施方案中，本发明包含抗体的Fe区的CH3区。在另一个实施方案中，本发明包含抗体恒定区的Fe区、CHl区和Ck/X区。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区。在一个实施方案中，与野生型恒定区比较，该恒定区是经修饰的。即，本文中所公开的本发明多肽可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)的一个或多个和/或对轻链恒定区(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。可以包括此类改变，以优化效应功能、半寿期等。如本文中所用，术语“结合位点”包含靶受体上被抗体或抗原结合片段选择性结合的区域。例如，LRP6上的结合位点包括P-螺旋桨I结合结构域、3-螺旋桨2结合结构域、^-螺旋桨3结合结构域和P-螺旋桨4结合结构域。如本文中所用，术语“表位”指能用高亲和力与免疫球蛋白结合的任一决定簇。表位是特异性靶向抗原的抗体结合的抗原的区域，并且当抗原是蛋白质时，所述表位包括直接接触抗体的特定氨基酸。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在一些情况中，其可以存在于其他类型的分子，例如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或者磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原特异的抗体将与蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位结合。可以使用本领域熟知的许多表位作图技术鉴定包括表位的给定多肽的区域。参见，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷(GlennE.Morris编著，1996)HumanaPress,Totowa,NewJersey。例如，可以通过例如，在固相支持物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的一部分，并使肽与抗体反应(而肽仍与支持物连接)来确定线性表位。此类技术是本领域已知的，并且描述于例如，美国专利号4，708，871；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA8:3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:78-182；Geysen等人，(1986)Mol.1mmunol.23:709-715中。相似地，例如通过如X射线结晶学和二维核磁共振确定氨基酸的空间构象，可以很容易地鉴定构象表位。参见，例如EpitopeMappingProtocols,同上。还可以使用标准抗原性和亲水性图，例如使用例如可获自OxfordMolecularGroup的Omiga版本1.0软件程序计算的那些标准抗原性和亲水性图来鉴定蛋白质的抗原区。该计算机程序使用Hopp/Woods方法，Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.SciUSA78:3824-3828;来测定抗原性谱，且使用Kyte-Doolittle技术，Kyte等人，(1982)J.Mo1.Biol.157:105-132;来进行亲水性作图。术语两个实体之间“特异性结合”指的是具有这样的平衡常数(Ka)(kon/koff)的结合:至少IO2M'至少5XIO2M'至少IO3M'至少5XIO3M'至少IO4M'至少5XIO4M'至少IO5M'至少5XIO5M'至少IO6M'至少5XIO6M'至少IO7M'至少5XIO7M'至少IO8M'至少5XIO8M'至少IO9M'至少5XIO9M'至少IO10M'至少5XIOiqM'至少IO11M'至少5XIO11M'至少IO12M'至少5XIO12M'至少IO13M'至少5XIO13M'至少IO14M'至少5XIO14M'至少IO15IT1或者至少5XIO15M'术语与LRP6多价抗体(例如，双旁原位抗体)“特异地(选择性地)结合”指决定相关抗原(例如，人类LRP6)在蛋白质和其他生物制品的异源群体中存在的结合反应。除平衡常数(Ka)夕卜，本发明LRP6多价抗体通常还具有大约这样的解离速率常数(Kd)(koff/kon):小于5X1(Γ2Μ、小于1(Γ2Μ、小于5X1(Γ3Μ、小于1(Γ3Μ、小于5X1(Γ4Μ、小于1(Γ4Μ、小于5Χ1(Γ5Μ、小于1(Γ5Μ、小于5Χ1(Γ6Μ、小于1(Γ6Μ、小于5Χ1(Γ7Μ、小于1(Γ7Μ、小于5Χ1(Γ8Μ、小于1(Γ8Μ、小于5Χ1(Γ9Μ、小于1(Γ9Μ、小于5X1(T1QM、小于1(Γ10Μ、小于5Χ1(ΓηΜ、小于1(ΓηΜ、小于5X1(Γ12Μ、小于1(Γ12Μ、小于5X1(Γ13Μ、小于1(Γ13Μ、小于5X1(Γ14Μ、小于1(Γ14Μ、小于5Χ10_15Μ、或小于1父10_1或者更低，并且所述1^6多价抗体以比其与非特异性抗原(例如，HSA)至少大两倍的亲和力与LRP6结合。在一个实施方案中，如使用本文中所述的或者本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定法、ELISA、FACS,SET)(BiacoreInternationalAB,Uppsala,瑞典)评估的，LRP6多价抗体具有小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于ΙΟΟΟρΜ、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于ΙΟΟρΜ、小于75pM、小于10pM、小于IpM的解离常数(Kd)。如本文中所用，术语“Kass。。”或“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，然而如本文中所用，术语“Kdis”或“Kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文中所用，术语“KD”指解离常数，其获自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的Kd值可以使用本领域成熟的方法测定。用于测定抗体的Kd的方法是使用表面等离振子共振或者使用生物传感器系统，例如βκοπ系统。如本文中所用，术语“亲和力”指抗体和抗原之间在单个抗原性位点相互作用的强度。