专利名称：经修饰松弛素多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及任选地被至少一种非天然编码氨基酸修饰的松弛素多肽。
背景技术：
成熟人松弛素是一种大约6000道尔顿的激素肽，已知其负责重塑分娩前的产道，因而促进产程。这种蛋白质似乎调节靶器官中的结缔组织的重建以在怀孕和分娩期间获得所需的器官结构的变化。参见，Hisaw, F.L.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,23:661-663 (1926) ；Schwabe,C.等，Biochem.Biophys.Res.Comm., 75:503_570 (1977) ； James,R.等，Nature, 267:544-546(1977)。Sherwood, D.在 The Physiology of Reproduction,Chapterl6, " Relaxin " , Knobi I, E.和 Neill, J.等(编)，(Raven Press Ltd., NewYork)，第585-673页(1988)中简要地论述了松弛素。松弛素的循环水平在整个9个月的孕期升高并在分娩后迅速下降。虽然松弛素主要是孕期激素，但它已在未怀孕女性和男性中被检测到。Bryant-Greenwood, G.D., Endocrine Reviews,3:62-90(1982)和 Weiss, G., Ann.Rev.Physiol.,46:43-52 (1984)，并且最近被发现可用于治疗心力衰竭。心力衰竭被定义为心脏泵不能根据需要移动血液来供给身体组织的代谢需求。泵送能力的下降最经常由心肌组织的损失或损害引起。结果，心室排空受到抑制，这导致心室充盈压力和心室壁应力增加，并导致心输出量减少。作为对心输出量减少的生理反应，许多神经内分泌反射被激活，这导致全身血管收缩、心脏交感神经刺激和体液潴留。虽然这些反射反应往往最初提高心输出量，但是从长期来看它们是有害的。由此产生的外周阻力的增大会增加对心脏的后负荷，并且血容量的增大进一步增加心室充盈压力。这些变化与心脏的交感神经刺激的增强一起导致对剩余功能心肌的进一步的经常失代偿性的需求。
充血性心力衰竭是许多心血管病症的共同终点，并在心脏无法充分灌注外周组织时产生。根据最新估计，在美国有大约400万人被诊断为患有这种疾病，并且这些病例的 50% 以上在诊断的 5 年内是致命的[Taylor, M.D.等，Annual Reports, Med.Chem.22,85-94(1987)]。当前治疗包括充血性心力衰竭在内的心力衰竭的方法集中于在不对心肌产生不适当的要求的情况下增加心输出量。为了达到这些目的，利尿剂、血管扩张剂和正性肌力药(inotropic agent)的各种组合被用于降低血容量、降低外周阻力，以及增加心脏收缩力。因此，当前的疗法依赖于平衡多种药物的影响来实现各个患者的临床需要，并且受到所使用的药物的不利反应的困扰。例如，利尿剂降低钾和镁的血浆浓度并且增加接受洋地黄的患者的心律失常的发生率。利尿剂可经由容量不足(volume depletion)增强硝酸盐的循环影响，并导致心脏充盈压力、心输出量和全身动脉压力下降。α肾上腺素能拮抗剂可导致全身动脉压力的显著下降，其损害冠脉灌注。血管紧张素转换酶抑制剂对动脉压力可以有类似的影响，并且另外导致血浆中钾的浓度过度增加。
导致正性肌力的药物如洋地黄和β肾上腺素能拮抗剂有可能引起心律失常。另夕卜，洋地黄具有狭窄的治疗指数，并且儿茶酚胺类似物由于受体下调而都倾向于迅速失去其有效性。因此，需要这样的治疗剂，其导致动脉和静脉血管舒张及心脏收缩力的生理上的综合反应，而没有目前所用的治疗剂的缺点。已从包括猪、鼠类、马、鲨、虎、大鼠、角鲨和人在内的各种物种纯化出松弛素，其显示出与胰岛素和胰岛素样生长因子至少在一级结构和二级结构上有同源性，但物种之间的同源性可以是相当低的。在人中，发现松弛素在孕期的黄体(CL)中最丰富。然而，脑中的特定核具有松弛素受体并且其它核含有松弛素的信使RNA。具有携带松弛素受体的细胞的数个核在下丘脑区域中被发现。已鉴定出两种人基因形式，(Hl)和(Η2)。Hudson, P.等，Nature, 301:628-631(1983) ；Hudson, P.等，The EMBO Journal, 3:2333-2339(1984);和美国专利第4，758，516号和第4，871，670号。已发现该基因形式中仅一种(H2)在CL中被转录。是否(Hl)形式在另一个组织部位被表达，或者它是否代表假基因，这还不清楚。当测试合成的人松弛素(H2)和某些人松弛素类似物的生物活性时，该测试发现生物活性所必需的松弛素核以及不影响生物活性的针对蛋氨酸的某些氨基酸取代。Johnston等,见Peptides:Structure and Function,Proc.Ninth American Peptide Symposium,Deber, C.M.等(编)(Pierce Chem.C0.1985)。制备松弛素的方法还描述于美国专利第4，835，251号和共同待决的美国专利申请第 07/908，766 (PCT US90/02085)号和第 08/080，354 (PCT US94/0699)号中。在心血管治疗和在神经退行性疾病治疗中使用松弛素的方法描述于美国专利第5，166，191号和美国专利申请第07/902，637 (PCT US92/06927)号中。人松弛素的某些制剂描述于核准的美国专利申请第08/050，745号中。重组人松弛素(H2) 当前处于硬皮病患者的I期人临床试验中。硬皮病是涉及组织重新形成(reformation)中的不平衡的疾病，其导致胶原的过量产生，并最终导致皮肤(和受累器官)的肿胀和硬化。目前，递送松弛素的治疗需要重复的长时间输注。发明概述本发明提供了任选地被至少一种非天然编码氨基酸修饰的松弛素多肽。本说明书将提供一些实施方案，但是应理解，这些实施方案是为了说明本发明，而不能被解读为限制由权利要求书限定的本发明范围。在本发明的另一方面，具有至少一种非天然编码氨基酸的松弛素多肽与至少一种水溶性聚合物连接。在一方面，本发明涉及通过施用治疗有效量的松弛素来促进需要它的哺乳动物的血管新生的方法。在另一个实施方案中，松弛素以足以维持至少约lng/ml的血浆浓度的量施用。在进一步实施方案中，松弛素多肽是人松弛素(hR2)。本发明提供了用有效量的包含松弛素受体激动剂的制剂治疗动脉顺应性降低的个体的方法。在优选的实施方案中，松弛素受体激动剂是重组人松弛素，例如，人H2松弛素。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了增加受试者的动脉顺应性的方法，其中所述方法包括测量所述受试者的总动脉顺应性；相对于健康受试者的总动脉顺应性确定所述受试者的所述总动脉顺应性是否降低；以及向所述受试者施用包含松弛素的药物制剂以增加所述受试者的动脉顺应性。在一个实施方案中，可以使用面积法根据主动脉压力波形的舒张衰减来测量总动脉顺应性。在另一个实施方案中，总动脉顺应性可以计算为每搏输出量与脉冲压力的比率，其中每搏输出量被定义为心输出量与心率的比率。在相关的实施方案中，可以测量受试者的局部动脉顺应性或区域动脉顺应性，所述测量与总动脉顺应性测量一并进行或者作为总动脉顺应性测量的替代，并且如果局部或区域动脉顺应性相对于对处于类似状况的健康个体预期的局部或区域动脉顺应性降低，则可以施用松弛素以增加该个体的动脉顺应性。