在每一抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力在多个位点与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文中所用，术语“亲合力”(avidity)指抗体-抗原复合体的整体稳定性或强度的信息性量度。亲合力受三个主要因素控制:抗体表位亲和力；抗原和抗体二者的效价；以及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素限定了抗体的特异性，即特定抗体与精确的抗原表位结合的可能性。如本文中所用，术语“Wntl”指Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、WntlOa或WntlObo如本文中所用，术语“Wnt3a”指Wnt3a和Wnt3。如本文中所用，术语“增强”指这样的过程，其中在Wnt配体存在的情况下，通过将抗体的片段转变成全长IgGLRP6抗体来活化和增强Wnt信号。术语“未显著增强”或者“避免增强”指与结合相同表位的对照抗体或其片段比较，Wnt信号没有被激活或者增强。未显著增强可以是比对照抗体或其片段低至少10%，比对照抗体或其片段低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。如本文中所用，术语“簇”指将LRP6受体聚集或者集合在一起并增强Wnt信号转导的任一蛋白质。此类蛋白质的实例包括但不限于，Wntl配体、Wnt3a配体和Wnt3配体。这些蛋白质可以引起多聚化，例如，两个内源LRP6受体的二聚化。由于增强了LRP6的相互作用，这种二聚化可以导致亲合力的增加，所述二聚化在fct配体存在的情况下可以增强Wnt信号。术语“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同的或者基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸并不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任一给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的每一位置处，在不改变所编码的多肽的情况下，可以将密码子改变成任一所描述的相应密码子。此类核酸变异为“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一个种类。在本文中编码多肽的每一核酸序列还描述了核酸的每一可能的沉默变异。技术人员应当意识到，可以修饰核酸中的每一密码子(除AUG外，其通常仅编码甲硫氨酸，以及TGG，其通常仅编码色氨酸)，以产生在功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异都包含于每一所述的序列中。对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的个别取代、缺失或添加，其导致用在化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体有且不排除多态变体、种间同源物，以及本发明的等位基因。以下八组含有相互保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(U、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指没有显著影响或者改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。术语“交叉阻断(cross-block)”和“交叉阻断的(cross-blocked)”在本文中可互换使用，指的是在标准竞争结合测定法中，多价抗体干扰其他抗体或者结合剂与LRP6结合的能力。可以使用标准竞争结合测定法，测定多价抗体能干扰另一抗体或结合分子与LRP6结合的能力或程度，并由此确定是否可将其称为根据本发明的交叉阻断。一种合适的测定法涉及Biacore技术的使用(例如，通过使用BIAcore3000仪器(Biacore,Uppsala,瑞典))，其使用表面振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一测定法使用基于ELISA的方法。如本文中所用，术语“经优化的”指已经将核苷酸序列改变成使用在生产细胞或生物中优选的密码子编码氨基酸序列，所述生产细胞或生物通常是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)的细胞、木霉属(Trichoderma)的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者人类细胞。经优化的核苷酸序列是经改造的，以完全地或者尽可能地保留由起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)原始编码的氨基酸序列。评价多价抗体与多种物种的LRP6的结合能力的标准测定法是本领域已知的，其包括例如，ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的测定法详细描述于实施例中。还可以通过本领域已知的标准测定法，例如通过Biacore分析评估多价抗体的结合动力学(例如，亲和力)。评价多价抗体对LRP6的功能性质的影响的测定法(例如，受体结合测定法、调节fct途径或者IgG产生)进一步详细描述于实施例中。因此，将理解，如根据本领域已知的和本文中所述的方法测定的“抑制”这些LRP6功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物学活性等)中的一种或多种的多价抗体与相对于在多价抗体不存在的情况下(例如，或者当无关特异性的对照抗体存在时)所见的特定活性的统计学显著降低有关。抑制LRP6活性的多价抗体引起测量参数在统计学上显著降低至少10%，降低至少50%、80%或90%，并且在某些实施方案中，本发明抗体可以抑制LRP6的95%、98%或99%以上的功能活性。在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“相同百分比”或“同一性百分t匕”指相同的两个或两个以上序列或子序列。