在进一步的实施方案中，接受松弛素的受试者罹患以下病症中的一种或多种:动脉粥样硬化、I型糖尿病、2型糖尿病、冠状动脉疾病、硬皮病、中风、舒张功能异常、家族性高胆固醇血症、单纯收缩期高血压、原发性高血压、继发性高血压、左心室肥大、与长期吸烟有关的动脉硬化、与肥胖有关的动脉硬化、与年龄有关的动脉硬化、系统性红斑狼疮、先兆子痫，和高胆固醇血症。在相关的实施方案中，本发明提供了增加围绝经期、绝经期和绝经后妇女以及有罹患前述病症之一的风险的个体的动脉顺应性的方法。在本发明的另外的实施方案中，松弛素的施用使动脉顺应性相对于在施用之前测得的动脉顺应性增加了至少10^^15^^20%或更高。在又一个进一步实施方案中，本发明提供了对动脉顺应性降低的个体进行的松弛素的施用，所述施用以预定速率进行以便维持0.5ng/ml至80ng/ml的松弛素血清浓度。在一个实施方案中，松弛素是具有一种非天然编码氨基酸的重组人松弛素。在又一个实施方案中，松弛素是具有一种以上的非天然编码氨基酸的松弛素。在本发明的又一个实施方案中，松弛素具有与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在相关的实施方案中，松弛素可以以可注射制剂形式、作为缓释制剂，或以持续输注形式每日施用。在另一方面，本发明涉及通过施用治疗有效量的松弛素来治疗感染或缺血性伤口。在特别优选的实施方案中，感染或缺血性伤口是这样的感染或缺血性伤口，其中的损伤由循环不良引起的氧气缺 乏造成。在本发明的又一个方面，提供了使用本发明松弛素多肽制造用于治疗感染或缺血性伤口的药剂，或制造用于促进血管新生的药剂的用途。在另一个方面，本发明涉及骨退行性关节功能异常的治疗，并且在另一个方面，骨退行性关节功能异常的治疗包括用hR2与一种或多种佐剂一并治疗，所述佐剂包括但不限于葡萄糖胺。在另一个方面，本发明涉及阿尔茨海默氏病(alzheimer’s disease)的治疗，并且在另一个方面，阿尔茨海默氏病的治疗包括用hR2与一种或多种佐剂一并治疗，所述佐剂包括但不限于雌激素。在另一个实施方案中，本发明涉及调节哺乳动物的生殖生理的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文组合物。本发明进一步提供了治疗血管紧张素-1I (AngII)-介导的血管收缩的方法。这些方法一般包括施用包含有效逆转、抑制或减轻AngII的血管收缩影响的量的松弛素的制剂。本发明进一步提供了治疗内皮素-1 (ET-1)-介导的血管收缩的方法。这些方法一般包括施用包含有效逆转、抑制或减轻ET-1的血管收缩影响的量的松弛素的制剂。在一些实施方案中，该方法包括通过向个体施用松弛素来增强血管中的细胞中的内皮素B型受体活化。本发明进一步提供了治疗缺血性病状的方法，该方法一般包括施用包含有效刺激或促进血管新生和/或血管舒张，从而治疗缺血性病状的量的松弛素的制剂。该方法可用于治疗多种缺血性病状。在一些实施方案中，提供了治疗由心肌梗塞引起的缺血性病状的方法。在其它实施方案中，提供了治疗与伤口关联的缺血性病状的方法。因而，本发明进一步提供了促进伤口愈合的方法。本发明进一步提供了刺激血管新生和/或血管舒张细胞因子表达的方法，其一般包括施用包含有效舒张血管和/或刺激或促进血管新生细胞因子生成的量的松弛素的制齐U。在一些实施方案中，该方法用于刺激碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。此类方法可用于治疗可通过增加患病部位处或附近的血流量来治疗的多种多样的疾病。本发明进一步提供了增加肾血管舒张和超过滤的方法，该方法一般包括施用包含一定量的松弛素的制剂。这些方法可用于治疗多种肾病理。因此，本发明进一步提供了治疗与血管收缩有关的肾病理的方法。本发明进一步提供了降低肺性高血压的方法，该方法一般包括施用包含一定量的松弛素的制剂。在分别转让给Connetics Corporation和BAS Medical, Inc.的专利，美国专利第6，211，147号和第6，780，836号中公开了使用松弛素促进血管新生的方法，这两篇美国专利都以引用的方式并入本文。在转让给Genentech, Inc.的专利,第5，759，807号专利中公开了从松弛素原原核生产松弛素的工艺，该专利以引用的方式并入本文。Yue的美国专利6，251，863公开了治疗骨退行性关节功能异常的方法和治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法通过施用针对所述病状中的每种病状分别进一步包含葡萄糖胺硫酸盐和雌激素的松弛素药剂来实现，并且这篇专利的说明书也以引用的方式完整地并入本文。在一些实施方案中，松弛素多肽包含一种或多种翻译后修饰。在一些实施方案中，松弛素多肽与连接子、聚合物，或生物活性分子连接。在一些实施方案中，松弛素多肽与双官能聚合物、双官能连接子，或至少一种另外的松弛素多肽连接。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸经由连接子与水溶性聚合物连接，或者与水溶性聚合物键合。在一些实施方案中，该聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。在一些实施方案中，该双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施方案中，该第二多肽是松弛素多肽。在一些实施方案中，松弛素多肽包含至少两种与水溶性聚合物连接的氨基酸，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，松弛素多肽包含至少两种与水溶性聚合物连接的氨基酸，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施方案 中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置的一个或多个位置处掺入到任何松弛素或松弛素原多肽、松弛素类似物、松弛素原、松弛素A链、松弛素B链AlalAsp松弛素，或松弛素多肽中:A链中的位置I ( S卩，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25(即，在蛋白质的羧基端处)，及其任何组合(SEQ ID NO:4)和/或B链中的位置1(即，在N-端)之前、位置1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 (SEQ ID NO:5或在SEQ ID NO:6中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置的一个或多个位置处掺入到任何松弛素或松弛素原多肽中:A链中的位置 1(即，在 N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54(即，在蛋白质的羧基端)，以及它们的任何组合(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置的一个或多个位置处掺入到松弛素中:位置1(即在N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89( S卩，在 SEQ ID NO:3 的蛋白质的羧基端)。