当在比较窗口上比较并比对最大一致性，或者如使用以下序列比较算法之一或者通过人工比对和目视检查测量指定区域时，如果两个序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比(即，在指定区域上，或者当没有指定时,在整个序列上具有60%的同一性，任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的同一性)，那么这两个序列是“基本上同一的”。任选地，在至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域上，或者更优选地在100-500个或者1000个或者更多核苷酸(或者20、50、200个或更多氨基酸)长度区域上存在同一性。对于序列比较，通常将一个序列作为参照序列与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，指定子序列坐标(subsequencecoordinate),根据需要，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者指定备选的参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列百分比同一性。如本文中所用，“比较窗口”包括提及选自20至600，通常约50至约200，更通常地约100至约150个连续位置数的任意之一的区段，其中在最佳地比对该序列与相同数目连续位置的参照序列后，可以比较这两个序列。比对用于比较的序列的方法是本领域熟知的。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’1.Acad.Sc1.USA85:2444的检索相似性的方法、通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和Wisconsin遗传软件包中的TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WIO)或者通过人工比对和目视检查(参见，例如，Brent等人，(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology),可以进行用于比较的序列的最佳比对。适合于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402;和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可从国家生物技术信息中心(NationalCentreforBiotechnologyInformation)公开得到的。该算法涉及通过在查询序列中鉴定W长度的短字来首先鉴定高得分的序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述序列对匹配或者满足了一些正值阈值得分(positive-valuedthresholdscore)T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等人,上述)。将这些最初的邻近字命中作为启动检索的种子以寻找含有它们的更长HSP。字命中沿着每一序列的两个方向延伸，只要积累的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是大于0)和N(错配残基的罚分；总是小于0)计算积累得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算积累得分。在以下情况下，中止在每一方向中字命中的延伸:积累比对得分从其最大达到值减少了X值；由于一个或多个负得分残基比对的积累，积累得分变成了0或者更低；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望(E)10、M=5、N=-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长、10的期望(10)，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915),50的比对(B)UO的期望(E)、M=5、N=_4作为默认值，并比较两条链。BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一种测量方法是最小和概率(smallestsumprobability)(P(N)),其提供了两个核苷酸序列或者氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中，最小和概率低于约0.2，更优选地低于约0.01，以及最优选地低于约0.001，那么认为核酸与参照序列相似。还可以使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosc1.4:11-17(1988)),使用PAM120权重残基表(weightresiduetable),12的空位长度罚分和4的空位罚分确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此夕卜，可以使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com得到)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossom62矩阵或者PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。除上文提到的序列同一性百分比外，如下所述，两个核酸序列或多肽是基本上相同的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体在免疫学上交叉反应。因此，该多肽通常基本上与第二多肽相同，例如，其中两种肽仅是保守性取代的不同。如下所述，两个核酸序列是基本上相同的另一种指标是，在严格条件下两个分子或其互补核酸序列相互杂交。两种核酸序列是基本上相同的的又一个指标是，可以将相同的引物用于扩增序列。如本文中所用，术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换，并指单链形式或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸及其多聚体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或者经修饰的骨架残基或者连接的核酸，其可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，且具有与参照核酸类似的结合特性，并且其以与参照核苷酸类似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核酸、肽核酸(PNA)。