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在A链中的氨基酸位置I (SEQ ID NO:4)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在A链中的氨基酸位置5 (SEQ ID NO:4)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的氨基酸位置7 (SEQ ID NO:5或SEQID NO:6)处掺入。在一 些实施方案中，非天然编码氨基酸在A链中的氨基酸位置2 (SEQ IDNO:4)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在A链中的氨基酸位置13(SEQ IDN0:4)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的氨基酸位置5(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在A链中的氨基酸位置18处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的氨基酸位置5处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的氨基酸位置28处掺入。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置 1、2、5、13、18(SEQ ID NO:4，或在 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或其它已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置1、2、5、13(SEQ IDNO:4或在SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其它已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置1、2、5(SEQ ID NO: 4或在SEQ ID NO:USEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:3或其它已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置
2或 5 (SEQ ID NO:4 或在 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或其它已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:B链中的氨基酸位置5或7(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID N0:l、2或3中的相应氨基酸位置)处。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的位置7 (SEQID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID NO:1、2或3中的相应氨基酸位置)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的位置5 (SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQID NO:1、2或3中的相应氨基酸位置)处掺入。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸在B链中的位置7(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID NO:1、2或3中的相应氨基酸位置)处掺入。在一个实施方案中，非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4或在SEQ ID N0.1、2、3中的相应氨基酸位置)，B链中的氨基酸位置7、5 (SEQ ID NO:5或6，或在SEQ ID N0:l、2、3中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个位置处掺入到松弛素多肽中:A链中的氨基酸位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4，或在SEQ IDN0.1、2、3中的相应氨基酸位置)、B链中的氨基酸位置7、5 (SEQ ID NO:5或6，或在SEQ IDNO:1、2、3中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于以下位置:A链中的位置1(S卩，在N-端)之前、位置1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25( SP，在蛋白质的羧基端)，及其任何组合(SEQ ID NO:4或在已知松弛素序列中的相应氨基酸)，和/或B链中的位置 I (即，在 N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30(SEQ ID NO:5或6或者在已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于:A链中的位置1、2、5、13、18(SEQ ID NO:1或在已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些·实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于:A链中的位置1、2、5(SEQ ID NO:1或在已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于:A链中的位置2、5(SEQ ID N0:1或在已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于:A链中的位置2、5、13、18(SEQID NO:1或在已知松弛素序列中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，在这些位置中的一个或多个位置处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，包括但不限于:B链中的位置5、7 (SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID NO: 1、2、3中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，在B链中的位置5(SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相应氨基酸位置)处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施方案中，在B链中的位置7 (SEQ IDNO:5或6或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相应氨基酸位置)处的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个或多个位置处掺入到任何松弛素或松弛素原多肽中:B链位置5、7 (SEQ ID NO:5或6或者在SEQ IDNO:1、2、3中的相应氨基酸位置)和A链位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸在以下位置中的一个或多个位置处掺入到任何松弛素或松弛素原多肽中:B链位置5、7(SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID N0:l、2、3中的相应氨基酸位置)和A链位置1、5、2、13、18(SEQ IDNO:4或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相应氨基酸位置)，并且非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。本发明方法可用来促进血管新生、促进血管舒张、促进非降压性血管舒张(non-hypotensive vasodilation)、治疗高血压,包括但不限于肾性高血压、肺性高血压，和心脏高血压(美国专利第6，723，702号；和第6，780，836号，它们都据此以引用的方式完整地并入本文)，公开了松弛素类似物的晶体的形成和用途。制剂在本发明的广泛实践中，还考虑到制剂可含有松弛素、松弛素二聚体、松弛素类似物、酰化松弛素，或酰化松弛素类似物中的两种或更多种的混合物，其中所述混合物的至少一种组分含有非天然编码氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，含有松弛素、松弛素类似物、酰化松弛素，或酰化松弛素类似物中的两种或更多种的混合物(其中所述混合物的至少一种组分含有非天然编码氨基酸)的制剂还包括至少一种与至少一种非天然编码氨基酸连接的水溶性聚合物。本发明还包括异质混合物，其中通过本发明中所公开的方法制备松弛素多肽和松弛素类似物，并然后将它们混合以便可向有需要的患者施用制剂，所述制剂含有例如25%的在聚乙二醇化的B链的位置28处含有非天然编码氨基酸的松弛素多肽；25%的在B链的位置10处含有非天然编码氨基酸的松弛素多肽，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物偶联；和50%的松弛素多肽，其中非天然编码氨基酸存在于松弛素B链的位置31 (SEQ IDNO:2;或者SEQ ID NO:4、6、8、10或12)处。不同百分比量的松弛素多肽变异体的所有不同混合物都包括在序列中的不同位置处，其中所述松弛素多肽包括具有不同尺寸的PEG的变种(1)，或(2)PEG。这旨在作为实例，而决不应视为限制可用本发明获得的制剂，并且对于本领域技术人员将是明显的。在另外的实施方案中，引入到制剂混合物中的松弛素多肽变异体将根据其不同解离时间(dissociation time)来进行选择，以便该制剂可为有需要的患者提供缓释松弛素。本发明制剂可以包括胰高血糖素。包括吸入用制剂在内的本发明其它实施方案在本发明的另外的实施方案中，可以使用本文所公开的技术来生产药动学和药效学性质增强的松弛素类似物，所述松弛素类似物供患者经由施用于肺来使用，导致松弛素的血液水平增高，增高的血液水平在施用后持续至少6小时，并且更通常至少8、10、12、14、18,24小时或更长时间。本发明的另一个实施方案虑及适合于设计成作为吸入剂施用给患者的治疗性制剂的松弛素类似物的有利混合物。在本发明的一些实施方案中，天然松弛素分子中的以下位点可以被非天然编码氨基酸取代，并且任选地进一步通过共价连接水溶性聚合物如PEG来修饰:A与B链的2个C端、Arg22B、HislOB, His5A、Glu4A、Glul7A、Glul3B,和 Glu21B。除了天然松弛素外，本发明还提供了具有取代或插入到信号序列中的一种或多种非天然编码氨基酸的非天然松弛素多肽和松弛素类似物，所述非天然编码氨基酸还可提供用于掺入一种或多种水溶性聚合物如PEG的位点。本发明的这个实施方案尤其可用于在松弛素分子中引入另外的定制聚乙二醇化位点，例如以便形成对酶促降解的抗性增强的PEG-松弛素。此种方法在具有活性、稳定性、溶解性和药理学性质之间的所需平衡的最佳松弛素缀合物的设计方面提供了较大灵活性。可在松弛素分子中的许多位置处进行突变，即通过位点特异性诱变进行。用于本发明的PEG可具有多种结构:线性、叉状、支化、哑铃状等等。通常，用适合于偶联松弛素分子上的所需一个或多个位点的合适活化基团使PEG活化。活化PEG将在末端具有用于与松弛素反应的反应性基团。代表性活化PEG衍生物和使这些试剂与诸如松弛素的药物缀合的方法是本领域已知的，并且进一步描述于Zalipsky, S.等，"Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modificationof Polypeptides" , Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992),及 Advanced Drug Reviews,16:157-182(1995)中。在本发明的一个特定实施方案中，缀合物的PEG部分不存在一个或多个有效地显著改变聚合物或聚合物-松弛素缀合物的水溶解性的亲脂性基团。那就是说，该聚合物或本发明缀合物的非松弛素部分可以含有被认为亲脂性高于亲水性的原子的基团(例如具有约2至8-12个碳原子的碳链)，然而，如果这样的一个或多个基团的存在不能有效地显著改变聚合物或缀合物的亲水性，那么本发明缀合物中可含有此种部分。也就是说，通过松弛素、松弛素多肽和松弛素类似物的位点特异性突变，本发明的松弛素缀合物自身可展现出亲水性，而不是亲脂性或两亲性。在其中可存在亲脂性部分的本发明某些实施方案中，所述部分优选不被定位在PEG链的末端。用于本发明缀合物的支化PEG包括国际专利公布W096/21469中描述的那些PEG，所述专利公布的内容明确地以引用的方式完整地并入本文。一般地，支化PEG可用式R(PEG-OH).sub.η表示，其中R表示中心“核心”分子并且.sub.η表示臂的数目。支化PEG具有中心核心，2个或更多个“PEG”臂从所述中心核心伸出。在支化构型中，支化聚合物核心具有用于与松弛素连接的单个反应性位点。用于本发明的支化PEG通常将包含少于4个PEG臂，并且更优选将包含少于3个PEG臂。支化PEG提供的优点是:其具有与其线性PEG对应物相比与更大且更致密的聚合物云状物偶联的单个反应性位点。一种特定类型的支化PEG可表示为(MeO -PEG-).sub.p R—X，其中p等于2或3，R为连接有2或3个PEG臂的中心核心结构如赖氨酸或甘油，并且X表示任何被活化或可被活化用于与松弛素偶联的合适官能团。一种特别优选的支化PEG为具有结构mPEG2-赖氨酸-琥珀酰亚胺的mPEG2-NHS(Shearwater Corporation, Alabama)。在又一种支化结构中，“侧链PEG”具有沿PEG主链被定位而不是被定位在PEG链末端的用于偶联蛋白质的反应性基团。从PEG主链伸出以与松弛素偶联的反应性基团可以相同或不同。侧链PEG结构可能是有用的，但是一般是次优选的，特别是对于吸入用组合物而H。或者，PEG-松弛素缀合物的PEG部分可以具有叉状结构，其具有位于聚合物链的一端的支化部分，和两个(或2的任何倍数个)与所述支化部分连接的游离反应性基团以与松弛素连接。示例性叉状PEG描述于国际专利公布第W099/45964号中，所述专利公布的内容明确地以引用的方式并入本文。叉状聚乙二醇可任选地包括位于聚合物链的另一端的烷基或“ R”基团。