除非另外指出，特定的核酸序列还可以包括其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指定的序列。具体而言，如下文所详述的，简并密码子取代可以通过产生序列实现，在所述序列中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选择的(或者全部)密码子的第三位(Batzer等人,(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsuka等人，(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;和Rossolini等人，(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。术语“有效连接”指两个或两个以上多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。通常，有效连接指转录调节序列与转录的序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或者其他表达系统中刺激或者调节编码序列的转录，那么其与编码序列有效连接。通常，与转录序列有效连接的启动子转录调节序列是与被转录的序列在物理上邻近的，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列，例如增强子，不需要与它们增强转录的编码序列在物理上邻近或者与它们增强转录的编码序列非常接近。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指氨基酸残基的多聚体。该术语可以应用于这样的氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。除非另外指出，特定的多肽序列还可以包括其经保守修饰的变体。术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。术语“抗癌剂”指的是可以用于治疗细胞增殖疾病，例如癌症的任一试剂，其包括细胞毒性剂、化疗剂、放疗和放疗剂、靶向抗癌剂，以及免疫治疗剂。“肿瘤”指赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)，以及全部癌前期的和癌性细胞及组织。术语“抗肿瘤活性”意为肿瘤细胞增殖的速率、存活力或者转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的一种可能的方式是显示在治疗期间产生的异常细胞的生长速率的降低或者肿瘤大小的稳定或者减小。该活性可以使用已接受的体外或体内肿瘤模型(包括但不限于异种移植模型)评估。术语“恶性肿瘤”指非良性的肿瘤或者癌症。如本文中所用，术语“癌症”包括以失调的或者不受控制的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括:癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，那样的恶性肿瘤，其细胞在受试者身体中并不迁移到除原初肿瘤位点之外的位点)和继发性恶性肿瘤(例如，转移引起的那些恶性肿瘤，肿瘤细胞迁移到不同于原初肿瘤位点的第二位点)。在以下章节和分段中进一步描述了本发明的多个方面。LRP6和Wnt信号途径本发明涉及LRP6多价抗体及其用途。通过指向LRP6的分子抑制Wnt信号转导导致了标准fct信号的丧失。因此，用多价抗体拮抗LRP6受体功能将抑制Wnt配体信号转导，并帮助与异常的标准fct信号相关的疾病，例如癌症。特别地，在不同的疾病背景下，LRP6多价抗体可以特异性增强或者减弱由fctl或Wnt3a类蛋白质介导的信号转导。Wnt/β-连环蛋白信号途径的错误调节与多种人类疾病例如癌症和骨疾病相关。在这些疾病中恢复fct信号平衡的分子可能具有治疗潜能。使用基于噬菌体的淘选，已经鉴定，LRP6抗体可以抑制或者增强Wnt信号转导。显著地，已经鉴定了两种类型的LRP6拮抗抗体。一种类型的抗体特异性抑制由fctl表示的Wnt蛋白质，而第二种类型特异性抑制由Wnt3a表示的Wnt蛋白质。表位作图实验表明，Wntl-特异性和Wnt3a特异性LRP6抗体分别与第一P-螺旋桨和第三P-螺旋桨结合，提示fctl和Wnt3a蛋白质与LRP6不同的^-螺旋桨区结合(参见2008年10月31日提交的国际系列号PCT/EP2008/064821，所述文献的内容以其整体并入本文作为参考)。LRP6的螺旋桨3结构域的额外表征鉴定了该结构域中负责与抗体相互作用的残基。使用氢-氘交换(HDx)质谱(MS)鉴定了螺旋桨3的YWTD-EGF区内的抗体结合位点，并且其对应于螺旋桨3结构域的叶片I和叶片6的凹面。Wnt信号途径在胚胎发育和产后组织维持中非常重要。其通过指导控制细胞生长、运动和细胞存活的时间和空间调节的一组特定基因实现(综述于Barker和Clevers(2006)NatureRev.5:997中)。该途径的正确调节对于维持组织稳态是重要的。该途径的长期活化会促进不受控制的细胞生长和存活，并可以最终驱使细胞增殖疾病，例如癌症的发展。备选地，该途径的异常抑制可以导致许多疾病状态，例如，骨量丢失和其他骨疾病。fct蛋白质通过与Frizzled受体和两种细胞表面受体(其为低密度脂蛋白受体(LDLR)相关蛋白质(LPS)的成员:LRP5和LRP6)之一相互作用起始下游信号转导(综述于He等人，(2004)Development31:1663-1677中)。LRP6在标准Wnt信号中的作用通过遗传研究发现。缺少LRP6的突变小鼠显示出与几个单独的fct基因突变相似的组合表型(Pinson等人，(2000)Nature407:535-538)。在非洲爪蟾属(Xenopus)胚胎中，显性阴性的LRP6阻断了通过几种Wnt蛋白的信号转导，然而过表达LRP6激活了Wnt/0-连环蛋白信号转导(Tamai等人，(2000)Nature407:530-535)。此外，已经显示，LRP6或LRP5的表达对于细胞应答标准Wnt信号转导是必需的(综述于He等人，上述，2004)。LRP5和LRP6是高度同源的，并且在它们的胞外和胞内结构域中分别共有73%和64%的同一性。它们在胚胎发生期间和在成体组织中广泛地共表达，并共有一些功能性冗余。