更具体来说，根据本发明的叉状PEG-松弛素缀合物具有式:R-PEG-L (Y-松弛素)n，其中R为烷基，L为水解稳定的支化点，并且Y为提供叉状聚合物与松弛素的化学连接的连接基团，并且η为2的倍数。L可表示单个“核心”基团，如“一CH--”，或者可包含较长的原子链。示例性L基团包括赖氨酸、甘油、季戊四醇，或山梨糖醇。通常，支化部分内的特定支化原子是碳。在本发明的一个特定实施方案中，叉状PEG与松弛素分子的键(Y)是水解稳定的。在优选的实施方案中，η为2。在与松弛素上的反应性位点缀合之前的合适的Y部分包括但不限于活性酯、活性碳酸酯、醛、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧化物、醇、马来酰亚胺、乙烯砜、酰肼、二硫代吡啶，和碘乙酰胺。合适的活化基团的选择将视松弛素分子上的预期连接位点而定，并且可易于由本领域的技术人员确定。所产生的PEG-松弛素缀合物中的相应Y基团是由活化叉状聚合物与松弛素上的合适反应性位点反应所产生的Y基团。此种最终键(final linkage)的特定特性对于本领域技术人员将是明显的。例如，如果反应性叉状PEG含有活化酯，如琥珀酰亚胺或马来酰亚胺酯，那么经由松弛素上的胺位点缀合将导致形成相应酰胺键。这些特定叉状聚合物特别吸引人，因为它们提供松弛素与PEG的摩尔比为
2: I或更大的缀合物。此类缀合物不太可能阻断松弛素受体位点，同时仍提供用于保护松弛素免受例如由松弛素降解酶所致的酶促降解的设计方面的灵活性。在相关的实施方案中，叉状PEG-松弛素缀合物可以用于本发明中，并由式R-[PEG-L(Y-松弛素)2] η表示。在这种情况下，R表示连接有至少一种PEG- 二 -松弛素缀合物的非天然编码氨基酸。具体来说，根据本发明这个方面的优选叉状聚合物是其中η选自由1、2、3、4、5和6组成的组的那些聚合物。在替代实施方案中，介于松弛素、松弛素多肽或松弛素类似物中的非天然氨基酸与聚合物分支点之间的化学键是可降解的(即水解不稳定)。或者，一个或多个可降解键可以包含在聚合物骨架中，从而允许在活体内产生PEG链比最初施用的缀合物中的PEG链小的PEG-松弛素缀合物。例如，可以施用大且相对惰性的缀合物(即连接有一个或多个高分子量PEG链，例如一个或多个分子量超过约10，000的PEG链，其中该缀合物基本上不具有生物活性)，其随后在肺中或在血流中水解从而产生具有最初存在的PEG链的一部分的生物活性缀合物。在水解可降解键在活体内裂解后，游离松弛素(视可降解键的位置而定)或连接有小聚乙烯标签的松弛素然后被释放并且更容易通过肺被吸收和/或在血液中循环。
在本发明这个实施方案的一个特征中，在施用后，完整聚合物-缀合物在水解之前被最低限度地降解，使得可裂解键的水解有效地控制活性松弛素进入血流的缓慢释放速率，这与松弛素在释放到全身循环中之前的酶促降解相反。合适的生理学上可裂解的键包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、缩醛，和缩酮。此类缀合物应具有生理学上可裂解的键，其在储存后和施用后是稳定的。例如，PEG-可裂解键-松弛素缀合物在被制造成最终药物组合物后、在溶解于合适的递送媒介物(如果使用)中后，以及在施用(不论什么途径)后应当维持它的完整性。因而，在本发明的另一个实施方案中，将一种或多种非天然编码氨基酸掺入到单链松弛素或单链松弛素类似物中。在一些实施方案中，本发明多肽在信号序列中包含一个或多个非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，本发明多肽在松弛素或本说明书中所公开的任何松弛素类似物或多肽的信号序列中包含一个或多个非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，本发明多肽在信号序列中包含一个或多个天然编码氨基酸取代、添加或缺失，以及在松弛素或本说明书中所公开的任何松弛素类似物或多肽的信号序列中包含一个或多个非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，将一种或多种非天然氨基酸掺入到松弛素或本说明书中所公开的任何松弛素类似物或多肽的前导序列或信号序列中。在一些实施方案中，松弛素多肽包含调节松弛素多肽对松弛素多肽受体或结合搭配物的亲和力的取代、添加或缺失，所述松弛素多肽受体或结合搭配物包括但不限于蛋白质、多肽、小分子或核酸。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的稳定性相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽的稳定性。稳定性和/或溶解性可以使用本领域普通技术人员已知的许多不同测定法来测量。此类测定法包括但不限于SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的免疫原性相比，所述取代、添加或缺失调节松弛素多肽的免疫原性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的血清半衰期或循环时间相比，所述取代、添加或缺失调节松弛素多肽的血清半衰期或循环时间。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的水溶解性相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽的水溶解性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的溶解性相比，所述取代、添加或缺失增大宿主细胞中所产生的松弛素多肽的溶解性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的表达或合成相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成。包含这种经取代松弛素多肽保留了激动剂活性，并且保留或提高了在宿主细胞中的表达水平。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素的蛋白酶抗性相比，所述取代、添加或缺失增大松弛素多肽的蛋白酶抗性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与松弛素受体在与无取代、添加或缺失的相应松弛素多肽相互作用后的信号转导活性相比，所述取代、添加或缺失调节松弛素受体的所述信号转导活性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素多肽与另一种分子如受体的结合相比，所述取代、添加或缺失调节松弛素多肽与所述另一种分子的结合。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相 应松弛素多肽的抗病毒活性相比，所述取代、添加或缺失调节松弛素多肽的抗病毒活性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素多肽的葡萄糖代谢活性相比，所述取代、添加或缺失增强松弛素多肽的葡萄糖代谢活性。在一些实施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应松弛素与药物防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苄醇)的相容性相比，所述取代、添加或缺失增大松弛素多肽与所述药物防腐剂的相容性。