LRP5和LRP6的胞外结构域包含三个基本结构域:I)YWTD(酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、天冬氨酸)_型￠-螺旋桨区，2)EGF(表皮生长因子)样结构域，和3)LDLR型A(LA)结构域。YffTD型P-螺旋桨区含有43-50个氨基酸残基的6个YWTD重复，并且每一重复形成6-叶片的P-螺旋桨结构。在LRP5和LRP6中，存在4个YWTD型P-螺旋桨区，每一个YWTD型P-螺旋桨区之后是EGF样结构域，其包含具有保守的半胱氨酸残基的约40个氨基酸残基，之后又是3个LA结构域(Springer等人，(1998)J.Mol.Biol.283=837-862；Jeon等人，(2001)Nat.Struct.Biol.8:499-504)。0-螺旋桨-EGF-样结构域似乎结合胞外配体。LRP6的胞外结构域由氨基酸残基19-1246定义，并在氨基酸残基43_324、352_627、654-929和957-1250处含有4个P-螺旋桨结构域，其分别对应于P-螺旋桨区1、2、3和4。螺旋桨结构域1-2包含氨基酸19-629，并且螺旋桨结构域3-4包括氨基酸631-1246。LRP6抗体本发明提供与LRP6(例如，人LRP6、猕猴LRP6)特异性结合的抗体。在一些实施方案中，本发明提供与人和猕猴LRP6二者特异性结合的抗体。如在2008年10月31日提交的国际系列号PCT/EP2008/064821(将所述专利的内容以其整体并入本文作为参考)中所述，可以将能激活￠-连环蛋白信号的fct蛋白分成两种，并且它们需要将LRP6的不同￠-螺旋桨区用于发送信号。此外，二聚的LRP6抗体(例如，IgG)例如通过内源LRP6的二聚化使细胞对Wnt信号转导强烈敏感。这些结果提示，Wntl和Wnt3的信号活化差别地需要P-螺旋桨I和P-螺旋桨3。这些发现提供了Wnt诱导的LRP6活化的新视角，并为开发在不同疾病中调节Wnt信号转导的LRP6抗体铺平了道路。此外，将LRP6抗体的片段转变成IgG形式导致了使LRP6受体成簇的抗体，并且在配体蛋白存在的情况下可以增强fct信号。在一个实施方案中，抗体增强Wnt信号，条件是增强并不通过本发明的双旁原位抗体发生。在这个实施方案中，在fct配体存在的情况下，当抗体片段转变成全长IgGLRP6抗体时活化并增强Wnt信号。例如，在Wnt配体，例如Wnt3不存在的情况下，WntIFab与LRP6受体的P-螺旋桨I结构域结合，并阻断WntI途径。在Wnt配体，例如Wnt3存在的情况下，WntIFab通过WntI途径阻断信号转导，但是信号活化可以通过Wnt3途径发生，从而产生信号。当将fctIFab转变成全长WntIIgG时，WntIIgG与两个LRP6受体的螺旋桨I结构域结合，并阻断fctI途径，然而，在Wnt配体，例如，Wnt3存在的情况下，信号活化通过fct3途径发生并且同时增强。尽管并不需要提供作用理论，但是一种可能的机制是IgG通过与每一LRP6受体的P-螺旋桨I结构域结合，与两个或者两个以上LRP6受体一起成簇，其在Wnt3配体存在的情况下通过Wnt3途径产生更强的信号。LRP6受体的二聚化可能通过增加涉及LRP6的多种相互作用的亲合力来促进Wnt信号转导。用与LRP6受体的P-螺旋桨3结构域结合的Wnt3Fab获得了相反的结果，并且阻断了fct3途径。在WntI配体存在的情况下,Wnt3Fab虽然阻断了Wnt3途径,但激活了WntI途径以产生信号。当将Wnt3Fab转变成全长Wnt3IgG时，Wnt3IgG与两个LRP6受体的P-螺旋桨3区结合，并且在WntI配体存在的情况下，通过WntI途径抑制信号转导。在一个实施方案中，抗体避免增强fct信号。在一些实施方案中，本发明提供了与人和猕猴LRP6均特异性结合的抗体。在一个实施方案中，LRP6抗体是拮抗抗体。在另一个实施方案中，LRP6抗体是激动性抗体。由于不同的Wnt蛋白质需要LRP6的不同P_螺旋桨结构域以用于转导信号，并且由于LRP6的成簇或者二聚化增强了Wnt信号转导，所以使用LRP6抗体进行的治疗可以通过使用不同的抗体组合调节和“细微调谐(finetuned)”。在一个实施方案中，将LRP6抗体用作单体抗体或者其片段例如单链抗体、单抗体等。在一个实施方案中，将与LRP6的P-螺旋桨I区结合的单体LRP6抗体与结合LRP6的^-螺旋桨3区的单体LRP6抗体组合使用。在另一个实施方案中，将LRP6抗体用作多聚体抗体或者其片段例如双特异性、双旁原位LRP6抗体。除Wnt配体外，预期LRP6螺旋桨I抗体可以抑制与其他螺旋桨I结合配体(例如，Sclerostin、Dkkl)的相互作用。相似地，预期螺旋桨3抗体可以抑制与其他螺旋桨3结合受体(例如Dkkl)的相互作用。此外，预期螺旋桨I和3结合抗体可以影响其他Wnt信号调节剂，例如R-spondins的活化。本发明还提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有在下文的表I中所列VHCDR的任意之一的氨基酸序列的VHCDR0特别地，本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含(或者备选地，组成为)具有在下文的表I中所列的任一VH⑶R的氨基酸序列的I个、2个、3个、4个或更多VHCDR。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，其包含具有SEQIDN0:14、34、36、44、60和62的氨基酸序列的VH结构域。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，其包含具有SEQIDNO:13、33、35、43、59和61的氨基酸序列的VL结构域。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，其包含具有SEQIDN0:82、89、106、108、128、130和138的氨基酸序列的VH结构域。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体，其包含具有SEQIDN0:8U90、105、107、127和129的氨基酸序列的VL结构域。本发明的其他抗体包括已经突变的氨基酸，其仍具有与在表I中所述的序列中所描述的⑶R区在⑶R区中至少60%、70%、80%、90%、95%或98%的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包括突变的氨基酸序列，其中当与在表I中所述的序列中所描述的CDR区比较时，所述抗体在CDR区已经突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸，但仍维持它们对原始抗体表位的特异性。