这种增大的相容性将使得能够制备在储存期间维持蛋白质的生理化学性质和生物活性的防腐药物制剂。在一些实施方案中，用一种或多种非天然氨基酸产生一个或多个工程改造键。分子内键可以用许多方式产生，包括但不限于在合适的条件下蛋白质中的两种氨基酸之间的反应(两种氨基酸之一或二者可为非天然氨基酸)；在合适的条件下与两种氨基酸(其中每一种氨基酸均可以为天然编码或非天然编码氨基酸)、与连接子、聚合物或其它分子的反应；等。在一些实施方案中，松弛素多肽中的一个或多个氨基酸取代可以利用一种或多种天然存在的氨基酸或非天然编码氨基酸进行。在一些实施方案中，松弛素多肽中的氨基酸取代可以利用天然存在的氨基酸或非天然编码氨基酸进行，但是至少一个取代是利用非天然编码氨基酸进行。在一些实施方案中，松弛素多肽中的一个或多个氨基酸取代可以利用一种或多种天然存在的氨基酸进行，并且另外，至少一个取代是利用非天然编码氨基酸进行。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide)、叠氮基,或炔基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸具有以下结构:
权利要求
1.一种松弛素多肽，其包含一种或多种非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一种或多种翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物，或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的松弛素类似物多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接子，或至少一种另外的松弛素多肽连接。
6.根据权利要求5所述的松弛素多肽，其中所述双官能连接子或聚合物与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的松弛素多肽，其中所述第二多肽是松弛素多肽。
8.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物与所述松弛素多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下位置处的残基组成的组的位置处被取代:位置I (即，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、·9·、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、·34、·35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白质的羧基端)，及其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO:2或3中的相应氨基酸)。
11.根据权利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2和3中的相应氨基酸的1、2、·5、13、18、29、31、52及其任何组合。
12.根据权利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下组成的组的位置处被取代:SEQ ID N0:4或在SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3中的相应氨基酸的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25(即，在所述蛋白质的羧基端)及其任何组合。
13.根据权利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下组成的组的位置处被取代:SEQ ID N0:4或在SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3中的相应氨基酸的2、5、18及其任何组合。
14.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下组成的组的位置处被取代:SEQ ID NO:5 或在 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:6中的相应氨基酸的5、7、18、28及其任何组合。
15.根据权利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在位置1(SEQIDNO:1，或者SEQ ID NO:2或3的相应氨基酸)处被取代。
16.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下位置处的残基组成的组的位置处被取代:位置I (即，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、·9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、·34、·35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白质的羧基端)，及其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO:2或3中的相应氨基酸)。
17.根据权利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:SEQ ID NO:1或在SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸的残基1、2、5、13、18、29、31、52，及其任何组合。
18.根据权利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:残基1、2、5、13、18、29，及其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQID N0:2或3中的相应氨基酸)。
19.根据权利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:残基1、25及其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸)。
20.根据权利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在位置1(SEQIDNO:1，或者SEQ ID NO:2或3的相应氨基酸)处被取代。
21.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在位置1、2、5、13、18、25、29、31、52 (SEQ ID NO:1，或者SEQ ID NO: 2的相应氨基酸)处被取代。
22.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个调节所述松弛素多肽对松弛素受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。