本发明的其他抗体包括已经突变的氨基酸，其在构架区中仍具有与在表I中所述的序列中所描述的构架区至少60%、70%、80%、90%、95%或98%的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包括突变的氨基酸序列，其中当与在表I中所述的序列中所描述的构架区比较时，所述抗体在构架区已经突变了不多于1、2、3、4、5、6或7个的氨基酸，但仍维持其对原始抗体的表位的特异性。本发明还提供了编码与LRP6蛋白(例如，人和/或猕猴LRP6)特异性结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表I用于β-螺旋桨I抗体的M0R08168、M0R08545和M0R06706，以及用于β-螺旋桨3抗体的M0R06475、M0R08193和M0R08473)。本发明的LRP6抗体与不同LRP6i3-螺旋桨区结合。螺旋桨I抗体与β螺旋桨I结构域结合，并阻断螺旋桨I依赖的Wnt，例如Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、WntlOA、WntlOB。螺旋桨3抗体与β螺旋桨3结构域结合，并阻断螺旋桨3依赖的Wnt，例如Wnt3a和Wnt3。表1:本发明LRP6抗体的实例权利要求1.分离的多价抗体，其具有针对LRP6靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域，其中所述第一受体结合结构域与靶受体上的第一结合位点结合，并且所述第二结合结构域与同一LRP6靶受体上的第二结合位点结合，其中所述第一和第二受体结合结构域连接在一起，以致所述第一和第二受体结合结构域与所述LRP6靶受体上的所述第一和第二结合位点的结合抑制标准的Wnt信号转导途径，并且其中所述抗体或抗原结合片段没有展示出fct信号的显著增强。2.权利要求I的抗体，其中所述抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。3.权利要求I的抗体，其中所述抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。4.权利要求I的抗体，其中所述第一和第二受体结合结构域选自IgG抗体、scFv片段、单链双抗体、抗体模拟物和抗体可变结构域。5.权利要求I的抗体，其中所述抗体选自多价抗体、二价抗体、双特异性抗体和双旁原位抗体。6.权利要求I的抗体，其中所述第一受体结合结构域是IgG抗体，并且所述第二受体结合结构域是scFv片段,其中所述IgG抗体和所述scFv片段通过接头连接在一起,所述接头具有允许所述IgG抗体和所述scFv片段分别与LRP6的所述第一和第二个表位结合的空间分布。7.权利要求6的抗体,其中所述接头是选自(6174561~)4和(Gly4Ser)3的甘氨酸-丝氨Ife接头。8.权利要求I的抗体，其中所述LRP6靶受体的第一个表位是P-螺旋桨I结构域。9.权利要求I的抗体，其中所述LRP6靶受体的第二个表位是P-螺旋桨3结构域。10.权利要求I的抗体，其中所述抗体与所述LRP6^-螺旋桨I结构域结合并包含选自SEQIDNO:I、SEQIDNO:21和SEQIDNO:47的重链CDRl;选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:22和SEQIDNO:48的重链CDR2;和选自SEQIDNO:3,SEQIDNO:23和SEQIDNO:49的重链CDR3;和选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:24和SEQIDNO:50的轻链CDRl;选自SEQIDNO:5,SEQIDNO:25和SEQIDNO:51的轻链CDR2;和选自SEQIDNO:6、SEQIDNO:26和SEQIDNO:52的轻链CDR3。11.权利要求I的抗体，其中所述抗体与所述LPR6^-螺旋桨3结构域结合并包含选自SEQIDNO:69、SEQIDNO:93和SEQIDNO:115的重链CDRl;选自SEQIDNO:70,SEQIDN0:94和SEQIDNO:116的重链CDR2;和选自SEQIDNO:71、SEQIDNO:95和SEQIDNO:117的重链CDR3;和选自SEQIDNO:72,SEQIDNO:96和SEQIDNO:118的轻链CDRl；选自SEQIDNO:73,SEQIDNO:97和SEQIDNO:119的轻链CDR2;和选自SEQIDNO:74,SEQIDNO:98和SEQIDNO:120的轻链CDR3。12.权利要求6的抗体，其中所述IgG重链抗体选自SEQIDNO:18、66和101，并且所述轻链选自SEQIDNO:17、86和85。13.权利要求6的抗体，其中所述scFv选自SEQIDNO:142、144、146、148、150、152、.154、156、158、160、162和164。14.权利要求13的抗体，其中所述scFv片段包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段相比，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。15.权利要求I的抗体，其中所述抗体具有抑制选自fctl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准Wnt信号转导途径的功能性活性。16.权利要求1的抗体，其中所述抗体具有减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎性介体的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌的功能性活性，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。17.分离的双旁原位抗体，其包含与LRP6靶受体上的β-螺旋桨I结构域结合的IgG抗体和与LRP6祀上的β-螺旋桨3结构域结合的scFv,其中所述IgG抗体和scFv通过接头连接，以致IgG抗体和scFv分别与β-螺旋桨I结构域和β-螺旋桨3结构域的结合抑制了标准的fct信号转导途径，并且其中所述双旁原位抗体没有展示出fct信号的显著增强。18.权利要求17的抗体，其中所述抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。19.权利要求17的抗体，其中所述抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。20.权利要求17的抗体，其中所述接头包含允许IgG抗体和scFv片段分别与LRP6的β-螺旋桨I结构域和LRP6的β-螺旋桨3结构域结合的空间分布。21.权利要求17的抗体，其中所述scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的Fe结合位点连接，其中所述丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3。22.权利要求21的抗体，其中所述IgG抗体的Fe结合位点是CH3结构域。23.权利要求17的抗体,其中所述scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的轻链连接，其中所述丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3。24.权利要求20的抗体，其中所述scFv包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段相比，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。25.权利要求17的抗体，其包含SEQIDNO:1的重链可变区CDRl;SEQIDNO:2的重链可变区CDR2；SEQIDNO:3的重链可变区CDR3；SEQIDNO:4的轻链可变区CDRl；SEQIDNO:5的轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:6的轻链可变区CDR3，其中所述抗体与LRP6的β-螺旋桨I结构域结合；和SEQIDΝΟ:69的scFv重链可变区CDRl；SEQIDN0:70的scFv重链可变区CDR2；SEQIDNO:71的scFv重链可变区CDR3；SEQIDNO:72的scFv轻链可变区CDRl；SEQIDNO:73的scFv轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:74的scFv轻链可变区⑶R3，其中所述scFv与LRP6的β-螺旋桨3结构域结合。26.权利要求25的抗体，其进一步包含SEQIDNO:166的第454位的赖氨酸缺失。27.权利要求25的抗体，其进一步包含SEQIDNO:166的第677位脯氨酸至丙氨酸突变。28.权利要求25的抗体，其进一步包含SEQIDNO:166的第676-677位天冬氨酸脯氨酸至苏氨酸丙氨酸的突变。29.权利要求17的抗体，其包含选自SEQIDNO:166、171、173、175、195、201和207的重链序列，以及选自SEQIDNO:170,193,199和205的轻链序列。30.权利要求17的抗体，其包含选自SEQIDNO:166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205和195/193的重链序列和轻链序列的组合。31.权利要求17的抗体，其包含具有SEQIDNO:166/170的重链序列和轻链序列。32.权利要求23的抗体，其包含SEQIDNO:177的重链序列；和包含SEQIDNO:181的轻链序列。33.权利要求17的抗体，其中所述抗体具有抑制选自Wntl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准fct信号转导途径的功能性活性。34.权利要求17的抗体，其中所述抗体具有减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介体的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌的功能性活性，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。35.分离的双旁原位抗体，其包含与LRP6靶受体上的P-螺旋桨3结构域结合的IgG和与LRP6祀上的P-螺旋桨I结构域结合的scFv,其中所述IgG抗体和scFv通过接头连接，以致IgG抗体和scFv分别与P-螺旋桨3结构域和P-螺旋桨I结构域的结合抑制标准的Wnt信号转导途径，并且其中所述双旁原位抗体没有表现出fct信号的显著增强。36.权利要求35的抗体，其中所述抗体具有大约纳摩尔亲和力的靶受体亲和力。37.权利要求35的抗体，其中所述抗体具有大约I皮摩尔亲和力的靶受体亲和力。38.权利要求35的抗体，其中所述接头包含允许IgG抗体和scFv片段分别与LRP6的^-螺旋桨3结构域和LRP6的P-螺旋桨I结构域结合的空间分布。39.权利要求35的抗体，其中所述scFv通过丝氨酸-甘氨酸接头与IgG抗体的Fe结合位点连接，其中所述丝氨酸-甘氨酸接头选自(Gly4Ser)4和(Gly4Ser)3。40.权利要求39的抗体，其中所述IgG抗体的Fe结合位点是CH3结构域。41.权利要求35的抗体，其中所述scFv包含至少一个氨基酸突变，与未突变的scFv片段比较，所述氨基酸突变提高了scFv的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。42.权利要求35的抗体，其包含SEQIDNO:69的重链可变区CDRl；SEQIDNO:70的重链可变区CDR2；SEQIDNO:71的重链可变区CDR3；SEQIDNO:72的轻链可变区CDRl；SEQIDNO:73的轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:74的轻链可变区CDR3，其中所述抗体与LRP6的3-螺旋桨3结构域结合；和具有SEQIDNO:I的重链可变区⑶Rl；SEQIDNO:2的重链可变区CDR2;SEQIDNO:3的重链可变区CDR3;SEQIDNO:4的轻链可变区CDRl；SEQIDNO:5的轻链可变区CDR2;和SEQIDNO:6的轻链可变区CDR3的scFv，其中所述scFv与LRP6的P-螺旋桨I结构域结合。43.权利要求42的抗体，其中scFvVH和VL用包含3个氨基酸的接头连接。44.权利要求42的抗体，其中scFvVH和VL用包含4个氨基酸的接头连接。45.权利要求42的抗体，其包含选自SEQIDNO:187和189的重链序列和包含SEQIDNO:185的轻链序列。46.权利要求35的抗体，其中所述抗体具有抑制选自Wntl信号途径和Wnt3信号转导途径的标准fct信号转导途径的功能性活性。47.