23.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个增加所述松弛素多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
24.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个增加所述松弛素多肽在重组宿主细胞中的表达或所述松弛素多肽的活体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。``
25.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个增加所述松弛素多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
26.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸对不能另外与所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子具有反应性。
27.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基或块基。
28.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
29.根据权利要求28所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
30.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
31.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
32.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
33.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
34.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
35.根据权利要求34所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
36.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
37.根据权利要求36所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
38.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的分子量。
39.根据权利要求38所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
40.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的松弛素多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
41.根据权利要求40所述的松弛素多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
42.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含含有氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
43.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的松弛素多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
44.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的松弛素多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
45.根据权利要求27所述的松弛素多肽，其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键与水溶性聚合物连接。
46.根据权利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物是支化或多臂聚合物。
47.根据权利要求46所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物的每个分支具有介于约IkDa与约IOOkDa之间的分子量。
48.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽为松弛素拮抗剂。
49.根据权利要求48所述的松弛素多肽，其中所述多肽包含一种或多种翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
50.根据权利要求49所述的松弛素多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的组的部分。
51.根据权利要求48所述的松弛素多肽，其中所述多肽阻止所述松弛素受体的活化。
52.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
53.根据权利要求3所述的松弛素多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是经由糖部分与所述多肽连接。
54.一种分离核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID NO: 12或编码SEQ ID ΝΟ:1或2或3的多核苷酸序列杂合的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。
55.根据权利要求54所述的分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的组。
56.一种制备根据权利要求3所述的松弛素多肽的方法，所述方法包括使包含非天然编码氨基酸的分离松弛素多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的组的部分。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、餅基、氣基服基、置氣基或块基。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分通过酰胺键与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的平均分子量。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述(聚乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
66.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的松弛素多肽和药学上可接受的载体。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
68.一种治疗患有由松弛素调节的病症的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求66所述的组合物。
69.—种细胞，其包含根据权利要求54所述的核酸。
70.根据权利要求69所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
71.一种制备包含非天然编码氨基酸的松弛素多肽的方法，所述方法包括在允许所述包含非天然编码氨基酸的松弛素多肽表达的条件下培养包含一种或多种包含选择密码子的编码松弛素多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述松弛素多肽。
72.—种调节松弛素多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包括用一种或多种非天然编码氨基酸取代所述松弛素多肽中的任何一种或多种天然存在氨基酸。
73.一种由具有SEQ ID NO: 12中所示的序列或编码SEQ ID NO: 1、2或3所示的多肽的多核苷酸编码的松弛素多肽，其中所述多核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多肽包含至少一种非天然编码氨基酸。
74.根据权利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸与连接子、聚合物、水溶性聚合物，或生物活性分子连接。
75.根据权利要求74所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
76.根据权利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由在以下位置处的残基组成的组的位置处被取代:位置I (即，在N端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白质的羧基端)及其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2中的相应氨基酸)。
77.根据权利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:SEQ ID NO:1或在SEQIDN0:2或3中的相应氨基酸的残基1、2、5、13、18、29、31、52 及其任何组合。
78.根据权利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:残基2、5、13、18、29、31、52及其任何组合(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2中的相应氨基酸)。
79.根据权利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的组的位置处被取代:残基1、2、5、13、18及其任何组合(SEQ ID N0:1或在SEQ IDN0:2或3中的相应氨基酸)。
80.根据权利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在位置1(SEQIDNO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相应氨基酸)处被取代。
81.根据权利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸在位置2(SEQIDNO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相应氨基酸)处被取代。
82.根据权利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酸餅基、餅基、氣基服基、置氣基或块基。
83.根据权利要求75所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的分子量。
84.根据权利要求75所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
85.根据权利要求84所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约IkDa与约IOOkDa之间的分子量。
86.—种组合物，其包含根据权利要求73所述的松弛素多肽和药学上可接受的载体。
87.一种松弛素多肽，其包含一个或多个增加所述松弛素多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
88.一种松弛素多肽，其包含通过共价键在单一氨基酸处与所述松弛素多肽连接的水溶性聚合物。
89.根据权利要求88所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
90.根据权利要求88所述的松弛素多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸是非天然编码氨基酸。
91.根据权利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸与聚(乙二醇)分子连接。
92.一种松弛素多肽，其包含至少一种连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体掺入到所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。
93.根据权利要求92所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽经单聚乙二醇化。
94.一种松弛素多肽，其包含与一种或多种非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体掺入到所述多肽中的预选位点处。
95.根据权利要求94所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一种所述连接子、聚合物或生物活性分子。
96.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个调节施用所述多肽后患者的血管新生的氨基酸取代、添加或缺失。
97.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个调节所述松弛素多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
98.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一个或多个调节施用所述多肽后患者的血管收缩的氨基酸取代、添加或缺失。
99.根据权利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽也包含天然编码氨基酸取代。
全文摘要
本发明提供了经修饰松弛素多肽及其用途。
文档编号C07K1/107GK103201285SQ201180050176
公开日2013年7月10日 申请日期2011年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者V.克拉伊诺夫, N.克努森, A.赫维特, K.德蒂奥斯, J.平克斯塔夫, L.苏利文 申请人:阿姆布埃克斯股份有限公司