权利要求35的抗体，其中所述抗体具有减少细胞群、抑制或降低细胞群的增殖、抑制或减少来自细胞群的炎症介体的分泌、抑制或减少来自细胞群的胞质颗粒的分泌的功能性活性，其中所述细胞群选自肿瘤细胞、T细胞、B细胞和Wnt依赖的细胞。48.核酸，其包含编码权利要求I、17和35的多价抗体的核苷酸序列。49.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:166、171、173、175、195、201和207的重链序列；和选自SEQIDNO:170、193、199和205的轻链序列。50.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:166、.171、173、175、195、201和207的重链序列；和至少选自SEQIDNO:170、193、199和205的轻链序列，其中所述抗体与SEQIDNO:166、171、173、175、195、201和207有至少98%的序列同一性；和选自SEQIDNO:170、193、199和205的轻链序列。51.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含SEQIDNO:166和SEQIDNO:170。52.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含与SEQIDNO:166和SEQIDNO:170至少98%的序列同一性。53.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:177的序列，以及SEQIDNO:181的轻链序列。54.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含与SEQIDNO:177至少98%的序列同一性；和SEQIDNO:181的轻链序列。55.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含选自SEQIDNO:187和189的序列；和SEQIDNO:185的轻链序列。56.核酸，其包含编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包含与SEQIDNO:187和189至少98%的序列同一性；和SEQIDNO:185的轻链序列。57.载体,其包含权利要求48-56的核酸。58.药物组合物，其包含具有针对选自权利要求1-47的靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域的多价抗体和可药用载体。59.获得权利要求I、17和35的多价抗体的方法，其包括(a)提供与LRP6靶受体的第一结合位点结合的第一受体结合结构域；(b)提供与LRP6靶受体的第二结合位点结合的第二受体结合结构域；和(c)将所述第一受体结合结构域与第二受体结合结构域连接。60.权利要求59的方法,其中所述第一或第二受体结合结构域选自IgG抗体、scFv片段、单链双抗体、抗体模拟物和抗体可变结构域。61.权利要求59的方法，其中所述第一和第二受体结合结构域通过接头连接在一起，所述接头具有允许第一和第二受体结合结构域分别与LRP6的第一和第二表位结合的空间分布。62.权利要求61的方法，其中所述接头是选自(6174561*)4和(Gly4Ser)3的甘氨酸-丝氣Ife接头。63.权利要求59的方法，其进一步包括引入至少一个氨基酸突变至所述第一或第二受体结合结构域中，使得与未突变的第一或第二受体结合结构域相比，所述氨基酸突变提高了第一或第二受体结合结构域的稳定性，其中所述氨基酸突变选自图29-32。64.治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达的癌症的受试者，对需要其的受试者施用有效量的包含多价抗体的组合物，所述多价抗体具有针对权利要求1-47的靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域。65.权利要求64的方法，其中所述受试者是人类。66.治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达的癌症的受试者，对需要其的受试者施用有效量的包含多价抗体的组合物，所述多价抗体具有针对权利要求1-47的靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。67.权利要求66的方法，其中所述癌症是乳腺癌。68.治疗通过标准Wnt信号途径介导的疾病的方法，其使用针对LRP6的多价抗体。69.治疗癌症的方法，其包括选择具有LRP6表达癌症的受试者，对该受试者施用有效量的组合物和任一标准护理癌症疗法的组合，其中所述组合物包含具有选自SEQIDNO:166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205和195/193的重链和轻链序列的多价抗体。70.任一前述权利要求的多价抗体在生产用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。71.多价抗体,其具有SEQIDNO:14的VH；SEQIDNO:13的VL；SEQIDNO:82的VH；SEQIDNO:81的VL，用于治疗通过标准Wnt信号途径介导的癌症。72.多价抗体，其具有SEQIDNO:14的VH；SEQIDNO:13的VL；SEQIDNO:82的VH；SEQIDNO:81的VL，用作药物。73.多价抗体，其具有SEQIDNO:166和SEQIDNO:170，用于治疗通过标准Wnt信号途径介导的癌症。74.多价抗体，其具有SEQIDNO:166和SEQIDNO:170，用作药物。75.权利要求1-47的多价抗体，用作药物。76.权利要求1-47的多价抗体，用作治疗表达LRP6的癌症的药物。77.权利要求1-47的多价抗体，用作治疗表达LRP6的癌症的药物，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。全文摘要本发明涉及具有针对LRP6的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域的抗体或者抗原结合片段及其组合物和使用方法。文档编号C07K16/46GK103237811SQ201180033269公开日2013年8月7日申请日期2011年5月5日优先权日2010年5月6日发明者丛枫,S·埃滕伯格,D·詹金斯,雷鸣,A·洛,K·文森特,周立申请人:诺瓦提斯公司